本發(fā)明涉及生物技術(shù)診斷領(lǐng)域，特別是涉及一種診斷骨性關(guān)節(jié)炎的mirna分子標(biāo)志物及一種骨性關(guān)節(jié)炎檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，oa)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)病變，本病發(fā)病率隨年齡的增長而增加，是一種中老年人常見的關(guān)節(jié)疾病。oa的發(fā)病因素眾多，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中oa特征性的表現(xiàn)是軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成不足、關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅形成和滑膜病變。雖然目前有很多學(xué)說通過解釋oa的形成機(jī)理，建立了一些診斷和治療oa的方法，但這些診斷oa的手段主要還是以影像學(xué)檢查為基礎(chǔ)。目前在臨床影像學(xué)輔助檢查(x線、mri及超聲等)確診oa時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨已經(jīng)出現(xiàn)了不可逆性損傷,這就使得臨床在對oa進(jìn)行早期干預(yù)或治療時(shí)沒有一種良好的改變或延緩病情的治療措施。如何早期診斷oa成為延緩及控制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的關(guān)鍵。mirna是廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子rna，其不編碼蛋白質(zhì)，但可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，影響蛋白質(zhì)的翻譯，參與機(jī)體各種重要的生理和病理過程。隨著科學(xué)界對mirna在調(diào)控細(xì)胞功能方面的研究日漸加深以及新的mirna作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究證實(shí)，mirna可在多方面調(diào)控oa軟骨相關(guān)基因的表達(dá)。其中，mir-140是在正常軟骨中特異性表達(dá)的少數(shù)幾個(gè)mirna之一，敲除小鼠體內(nèi)的mir-140基因后，小鼠表現(xiàn)出與oa類似的病理過程，表現(xiàn)出軟骨蛋白多糖的減少和關(guān)節(jié)軟骨的纖維化。關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)來源于滑液的滲透，關(guān)節(jié)軟骨與關(guān)節(jié)滑液之間存在一定的物質(zhì)交換；與血液和尿液相比，關(guān)節(jié)液成分及量的變化更能反映關(guān)節(jié)內(nèi)組織病變的發(fā)生和發(fā)展。因此，找尋一種mirna分子標(biāo)志物，通過檢測關(guān)節(jié)液中的該分子標(biāo)志物的表達(dá)量來診斷oa的嚴(yán)重程度，可為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療提供重要依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于此，本發(fā)明提供了一種診斷骨性關(guān)節(jié)炎的mirna分子標(biāo)志物，通過檢測該分子標(biāo)志物在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)量，可獲知骨關(guān)節(jié)炎病程的進(jìn)展，從而為骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷和治療提供依據(jù)。具體地，第一方面，本發(fā)明提供了一種診斷骨性關(guān)節(jié)炎的mirna分子標(biāo)志物，所述mirna分子標(biāo)志物包括mirna140-3p。所述mirna140-3p的序列為：uaccacaggguagaaccacgg。本發(fā)明第一方面提供的mirna分子標(biāo)志物為骨關(guān)節(jié)炎的診斷提供了新的生物標(biāo)志物，通過檢測關(guān)節(jié)液中mirna140-3p的表達(dá)量，可初步判斷骨關(guān)節(jié)液的嚴(yán)重程度，靈敏度和特異性高。通過采用本發(fā)明的mirna分子標(biāo)志物進(jìn)行骨性關(guān)節(jié)炎的診斷，具體具有如下優(yōu)勢：(一)無創(chuàng)：對病人的損傷較小，能夠克服創(chuàng)傷性檢測帶來的風(fēng)險(xiǎn)；(二)穩(wěn)定：在臨床血清、血漿、關(guān)節(jié)液樣本中，microrna以抵抗rna酶的形式穩(wěn)定存在；(三)早期：microrna在疾病早期階段就已經(jīng)表現(xiàn)出異常，因此可以用于高危人群的預(yù)警或者早期檢測；(四)簡便：采用qpcr進(jìn)行檢測，操作簡單、靈敏度高、樣本需求量少，檢測周期短，僅需數(shù)小時(shí)便可獲取結(jié)果，價(jià)格低廉。相應(yīng)地，本發(fā)明第二方面提供了一種骨性關(guān)節(jié)炎檢測試劑盒，包括：(1)mirna分子標(biāo)志物，所述mirna分子標(biāo)志物包括mirna140-3p；(2)提取rna試劑：trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、乙醇、depch2o；(3)逆轉(zhuǎn)錄試劑：5×buffer、10mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶、rnaseinhibitor(rnase抑制劑)、microrna140-3p逆轉(zhuǎn)錄引物、內(nèi)參u6逆轉(zhuǎn)錄引物、depch2o；(4)熒光定量pcr試劑：sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特異性前向引物、microrna140-3p特異性后向通用引物、內(nèi)參u6擴(kuò)增引物、depch2o。其中，所述microrna140-3p特異性前向引物(forwardprimer)的基因序列為5’-acactccagctgggaggcggggcgccgcggga-3’。所述microrna140-3p特異性后向引物(reverseprimer)的基因序列為5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。所述內(nèi)參u6逆轉(zhuǎn)錄引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列為：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，所述下游引物的基因序列為：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。本發(fā)明通過在mirna的3’端加上一特異性的莖環(huán)引物，通過逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量pcr的方法檢測被檢膝骨關(guān)節(jié)液樣本中microrna-3p的表達(dá)量，并與正常人microrna-3p的水平相比較來診斷oa，其靈敏度和特異性高。本發(fā)明第二方面提供的骨性關(guān)節(jié)炎檢測試劑盒，用于診斷骨關(guān)節(jié)炎的特異性和靈敏度高，可從分子標(biāo)志物mirna140-3p的表達(dá)量初步判斷骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將會(huì)在下面的說明書中部分闡明，一部分根據(jù)說明書是顯而易見的，或者可以通過本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施而獲知。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例中mir-140-3p擴(kuò)增曲線圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例中mir-140-3p在各試驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)液中的相對表達(dá)量；圖3為本發(fā)明實(shí)施例中各研究對象年齡與其mir-140-3p相對表達(dá)量散點(diǎn)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明上述技術(shù)方案的實(shí)施例進(jìn)行具體說明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種骨性關(guān)節(jié)炎檢測試劑盒，包括：(1)mirna分子標(biāo)志物，所述mirna分子標(biāo)志物包括mirna140-3p；(2)提取rna試劑：trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇、depch2o；depc水是指經(jīng)depc(焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的純水；(3)逆轉(zhuǎn)錄試劑：5×buffer、10mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶、rnaseinhibitor、microrna140-3p逆轉(zhuǎn)錄引物、內(nèi)參u6逆轉(zhuǎn)錄引物、depch2o；(4)熒光定量pcr試劑：sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特異性前向引物、microrna140-3p特異性后向引物、內(nèi)參u6擴(kuò)增引物、depch2o。本發(fā)明實(shí)施例收集到10例健康志愿者、10例痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者、10例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者、45例膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液作為研究對象進(jìn)行檢測，其中骨關(guān)節(jié)炎早期、中期、晚期各15例。經(jīng)患者或健康志愿者知情同意后，經(jīng)關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液置于無菌、無酶的凍存管，保存于液氮中。采用本發(fā)明實(shí)施例的檢測試劑盒對上述受試者進(jìn)行骨性關(guān)節(jié)炎診斷的具體操作為：(1)總rna抽提：本發(fā)明實(shí)施例采用trizol一步法提取總rna，具體方法如下：取300μl關(guān)節(jié)液，加入4倍體積trizol溶液，再加入200μl氯仿，強(qiáng)烈振蕩20s后靜置3min；使用珠海黑馬tgl-16r高速冷凍離心機(jī)10000×g離心15min；小心將上層水層移至另一個(gè)新的無rnase的ep管(離心管)中；加入10μlsio2吸附液，混勻，8000×g離心1min；吸棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇400μl，8000×g離心1min；吸棄上清，風(fēng)干15min，加入30μldepc水溶解rna。(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cdna采用莖環(huán)法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟為：取10μl總rna置于無rnase的pcr管中混勻，85℃孵育5min，以打開rna二級結(jié)構(gòu)。隨后立即置于冰上，以防止rna復(fù)性再次恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)；在另一去rnase的pcr管中配置含10mmol/ldntp2.0μl，rnaseinhibitor0.5μl，mir-140-3p逆轉(zhuǎn)錄引物0.5μl，u6逆轉(zhuǎn)錄引物0.5μl，5×buffer4.0μl，m-mlv0.5μl，depc水1.5μl的溶液，將配置好的溶液加入至上述含10μl總rna的pcr管中，混勻后42℃溫度條件下孵育60min；然后85m孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，獲得cdna。(3)定量pcr檢測序列片段大?。簝?nèi)參片段u6為94bp，目的片段hsa-mir-140-3p為71bp(mimat0004597)，見表1。pcr反應(yīng)總體積為20μl，其中cdna(1︰20)5.0μl，hsa-microrna140-3p特異性前向引物(hsa-mir-140-3pf)0.5μl，hsa-microrna140-3p特異性后向引物(hsa-mir-140-3pr)0.5μl，2×sybrgreenqpcrsupermix10μl，dh2o(超純水)4.0μl。反應(yīng)條件為50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s讀板，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線分析：溫度60-95℃，每個(gè)樣重復(fù)3次。表1hsa-mir-140-3pf：5’acactccagctgggaggcggggcgccgcgggahsa-mir-140-3pr：5’ctcaactggtgtcgtggau6-f(u6上游引物)：5’ctcgcttcggcagcacau6-r(u6下游引物)：5’aacgcttcacgaatttgcgt本發(fā)明實(shí)施例采用檢測試劑盒對各研究對象進(jìn)行檢測的各組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下：1、mir-140-3p在各組膝關(guān)節(jié)液中相對表達(dá)量的分析(1)在健康對照組，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組及骨關(guān)節(jié)炎早、中、晚期組患者膝關(guān)節(jié)液中均能檢測到mir-140-3p的表達(dá)，擴(kuò)增曲線如圖1所示，經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)(k-s檢驗(yàn))表明：mir-140-3p在各組膝關(guān)節(jié)液中的相對表達(dá)量2-δδct均服從正態(tài)分布。(2)對健康對照組，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組及骨關(guān)節(jié)炎早、中、晚期組患者膝關(guān)節(jié)液中mir-140-3p的相對表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)evene法方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，結(jié)果顯示各組方差不齊(levenestatistic＝13.4，p<0.05)。表2表注：δct＝(目的基因ct-內(nèi)參ct)；δδct＝(待測樣品中目的基因δct-參照樣品中目的基因δct)，選擇正常對照組δct的均數(shù)作為參照進(jìn)行計(jì)算；相對表達(dá)量＝2-δδct。(3)進(jìn)一步對mir-140-3p在各組關(guān)節(jié)液中的相對表達(dá)量進(jìn)行tamhane’st2檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，表3結(jié)果顯示：mir-140-3p表達(dá)量在健康對照組、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組間差異無顯著性意義(p>0.05)；非骨關(guān)節(jié)炎組與骨關(guān)節(jié)炎組間相對表達(dá)量差異有顯著性意義(p<0.05)，且mir-140-3p在非骨關(guān)節(jié)炎組中的表達(dá)量是骨關(guān)節(jié)炎組的9.6倍，健康對照組的表達(dá)量是骨關(guān)節(jié)炎組的11.4倍。mir-140-3p在骨關(guān)節(jié)炎早期、中期、晚期組間相對表達(dá)量差異均有顯著性意義，且隨骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的增加mir-140-3p表達(dá)量呈相對減少的趨勢(如圖2所示)。表3表注：表中數(shù)值為mir-140-3p在各組關(guān)節(jié)液中相對表達(dá)量差異比較的p值，因相對表達(dá)量δδct在各組間方差不齊，故使用tamhane’st2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。(4)將mir-140-3p在健康對照組，骨關(guān)節(jié)炎早、中、晚期組間的相對表達(dá)量進(jìn)一步進(jìn)行spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果顯示spearman等級相關(guān)系數(shù)r＝-0.87，p＝0.00。按α＝0.05水準(zhǔn)，可以認(rèn)為mir-140-3p的表達(dá)量與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。2、mir-140-3p相對表達(dá)量與受試者年齡的相關(guān)性分析繪制mir-140-3p在健康對照組、膝骨關(guān)節(jié)炎早、中、晚期組中的相對表達(dá)量與年齡的散點(diǎn)圖(圖3)。由散點(diǎn)圖可見，mir-140-3p在膝關(guān)節(jié)液中的相對表達(dá)量與年齡間并無明顯的直線相關(guān)關(guān)系；將mir-140-3p在健康對照組、膝骨關(guān)節(jié)炎早、中、晚期組中相對表達(dá)量與年齡的相關(guān)性進(jìn)一步行pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示：mir-140-3p與年齡的pearson相關(guān)系數(shù)r＝-0.144，p＝0.293，按α＝0.05檢驗(yàn)水準(zhǔn)，可以認(rèn)為mir-140-3p在各膝關(guān)節(jié)液中的相對表達(dá)量與年齡之間無直線相關(guān)關(guān)系。需要說明的是，根據(jù)上述說明書的揭示和和闡述，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實(shí)施方式進(jìn)行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的一些等同修改和變更也應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。當(dāng)前第1頁12