本發(fā)明涉及分子細(xì)胞生物學(xué)，具體涉及一種利用配對(duì)微流控芯片高通量分析單細(xì)胞內(nèi)含物的技術(shù)。

背景技術(shù)：

分析細(xì)胞內(nèi)含物是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是現(xiàn)代醫(yī)療診斷的分析靶標(biāo)。傳統(tǒng)分析細(xì)胞內(nèi)含物的方法對(duì)大量細(xì)胞平均信號(hào)的分析處理使得信號(hào)的平均化模糊了人們對(duì)單細(xì)胞之間異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。目前前沿生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究表明，同一個(gè)體的不同組織之間，同一組織的不同部位之間，以及同一部位的不同細(xì)胞之間都存在異質(zhì)性(heterogeneity)，即使是同一種細(xì)胞的不同個(gè)體之間也可能存在很大的異質(zhì)性，這差異最大的這些細(xì)胞往往能夠揭示重要生物學(xué)現(xiàn)象或者提示癌癥等重大疾病。因此單細(xì)胞的全面分析是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究十分需要的技術(shù)。

對(duì)單細(xì)胞分析來(lái)說(shuō)，其面臨的挑戰(zhàn)主要有三點(diǎn)，首先是快速高效地分離單細(xì)胞，防止單細(xì)胞的丟失；其次是由于單細(xì)胞中所含有的分析靶標(biāo)量太少，如何無(wú)偏放大靶標(biāo)的信號(hào)，減少或者消除放大偏差性，真實(shí)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)含物的表達(dá)水平；再次是提高單細(xì)胞分析的通量，減少重復(fù)操作，提高效率；最后是如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)含物的全面分析，分析各種內(nèi)含物的表達(dá)量以及相互之間的關(guān)聯(lián)。

目前尚無(wú)能夠?qū)⒏咄坎东@單細(xì)胞、無(wú)偏擴(kuò)增微量單細(xì)胞內(nèi)含物、全面分析單細(xì)胞內(nèi)含物集成在一起的公開(kāi)技術(shù)。但已有公開(kāi)報(bào)道利用微流控技術(shù)高通量分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。比如cell文章(macoskoetal.，2015,cell：161，1202-1214；kleinetal.,2015,cell161,1187-1201)報(bào)道的結(jié)合液滴微流控和編碼微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配對(duì)捕獲單細(xì)胞與單微球，單細(xì)胞裂解釋放的mrna被與之配對(duì)的編碼微球捕獲，再經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，將單細(xì)胞mrna信息編碼與放大，通過(guò)高通量測(cè)序與生物信息學(xué)方法分析大量大細(xì)胞mrna的表達(dá)情況。該方法中細(xì)胞與微球的捕獲是基于泊松分布原理，大部分的液滴沒(méi)有細(xì)胞，只有～1％的液滴含有單個(gè)細(xì)胞，再結(jié)合微球的泊松分布，有效分析目標(biāo)進(jìn)一步減少，只能實(shí)現(xiàn)對(duì)大量實(shí)際樣品中少部分細(xì)胞的分析，這樣可能會(huì)忽略掉樣品中一些重要的細(xì)胞個(gè)體。另外該策略只適合分析對(duì)象數(shù)目較多的樣品，對(duì)于一些稀有細(xì)胞(比如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)，由于其樣品中細(xì)胞數(shù)量太少(10-100/ml血液)，無(wú)法用該方法來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分析。這些技術(shù)都僅限于分析單細(xì)胞的mrna，其他單細(xì)胞內(nèi)含物無(wú)法進(jìn)行分析，如基因組、mirna、蛋白組、甲基化dna、代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)體、磷脂等。目前公開(kāi)的技術(shù)中，都沒(méi)有涉及到高通量分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于：利用申請(qǐng)人發(fā)展的配對(duì)微流控芯片，基于流體力學(xué)原理和尺寸效應(yīng)高通量捕獲單細(xì)胞，結(jié)合編碼技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，提供一種高通量分析單細(xì)胞內(nèi)含物的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用配對(duì)微流控芯片高通量分析單細(xì)胞內(nèi)含物的方法，所述方法包括步驟：

首先提供一微流控芯片，該微流控芯片包括捕獲層、控制層、載片三部分；捕獲層包括兩個(gè)并行的流道(10，11)和連接通道(13)，控制層包括隔離通道(12)；其中每個(gè)捕獲通道由多個(gè)捕獲單元(8，9)首尾串接而成，每個(gè)單元包括流道(10，11)、儲(chǔ)液腔室(14，15)、捕獲通道(16，17)三部分，流道(10，11)包括u形管，前一單元u形管的左臂端連接后一單元u形管的右臂端，儲(chǔ)液腔室(14)位于u形的兩臂之間，且設(shè)有三條通道，第一通道直徑大于待捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u形管的液體進(jìn)口端，第二通道為捕獲通道，直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u型管的液體出口端；第三通道為連接通道(13)，直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往并行的另一捕獲單元的儲(chǔ)液腔室；

連接通道(13)連接兩個(gè)捕獲單元的儲(chǔ)液腔室(14，15)；隔離通道(12)層位于連接通道(13)下方或上方，垂直于連接通道(13)并由隔膜(18)隔離開(kāi)；兩個(gè)流道分別含有一個(gè)樣品入口(1，2)、一個(gè)油相入口(4，5)以及一個(gè)出口(6，7)，隔離通道含有一個(gè)入口(3)。

a、在隔離泵入口(3)注滿溶液，增加注射泵壓力，隔離泵(12)形變，隔膜(18)擠壓連接通道最上層，直到連接通道(13)被完全阻斷開(kāi)，從通道入口(1)用注射泵通入細(xì)胞懸浮液，當(dāng)單細(xì)胞進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(10)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(14)，細(xì)胞會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(14)，由于捕獲通道(16)小于細(xì)胞，細(xì)胞被卡在捕獲通道(16)前，同時(shí)堵住捕獲通道(16)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(14)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的細(xì)胞無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(14)，只能通過(guò)流道(10)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元，這樣就實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的捕獲。在后續(xù)的微球/細(xì)胞捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，即可實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞的捕獲。

b、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在微球通道入口(2)用注射泵通入微球懸浮液，與步驟a類似可以在并行的另一個(gè)微球通道中實(shí)現(xiàn)高通量單微球的捕獲。具體過(guò)程如下：從通道入口(2)用注射泵通入微球懸浮液，當(dāng)單個(gè)微球進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(11)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(15)，微球會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(15)，由于捕獲通道(17)小于微球，微球被卡在捕獲通道(17)前，同時(shí)堵住捕獲通道(17)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(15)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的微球無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(15)，只能通過(guò)流道(11)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元。在后續(xù)的微球捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，即可實(shí)現(xiàn)該流道內(nèi)高通量單微球的捕獲。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)單微球/細(xì)胞的高通量配對(duì)捕獲。

c、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，分別細(xì)胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入清洗溶液，洗去通道中殘余的細(xì)胞和微球。

d、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，細(xì)胞通道入口(1)繼續(xù)通入清洗溶液或者反應(yīng)溶液a，在微球通道入口(2)通入細(xì)胞裂解液或者反應(yīng)溶液b，將微球通道和捕獲腔室的清洗溶液替換為相應(yīng)的反應(yīng)溶液。

e、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，將細(xì)胞入口(1)打開(kāi)，關(guān)閉出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，當(dāng)油相進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，由于捕獲通道(16)遠(yuǎn)小于流道(10)，其毛細(xì)阻力較大，因此油相進(jìn)入流道(10)而不進(jìn)入捕獲通道(16)并將溶液從捕獲腔室(14)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單細(xì)胞，從而將單個(gè)細(xì)胞隔離在儲(chǔ)液腔室中。當(dāng)油相流通完整個(gè)芯片時(shí)，所有的單細(xì)胞均被隔離在單個(gè)油包水液滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元，且相鄰的液滴被油相隔開(kāi)，不會(huì)相會(huì)干擾。

f、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在e步驟進(jìn)行的同時(shí)，將微球入口(2)打開(kāi)，關(guān)閉出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相，當(dāng)油相進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，由于捕獲通道(17)遠(yuǎn)小于流道(11)，其毛細(xì)阻力較大，因此油相進(jìn)入流道(11)而不進(jìn)入捕獲通道(17)并將溶液從捕獲腔室(15)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單微球，這樣就實(shí)現(xiàn)了在并行的捕獲通道中的單微球隔離在單個(gè)油包水液滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元，且相鄰的液滴被油相隔開(kāi)，不會(huì)相會(huì)干擾。

g、關(guān)閉隔離泵(12)，此時(shí)連接通道(13)被打開(kāi)，此時(shí)并行通道中包裹微球/細(xì)胞的配對(duì)液滴聯(lián)通，由于擴(kuò)散作用，微球儲(chǔ)液腔室(15)里面的細(xì)胞裂解液或者反應(yīng)溶液b擴(kuò)散到細(xì)胞儲(chǔ)液腔室(14)將細(xì)胞裂解，釋放單細(xì)胞中的內(nèi)含物，且內(nèi)含物也可以通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入微球捕獲腔室，與反應(yīng)溶液a和微球一起充分接觸后被捕獲或者反應(yīng)，單細(xì)胞中的內(nèi)含物反應(yīng)后可以被微球全部捕獲，完成所有單微球?qū)εc其配對(duì)的單細(xì)胞的內(nèi)含物的單獨(dú)捕獲。

h、打開(kāi)細(xì)胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再?gòu)膬蓚€(gè)通道入口(1，2)分別通入洗滌溶液，將未被捕獲的其他物質(zhì)洗去；將捕獲層與控制層剝離開(kāi)，回收捕獲通道中的微球，然后再次用洗滌溶液清洗微球，進(jìn)一步除去溶液中未結(jié)合的其他物質(zhì)。

i、配制連接酶反應(yīng)溶液，將微球分散在酶反應(yīng)溶液中，將微球上的編碼信息與所捕獲的內(nèi)含物通過(guò)酶反應(yīng)連接在一起形成編碼內(nèi)含物信息，用洗滌溶液對(duì)清洗完成酶反應(yīng)的微球進(jìn)行洗滌。

j、外切酶切割：配制核酸外切酶i反應(yīng)溶液，將經(jīng)過(guò)酶反應(yīng)的微球分散在核酸外切酶i反應(yīng)溶液中反應(yīng)，切割去掉多余的單鏈編碼引物，保留編碼內(nèi)含物信息，然后用洗滌溶液洗滌微球，將微球分散在緩沖溶液中。

k、建庫(kù)測(cè)序：配制pcr反應(yīng)溶液，將微球分散在pcr反應(yīng)溶液中對(duì)編碼內(nèi)含物信息進(jìn)行pcr擴(kuò)增，微球上的編碼內(nèi)含物信息被擴(kuò)增到溶液中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并定量；用純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dna文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序。

l、生物信息學(xué)分析：分析得到的高通量測(cè)序結(jié)果，根據(jù)編碼分析物信息對(duì)單細(xì)胞中的內(nèi)含物進(jìn)行定量分析，繪制針對(duì)內(nèi)含物的單細(xì)胞分子生物學(xué)圖譜。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，可分析的對(duì)象為單細(xì)胞的內(nèi)含物，包括轉(zhuǎn)錄組、基因組、mirna、蛋白組、甲基化dna、代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)體、磷脂的至少一種。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，分析的對(duì)象可以是這些內(nèi)含物的一類或者幾類。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，能夠分析的數(shù)量根據(jù)實(shí)際情況而定，可以是1個(gè)，10個(gè)，100個(gè)，1000個(gè)，10000個(gè)，100000個(gè)。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用微球?yàn)榫幋a微球，微球上的編碼信息由通用引物、細(xì)胞編碼、分子編碼、捕獲探針?biāo)牟糠纸M成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用來(lái)擴(kuò)增編碼內(nèi)含物；單個(gè)微球上的細(xì)胞編碼含相同的核酸序列、不同微球上的細(xì)胞編碼序列不同，用來(lái)對(duì)編碼不同的單細(xì)胞內(nèi)含物；微球上的分子編碼為隨機(jī)序列、各不相同，用來(lái)對(duì)內(nèi)含物進(jìn)行定量分析；捕獲探針含相同的核酸序列，用來(lái)捕獲內(nèi)含物。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟d通入的反應(yīng)溶液a可以為pbs、帶dna標(biāo)簽的抗體混合溶液、基因組擴(kuò)增溶液、dna轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)溶液、dna片段化溶液或rna片段化溶液等。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟g中編碼微球?qū)?nèi)含物的捕獲方式為捕獲探針與目標(biāo)內(nèi)含物互補(bǔ)雜交，或者與目標(biāo)內(nèi)含物上結(jié)合的dna/rna標(biāo)簽雜交。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟d通入的反應(yīng)溶液b可以為pbs、細(xì)胞裂解液等。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟i中的酶反應(yīng)溶液為逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溶液、連接酶反應(yīng)溶液、聚合酶反應(yīng)溶液、基因組酶擴(kuò)增反應(yīng)溶液等。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟l中，利用細(xì)胞編碼信息區(qū)別內(nèi)含物所屬的細(xì)胞個(gè)體，根據(jù)內(nèi)含物的種類和分子編碼的數(shù)量對(duì)目標(biāo)內(nèi)含物定量分析，從而繪制單細(xì)胞內(nèi)含物生物學(xué)表達(dá)圖譜。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所使用的微流控芯片可以為芯片中的任意結(jié)構(gòu)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1.本發(fā)明采用微流控技術(shù)，具有高通量、易集成、易自動(dòng)化優(yōu)點(diǎn)，單微球/細(xì)胞占有率高，在有限微球/細(xì)胞數(shù)目的條件下可以使得絕大多數(shù)捕獲單元捕獲有單微球/細(xì)胞，能夠根據(jù)芯片捕獲單元的數(shù)目控制單微球/細(xì)胞捕獲數(shù)目，目標(biāo)分析數(shù)目范圍廣，從幾個(gè)到幾十萬(wàn)個(gè)不等。

2.本發(fā)明微球、細(xì)胞的捕獲是基于微球/細(xì)胞尺寸和流體動(dòng)力學(xué)原理，在完成單個(gè)微球/細(xì)胞的捕獲后，后續(xù)的微球/細(xì)胞不會(huì)再次被同一個(gè)捕獲單元捕獲，只能進(jìn)入后續(xù)的捕獲單元，因此該芯片單微球/細(xì)胞捕獲效率高、配對(duì)效率高，尤其適合單細(xì)胞分析。另外單微球/細(xì)胞配對(duì)效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)所有捕獲的靶標(biāo)進(jìn)行分析，有效性較高。在微球/細(xì)胞數(shù)量較少的時(shí)候，也可以實(shí)現(xiàn)高效率的捕獲，微球/細(xì)胞損失很少，特別適用于稀有樣品的分析，比如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)、干細(xì)胞等稀有細(xì)胞的分析。

3.本發(fā)明引入編碼技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記以及校正擴(kuò)增的偏差，提高對(duì)單細(xì)胞內(nèi)含物分析的通量以及準(zhǔn)確性。同時(shí)編碼技術(shù)的引入，可以實(shí)現(xiàn)一次測(cè)序獲得成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的信息，降低了測(cè)序成本。通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)含物的核酸編碼，將細(xì)胞內(nèi)含物的信息轉(zhuǎn)化為dna序列信息，不僅可以分析轉(zhuǎn)錄組、基因組等基因信息，也可以應(yīng)用于蛋白組、甲基化dna、代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)體、磷脂等一類或者幾類，大大拓展了分析靶標(biāo)的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1芯片整體結(jié)構(gòu)俯視圖，其中1、2是微球/細(xì)胞入口，3是隔離泵入口，4、5是微球/細(xì)胞通道油相入口，6、7是微球/細(xì)胞出口。

圖2芯片放大結(jié)構(gòu)示意圖，其中8、9是微球/細(xì)胞捕獲單元，10、11是微球/細(xì)胞流路通道，12是隔離泵通道，13是連接通道。

圖3微球/細(xì)胞配對(duì)捕獲單元俯視圖，其中10、11是微球/細(xì)胞流路通道，12是隔離泵通道，13是連接通道，14、15是微球/細(xì)胞捕獲單元儲(chǔ)液腔室，16、17是微球/細(xì)胞捕獲通道。

圖4微球/細(xì)胞配對(duì)捕獲單元截面圖，其中13是連接通道，14、15是微球/細(xì)胞儲(chǔ)液腔室，12是隔離泵通道，18是間隔薄膜。

圖5高通量單細(xì)胞mrna分析編碼微球結(jié)構(gòu)示意圖，編碼微球由由通用引物、細(xì)胞編碼、分子編碼、polyt四部分組成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用來(lái)擴(kuò)增編碼內(nèi)含物；單個(gè)微球上的細(xì)胞編碼含相同的核酸序列、不同微球上的細(xì)胞編碼序列不同，用來(lái)對(duì)編碼不同的單細(xì)胞mrna；微球上的分子編碼為隨機(jī)序列、各不相同，用來(lái)校正擴(kuò)增偏差，對(duì)mrna進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析；polyt是用來(lái)捕獲帶有polya尾巴的mrna。

圖6高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析流程圖

圖7高通量單細(xì)胞基因組分析編碼微球結(jié)構(gòu)示意圖，編碼微球由由通用引物、細(xì)胞編碼、分子編碼、捕獲探針?biāo)牟糠纸M成。其中所有微球上的通用引物含有相同的核酸序列，用來(lái)擴(kuò)增編碼內(nèi)含物；單個(gè)微球上的細(xì)胞編碼含相同的核酸序列、不同微球上的細(xì)胞編碼序列不同，用來(lái)對(duì)編碼不同的單細(xì)胞基因組；微球上的分子編碼為隨機(jī)序列、各不相同，用來(lái)校正擴(kuò)增偏差；捕獲探針含有相同的核酸序列，用來(lái)捕獲片段化的基因組。

圖8高通量單細(xì)胞基因組分析流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

如圖1至圖3所示，本發(fā)明用于高通量配對(duì)捕獲單微球和單細(xì)胞，該芯片由標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)加工，包括捕獲層、控制層、載片三部分。捕獲層由細(xì)胞流道(10)、微球流道(11)、連接通道(13)三部分組成，控制層由隔離通道(12)組成。其中細(xì)胞流道含有多個(gè)串聯(lián)的細(xì)胞捕獲單元(8)，每個(gè)單元由流道(10)、儲(chǔ)液腔室(14)、捕獲通道(16)三部分組成；參見(jiàn)圖3，流道(10)包括u形管，前一單元的u形管的左臂端連接后一單元的u形管的右臂端，u形管之間的連接部分為直管，儲(chǔ)液腔室(14)位于u形的兩臂之間，且設(shè)有三條通道，第一通道直徑大于待捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u形管右臂，第二通道(捕獲通道16)直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u型管的左臂；第三通道為連接通道13，直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往微球捕獲單元儲(chǔ)液腔室(15)。

微球流道含有多個(gè)串聯(lián)的微球捕獲單元(9)，微球捕獲單元(9)和細(xì)胞捕獲單元對(duì)稱設(shè)置，每個(gè)單元由流道(11)、儲(chǔ)液腔室(15)、捕獲通道(17)三部分；參見(jiàn)圖3，流道(11)包括u形管，前一單元的u形管的左臂端連接后一單元u形管的右臂端，u形管之間的連接部分為直管，儲(chǔ)液腔室(15)位于u形的兩臂之間，且設(shè)有三條通道，第一通道直徑大于待捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u形管右臂，第二通道(捕獲通道17)直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往u型管的左臂；第三通道為連接通道13，直徑小于捕獲的單微球/單細(xì)胞，通往細(xì)胞捕獲單元的儲(chǔ)液腔室(14)。

控制層內(nèi)設(shè)有隔離通道(12)；隔離通道(12)位于連接通道13下方，垂直于連接通道(13)，并由隔膜18隔開(kāi)；隔離通道(12)連接一隔離泵，通過(guò)改變隔離通道(12)的壓力阻斷或連通連接通道(參見(jiàn)圖4)；細(xì)胞流道含有一個(gè)細(xì)胞入口(1)和油相入口(4)以及一個(gè)出口(7)，微球流道含有一個(gè)微球入口(2)和油相入口(5)以及一個(gè)出口(6)，隔離通道12只含有一個(gè)入口(3)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的細(xì)胞流道寬度為60μm，儲(chǔ)液腔室直徑為100μm，細(xì)胞捕獲通道寬度為6μm，通道深度為46μm，細(xì)胞捕獲單元為720個(gè)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的細(xì)胞為a549細(xì)胞，細(xì)胞直徑為10-20μm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的微球流道寬度為60μm，儲(chǔ)液腔室直徑為100μm，微球捕獲通道寬度為15μm，通道深度為46μm，微球捕獲單元為720個(gè)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的聚苯乙烯微球，直徑為40μm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的聚苯乙烯微球上含有mrna捕獲序列t30，t30可以與帶有polya尾巴的mrna雜交。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，控制層中所述的隔離通道寬度為30μm，高度為30μm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的所有入口均為圓柱形孔，直徑為1.00mm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的捕獲層和控制層的材料均為聚二甲基硅氧烷pdms。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的載片的材料為玻璃。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，隔離通道充滿水溶液，通過(guò)控制注射泵的驅(qū)動(dòng)的壓力，控制隔離泵壓力。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的細(xì)胞流速為0.04ml/h。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的微球流速為0.2ml/h。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所選用的油相流速為0.1ml/h。

實(shí)施例2

高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

a、單細(xì)胞捕獲：在隔離泵入口(3)注滿溶液，增加注射泵壓力，隔離泵(12)形變，隔膜(18)擠壓連接通道最上層，直到連接通道(13)被完全阻斷開(kāi)，從通道入口(1)用注射泵通入細(xì)胞a549懸浮液，當(dāng)單細(xì)胞進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(10)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(14)，細(xì)胞會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(14)，由于捕獲通道(16)小于細(xì)胞，細(xì)胞被卡在捕獲通道(16)前，同時(shí)堵住捕獲通道(16)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(14)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的細(xì)胞無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(14)，只能通過(guò)流道(10)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元，完成了單個(gè)a549細(xì)胞的捕獲。在后續(xù)的細(xì)胞捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，完成高通量單細(xì)胞的捕獲。

b、單編碼微球捕獲：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在微球通道入口(2)用注射泵通入mrna編碼微球懸浮液(結(jié)構(gòu)如圖5所示)，與步驟a類似可以在并行的微球通道中實(shí)現(xiàn)高通量單mrna編碼微球的捕獲。具體過(guò)程如下：從通道入口(2)用注射泵通入mrna編碼微球懸浮液，當(dāng)單個(gè)微球進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(11)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(15)，微球會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(15)，由于捕獲通道(17)小于微球，微球被卡在捕獲通道(17)前，同時(shí)堵住捕獲通道(17)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(15)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的微球無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(15)，只能通過(guò)流道(11)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元，完成單個(gè)mrna編碼微球的捕獲。在后續(xù)的微球捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，完成高通量單mrna編碼微球的捕獲。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了單mrna編碼微球/細(xì)胞的高通量配對(duì)捕獲。

c、清洗：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，分別細(xì)胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入pbs溶液，洗去通道中殘余的細(xì)胞和微球。

d、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，細(xì)胞通道入口(1)繼續(xù)通入pbs溶液，在微球通道入口(2)通入細(xì)胞裂解液(0.2％tritonx-100)，將微球通道溶液替換為細(xì)胞裂解液。

e、單細(xì)胞隔離：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，將細(xì)胞入口(1)打開(kāi)，關(guān)閉出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相fc40，當(dāng)fc40進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，由于捕獲通道(16)遠(yuǎn)小于流道(10)，其毛細(xì)阻力較大，因此fc40進(jìn)入流道(10)而不進(jìn)入捕獲通道(16)并將溶液從捕獲腔室(14)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單細(xì)胞，從而將單個(gè)細(xì)胞隔離在儲(chǔ)液腔室中。當(dāng)油相流通完整個(gè)芯片時(shí)，所有的單個(gè)a549細(xì)胞均被隔離在單個(gè)油包水液滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。

f、單微球隔離：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在e步驟進(jìn)行的同時(shí)，將微球入口(2)打開(kāi)，關(guān)閉出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相fc40，當(dāng)fc40進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，由于捕獲通道(17)遠(yuǎn)小于流道(11)，其毛細(xì)阻力較大，因此fc40進(jìn)入流道(11)而不進(jìn)入捕獲通道(17)并將溶液從捕獲腔室(15)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單微球，這樣就實(shí)現(xiàn)了在并行的捕獲通道中的單微球隔離在單個(gè)油包水液滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元，每個(gè)液滴中含有單微球以及細(xì)胞裂解液。

g、單細(xì)胞平行裂解：關(guān)閉隔離泵(12)，此時(shí)連接通道(13)被打開(kāi)，此時(shí)并行通道中包裹編碼微球/細(xì)胞的配對(duì)液滴聯(lián)通，由于擴(kuò)散作用，微球儲(chǔ)液腔室(15)里面的細(xì)胞裂解液擴(kuò)散到細(xì)胞儲(chǔ)液腔室(14)進(jìn)行細(xì)胞裂解，釋放單細(xì)胞中的mrna，且mrna也可以通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入與之配對(duì)的微球捕獲腔室，被mrna編碼微球上的捕獲序列捕獲，配對(duì)微球/細(xì)胞之間進(jìn)行獨(dú)立的mrna捕獲，無(wú)交叉污染。

h、編碼微球回收：打開(kāi)細(xì)胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再?gòu)膬蓚€(gè)通道入口(1，2)分別通入洗滌溶液pbs，將細(xì)胞裂解液洗去；將捕獲層與控制層剝離開(kāi)，取50μlpbs滴加在芯片表面來(lái)回吸打回收捕獲通道中的微球，重復(fù)3次。合并回收溶液然后再次用pbs清洗微球，進(jìn)一步除去溶液中殘留的其他物質(zhì)。

i、逆轉(zhuǎn)錄：配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液，逆轉(zhuǎn)錄溶液的配方如下表。將微球分散在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液中，在旋轉(zhuǎn)混勻器上室溫反應(yīng)30分鐘，再置于42℃烘箱中旋轉(zhuǎn)孵育90分鐘，然后用pbs清洗微球，將微球保存在10mmtris緩沖溶液中(ph8.0)。此時(shí)微球上的mrna被逆轉(zhuǎn)錄為cdna，每條cdna上附有對(duì)應(yīng)微球的編碼信息。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液配方

編碼微球序列

j、外切酶切割：配制核酸外切酶i反應(yīng)溶液，配方如下表所示。將微球分散在核酸外切酶i反應(yīng)溶液中反應(yīng)，切割去掉多余的單鏈編碼引物，保留編碼cdna，然后用pbs洗滌微球，將微球分散在10mmtris緩沖溶液中(ph8.0)保存。

核酸外切酶i配方

k、pcr擴(kuò)增：配制pcr反應(yīng)溶液，pcr反應(yīng)溶液配方以及條件如下表所示。將微球分散在pcr反應(yīng)溶液中對(duì)編碼cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，微球上的編碼cdna信息被擴(kuò)增到溶液中。

pcr反應(yīng)溶液配方

pcr反應(yīng)條件

l、dna文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序：采用常規(guī)dna文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)進(jìn)行dna文庫(kù)構(gòu)建，質(zhì)檢合格后，采用illuminahiseqxten測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。

m、生物信息分析：對(duì)編碼cdna進(jìn)行高通量測(cè)序，共20gb數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中首先通過(guò)細(xì)胞編碼將不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息區(qū)別開(kāi)，在根據(jù)每個(gè)細(xì)胞中分子編碼以及基因信息分析單細(xì)胞mrna的表達(dá)量，繪制單細(xì)胞mrna表達(dá)圖譜，并進(jìn)行單細(xì)胞mrna的可變剪切分析、新轉(zhuǎn)錄本/lncrna預(yù)測(cè)、變異分析等，研究人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞a549演變過(guò)程中基因表達(dá)水平的變化、關(guān)鍵基因的變異以及變異率，加深對(duì)細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄過(guò)程的本質(zhì)以及基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識(shí)，解釋更多的諸如遺傳性疾病的成因、癌癥惡化的機(jī)制等，為個(gè)性化醫(yī)療、精準(zhǔn)醫(yī)療等提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，完善的腫瘤診療體系，進(jìn)而從個(gè)體水平實(shí)現(xiàn)有效的靶向治療。

實(shí)施例3：?jiǎn)渭?xì)胞基因組分析

高通量單細(xì)胞基因組分析

a、單細(xì)胞捕獲：在隔離泵入口(3)注滿溶液，增加注射泵壓力，隔離泵(12)形變，隔膜(18)擠壓連接通道最上層，直到連接通道(13)被完全阻斷開(kāi)，從通道入口(1)用注射泵通入細(xì)胞a549懸浮液，當(dāng)單細(xì)胞進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(10)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(14)，細(xì)胞會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(14)，由于捕獲通道(16)小于細(xì)胞，細(xì)胞被卡在捕獲通道(16)前，同時(shí)堵住捕獲通道(16)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(14)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的細(xì)胞無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(14)，只能通過(guò)流道(10)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元，完成了單個(gè)a549細(xì)胞的捕獲。在后續(xù)的細(xì)胞捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，完成高通量單細(xì)胞的捕獲。

b、單編碼微球捕獲：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在微球通道入口(2)用注射泵通入基因組編碼微球懸浮液(結(jié)構(gòu)如圖7所示)，與步驟a類似可以在并行的微球通道中實(shí)現(xiàn)高通量單基因組編碼微球的捕獲。具體過(guò)程如下：從通道入口(2)用注射泵通入基因組編碼微球懸浮液，當(dāng)單個(gè)微球進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，因?yàn)榱黧w從流道(11)經(jīng)過(guò)的路徑大于從儲(chǔ)液腔室(15)，微球會(huì)先進(jìn)入儲(chǔ)液腔室(15)，由于捕獲通道(17)小于微球，微球被卡在捕獲通道(17)前，同時(shí)堵住捕獲通道(17)，流經(jīng)儲(chǔ)液腔室(15)的流體流速趨近于零，此時(shí)后續(xù)的微球無(wú)法再次進(jìn)入該儲(chǔ)液腔室(15)，只能通過(guò)流道(11)進(jìn)入下一個(gè)捕獲單元，完成單個(gè)基因組編碼微球的捕獲。在后續(xù)的微球捕獲單元中重復(fù)該過(guò)程，完成高通量單基因組編碼微球的捕獲。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了單基因組編碼微球/細(xì)胞的高通量配對(duì)捕獲。

c、清洗：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，分別細(xì)胞通道入口(1)和微球通道入口(2)通入pbs溶液，洗去通道中殘余的細(xì)胞和微球。

d、保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，細(xì)胞通道入口(1)繼續(xù)通入dna片段化溶液，在微球通道入口(2)通入細(xì)胞裂解液(0.2％tritonx-100)，將細(xì)胞通道溶液置換為dna片段化溶液，采用nextera試劑盒(nexteradnalibrarypreparationkit,illumina)，微球通道溶液置換為細(xì)胞裂解液。

dna片段化溶液配方

e、單細(xì)胞隔離：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，將細(xì)胞入口(1)打開(kāi)，關(guān)閉出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相fc40，當(dāng)fc40進(jìn)入捕獲單元(8)時(shí)，由于捕獲通道(16)遠(yuǎn)小于流道(10)，其毛細(xì)阻力較大，因此fc40進(jìn)入流道(10)而不進(jìn)入捕獲通道(16)并將溶液從捕獲腔室(14)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單細(xì)胞，從而將單個(gè)細(xì)胞隔離在儲(chǔ)液腔室中。當(dāng)油相流通完整個(gè)芯片時(shí)，所有的單個(gè)a549細(xì)胞均被隔離在單個(gè)油包水液滴中，每個(gè)液滴中含有單個(gè)的a549細(xì)胞以及dna片段化溶液，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。

f、單微球隔離：保持連接通道(13)關(guān)閉狀態(tài)，在e步驟進(jìn)行的同時(shí)，將微球入口(2)打開(kāi)，關(guān)閉出口(6)，在入口(5)用注射泵通入油相fc40，當(dāng)fc40進(jìn)入捕獲單元(9)時(shí)，由于捕獲通道(17)遠(yuǎn)小于流道(11)，其毛細(xì)阻力較大，因此fc40進(jìn)入流道(11)而不進(jìn)入捕獲通道(17)并將溶液從捕獲腔室(15)入口處切斷，此時(shí)儲(chǔ)液腔室的溶液被保留，形成一個(gè)油包水的液滴，液滴中含有單微球，這樣就實(shí)現(xiàn)了在并行的捕獲通道中的單微球隔離在單個(gè)油包水液滴中，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元，每個(gè)液滴中含有單微球以及細(xì)胞裂解液。

g、單細(xì)胞平行裂解：關(guān)閉隔離泵(12)，此時(shí)連接通道(13)被打開(kāi)，此時(shí)并行通道中包裹編碼微球/細(xì)胞的配對(duì)液滴聯(lián)通，由于擴(kuò)散作用，微球儲(chǔ)液腔室(15)里面的細(xì)胞裂解液擴(kuò)散到細(xì)胞儲(chǔ)液腔室(14)進(jìn)行細(xì)胞裂解，釋放單細(xì)胞中的基因組，且釋放出的基因組與細(xì)胞捕獲腔體中的dna片段化溶液反應(yīng)，基因組被轉(zhuǎn)座酶tn5打斷成350bp左右的片段，每個(gè)片段附帶一段固定的單鏈dna序列，編碼微球上的捕獲序列與固定單鏈dna序列互補(bǔ)雜交，這樣單細(xì)胞中被片段化的基因組被與之配對(duì)的編碼微球捕獲，且配對(duì)微球/細(xì)胞之間進(jìn)行獨(dú)立的基因組捕獲，無(wú)交叉污染。

h、編碼微球回收：打開(kāi)細(xì)胞通道出口(7)和微球通道出口(6)，再?gòu)膬蓚€(gè)通道入口(1，2)分別通入洗滌溶液pbs，將細(xì)胞裂解液洗去；將捕獲層與控制層剝離開(kāi)，取50μlpbs滴加在芯片表面來(lái)回吸打回收捕獲通道中的微球，重復(fù)3次。合并回收溶液然后再次用pbs清洗微球，進(jìn)一步除去溶液中殘留的其他物質(zhì)。

i、基因組片段編碼延伸：配制延伸反應(yīng)溶液，延伸溶液的配方如下表。將微球分散在反應(yīng)溶液中，在旋轉(zhuǎn)混勻器上室溫反應(yīng)10分鐘，再置于65℃烘箱中旋轉(zhuǎn)孵育90分鐘，然后用pbs清洗微球，將微球保存在10mmtris緩沖溶液中(ph8.0)。此時(shí)微球上的編碼引物以捕獲的基因組片段為模板進(jìn)行延伸，將每個(gè)單細(xì)胞基因組片段上結(jié)合上編碼信息。單個(gè)細(xì)胞的基因組片段附有對(duì)應(yīng)微球的編碼信息。

延伸反應(yīng)溶液配方

基因組編碼微球序列

k、pcr擴(kuò)增：配制pcr反應(yīng)溶液1，pcr反應(yīng)溶液配方1以及條件1如下表所示。將微球分散在pcr反應(yīng)溶液1中對(duì)編碼基因組片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增，微球上的編碼基因組片段信息被擴(kuò)增到溶液中。配制pcr反應(yīng)溶液2，pcr反應(yīng)溶液配方2以及條件2如下表所示，將pcr反應(yīng)溶液1作為pcr反應(yīng)2的模板進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。

pcr反應(yīng)溶液配方1

pcr反應(yīng)條件1

pcr反應(yīng)溶液配方2

pcr反應(yīng)條件2

l、dna文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序：采用常規(guī)dna文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)進(jìn)行dna文庫(kù)構(gòu)建，質(zhì)檢合格后，采用illuminahiseqxten測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。

m、生物信息分析：對(duì)編碼基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，共110gb數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)細(xì)胞編碼將不同細(xì)胞的基因組信息分類，針對(duì)每個(gè)單細(xì)胞的測(cè)序信息比對(duì)ncbi人參考序列，分析每個(gè)單細(xì)胞的平均測(cè)序深度，分析每個(gè)單細(xì)胞基因組的遺傳變異信息，如dna拷貝數(shù)變異(cnv)、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(snp)、少數(shù)堿基的插入和確實(shí)(indel)、結(jié)構(gòu)變異(sv)等。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明白，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明選用組分的等效替換、具體方式的選擇等，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

<110>廈門(mén)大學(xué)

<120>一種利用配對(duì)微流控芯片高通量分析單細(xì)胞內(nèi)含物的方法

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