本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及與結(jié)直腸癌早期篩查和預(yù)后監(jiān)測(cè)相關(guān)的分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌(colorectalcancer，crc)是當(dāng)今人類常見的四大惡性腫瘤之一，全世界每年有超過一百萬的結(jié)直腸癌新增病例，其死亡率高達(dá)33％，位居各種癌癥的第三位。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率正逐年增加，且呈年輕化趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過程，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前crc病人5年存活率仍低于60％，臨床療效評(píng)價(jià)及預(yù)后監(jiān)控還有待進(jìn)一步改善。crc患者的存活率與診斷時(shí)疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)：早期患者的5年存活率可達(dá)90％以上，而晚期患者的存活率不到10％。

目前，用于結(jié)直腸癌早期篩查、診斷的方法主要包括：直腸指診、糞便潛血試驗(yàn)、糞便脫落標(biāo)記物檢測(cè)、血清標(biāo)記物檢測(cè)以及結(jié)腸鏡檢查等。直腸指診只能檢查直腸癌對(duì)結(jié)腸癌的診斷無明顯幫助。糞便潛血試驗(yàn)是最普遍的篩查方法，但是容易出現(xiàn)假陽性，漏診率高。糞便脫落標(biāo)記物檢測(cè)是新技術(shù)，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，難以用于大規(guī)模人群篩查。血清cea檢查診斷結(jié)直腸癌的敏感性低，早期診斷不明顯。結(jié)腸鏡檢查則是一種侵入性檢查，具有一定的危險(xiǎn)性，不適用與結(jié)直腸癌的早期篩查。

因此，發(fā)展簡單、可行的結(jié)直腸癌診斷及監(jiān)控方法是提高crc病人生存率亟待解決的關(guān)鍵問題。

代謝組學(xué)(metabolomics/metabonomics)是近年來系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域中最活躍的分支學(xué)科之一，廣泛應(yīng)用于癌癥研究領(lǐng)域。代謝組學(xué)采用高靈敏度、高通量的現(xiàn)代儀器分析手段，定性、定量地研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中代謝物的變化，篩選和鑒別新型腫瘤生物標(biāo)志物，對(duì)腫瘤臨床診斷及預(yù)后監(jiān)控具有重要價(jià)值，展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。多數(shù)研究都證實(shí)了代謝異常與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為尋找結(jié)直腸癌相關(guān)的代謝性生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)，及預(yù)后監(jiān)控，本發(fā)明的目的在于提供用于結(jié)直腸癌早期篩查及預(yù)后監(jiān)測(cè)的代謝標(biāo)志物。

本發(fā)明的還一目的是提供所述代謝標(biāo)志物在結(jié)直腸癌早期篩查及預(yù)后監(jiān)測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供用于結(jié)直腸癌檢測(cè)的代謝標(biāo)志物，所述代謝標(biāo)志物為β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸、檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸。

本發(fā)明經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌病人血清樣本中所述代謝標(biāo)志物β-羥基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸、甘油在結(jié)直腸癌患者中顯著上調(diào)(高于健康對(duì)照者水平)，所述代謝標(biāo)志物5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸在結(jié)直腸癌患者中顯著下調(diào)(低于健康對(duì)照者水平)；所述代謝標(biāo)志物檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸、延胡索酸在結(jié)直腸癌預(yù)后不良患者中顯著下調(diào)(低于結(jié)直腸癌預(yù)后良好患者)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述代謝標(biāo)志物在結(jié)直腸癌篩查和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，利用所述代謝標(biāo)志物篩查和監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌的步驟為：(1)獲取受試者生物樣本；(2)檢測(cè)受試者樣本中所述一種或多種代謝標(biāo)志物的濃度，確定受試者的代謝物譜；(3)將受試者代謝物譜與健康對(duì)照者代謝物譜中所述代謝標(biāo)志物比較；(4)鑒定受試者代謝物譜與健康對(duì)照者代謝物譜的差異，受試者代謝物譜與健康對(duì)照者代謝物譜相比，其中所述代謝標(biāo)志物β-羥基丁酸、α-酮丁酸、2-辛烯二酸和甘油的濃度出現(xiàn)升高，所述代謝標(biāo)志物5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、延胡索酸、天冬氨酸、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸的濃度出現(xiàn)下降時(shí)，表明受試者易患有結(jié)直腸癌；(5)對(duì)于已確診為結(jié)直腸癌的受試者，其術(shù)前血清中所述代謝標(biāo)志物檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的濃度出現(xiàn)下降時(shí)，表明受試者結(jié)直腸癌預(yù)后不良。

優(yōu)選的，檢測(cè)受試者樣本中所述一種或多種代謝標(biāo)志物濃度的方法包括氣相色譜-質(zhì)譜分析、液相色譜-質(zhì)譜分析、核磁共振分析、酶速法。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種輔助結(jié)直腸癌早期篩查及診斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸組合標(biāo)志物濃度的試劑。

優(yōu)選的，所述試劑盒包括：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品：β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸，所述標(biāo)準(zhǔn)品分別用于對(duì)應(yīng)的血清樣本中β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸的定性；

(2)血清樣本處理液：所述血清樣本處理液用于預(yù)處理來自受試者的血清樣品，包括試劑1和試劑2，

試劑1包括甲醇-氯仿混合溶液(體積比為3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)、含1％三甲基氯硅烷的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％tmcs的bstfa)；

試劑2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、水-甲醇-乙腈混合溶液(體積比為1∶2∶7)；

(3)洗脫液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，純水和乙腈。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種輔助結(jié)直腸癌早期篩查及診斷的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測(cè)所述β-羥基丁酸代謝標(biāo)志物濃度的試劑。

優(yōu)選的，所述試劑包括三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩劑、四乙酸二氨基乙烯二鈉鹽、β-羥基丁酸脫氫酶，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、氯化鎂。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種輔助結(jié)直腸癌預(yù)后監(jiān)測(cè)的試劑盒，所述試劑盒為利用檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸組合標(biāo)志物共同診斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后情況的試劑盒。

優(yōu)選的，所述試劑盒包括：

(1)標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，所述標(biāo)準(zhǔn)品分別用于對(duì)應(yīng)的血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的定性；

(2)血清樣本處理液：所述血清樣本處理液用于預(yù)處理來自受試者的血清樣品，包括試劑1和試劑2，

試劑1包括甲醇-氯仿混合溶液(體積比為3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)、含1％三甲基氯硅烷的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％tmcs的bstfa)；

試劑2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、水-甲醇-乙腈混合溶液(體積比為1∶2∶7)；

(3)洗脫液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，純水和乙腈。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明公開了與結(jié)直腸癌相關(guān)的代謝標(biāo)志物，并進(jìn)一步證實(shí)所述代謝物可以作為檢測(cè)結(jié)直腸癌的代謝性標(biāo)志物。利用本發(fā)明的代謝標(biāo)志物篩查并監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌，不僅精確度大大提高，同時(shí)對(duì)后續(xù)臨床應(yīng)用研究的開展具有指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1.12個(gè)潛在診斷標(biāo)志物在crc病人組和健康對(duì)照者組中的變化情況；

圖2.8個(gè)潛在預(yù)后標(biāo)志物在兩組crc病人(預(yù)后良好組vs預(yù)后不良組)之間的變化情況；

圖3.β-羥基丁酸在訓(xùn)練集和測(cè)試集中的roc曲線分析結(jié)果；

圖4.12個(gè)代謝性診斷標(biāo)志物組合變量在訓(xùn)練集和測(cè)試集中的roc曲線分析結(jié)果；

圖5.血清延胡索酸水平在不同病理分期crc患者中的變化趨勢(shì)；

圖6.血清β-羥基丁酸水平在不同病理分期crc病人中的變化趨勢(shì)；

圖7.結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)代謝標(biāo)志物組合變量、cea及綜合指標(biāo)的roc曲線分析結(jié)果；

圖8.8個(gè)預(yù)后標(biāo)志物與cea組成的綜合指標(biāo)的生存曲線分析結(jié)果；

圖9.實(shí)施例5中血清β-羥基丁酸在crc患者和健康對(duì)照者中的變化情況。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件提取血清。

本發(fā)明的病理分期是根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(ajcc)和國際抗癌聯(lián)盟(uicc)聯(lián)合修訂的結(jié)直腸癌tnm分期(2010年第七版)。

本發(fā)明所用術(shù)語cea(carcinoembryonicantigen，癌胚抗原)為血清抗癌抗原，是一種常見的腫瘤標(biāo)記物，已廣泛應(yīng)用于胃腸道腫瘤的臨床輔助診斷及預(yù)后監(jiān)控，對(duì)良惡腫瘤的判斷有一定的臨床價(jià)值，但cea并非腫瘤特異性抗原，對(duì)結(jié)直腸癌的特異性不高。

本發(fā)明所用術(shù)語crc為結(jié)直腸癌(colorectalcancer)的英文縮寫。

本發(fā)明的發(fā)明人利用氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(gc-tof-ms)和超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-q-tof-ms)平臺(tái)，對(duì)結(jié)直腸癌(crc)患者和健康對(duì)照者的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，利用訓(xùn)練樣本集和測(cè)試樣本集，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)分析，篩選出12個(gè)代謝標(biāo)志物，上述代謝物與結(jié)直腸癌有關(guān)，提示上述代謝標(biāo)志物可能具有很好的輔助診斷價(jià)值，可成為結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物；另外，結(jié)合crc病人的術(shù)后隨訪資料，對(duì)預(yù)后良好的crc患者和預(yù)后不良的crc患者術(shù)前血清代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)分析，篩選出8個(gè)與crc預(yù)后相關(guān)的代謝物，提示這些代謝標(biāo)志物可能具有很好的預(yù)后監(jiān)測(cè)價(jià)值，可成為結(jié)直腸癌預(yù)后標(biāo)志物。

實(shí)施例1基于gc-tof-ms和uplc-q-tof-ms平臺(tái)篩選差異代謝標(biāo)志物

一、取樣

臨床樣本1：收集101例經(jīng)檢查確診的結(jié)直腸癌病人(crc病人)和102例健康對(duì)照者的血清，編號(hào)后置于-80℃冰箱保存。結(jié)直腸癌病人樣本來源于上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院的住院患者，健康對(duì)照組樣本來源于上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院的體檢中心。隨機(jī)選取62例結(jié)直腸癌病人和62例健康對(duì)照者作為訓(xùn)練樣本集，其余39例結(jié)直腸癌病人和40例健康對(duì)照者作為測(cè)試樣本集，相關(guān)的臨床信息見表1。本發(fā)明的所有臨床樣本均得到了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1.樣本臨床信息

^acea，carcinoembryonicantigen，癌胚抗原

臨床樣本2：基于臨床樣本1收集經(jīng)手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌病人，并對(duì)其術(shù)后生存狀況進(jìn)行隨訪調(diào)查，將具有詳細(xì)預(yù)后信息的crc病人分成了兩組：預(yù)后良好組(3年以上隨訪結(jié)果：存活且無復(fù)發(fā)，n＝29例)和預(yù)后不良組(3年隨訪結(jié)果：死于癌癥復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，n＝23例)，兩組crc病人在性別組成(卡方檢驗(yàn)，p＝0.65)和年齡分布(t-檢驗(yàn)，p＝0.65)上均無顯著差異，相關(guān)臨床信息見表2：

表2預(yù)后良好組與預(yù)后不良組結(jié)直腸癌病人組織樣本臨床信息

^a，3年以上隨訪結(jié)果存活且無復(fù)發(fā)；^b，3年隨訪結(jié)果死于癌癥復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移

二、血清樣本前處理及檢測(cè)

1、基于氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(gc-tof-ms)平臺(tái)的血清樣本前處理及檢測(cè)

(1)將收集的血清樣本室溫下解凍，渦旋混勻后取100μl置干凈的離心管中，加入300μl甲醇-氯仿混合溶液(體積比甲醇∶氯仿＝3∶1)，渦旋振蕩30s，充分混勻，-20℃靜置10min以幫助蛋白沉淀。接著12,000rpm離心10min(室溫)，取300μl上清液至gc高回收進(jìn)樣瓶中。

(2)分別加入10μl2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)和10μl十七烷酸(1mg/ml)作為內(nèi)標(biāo)，室溫下真空干燥濃縮。干燥完畢后，用氮?dú)?n2)對(duì)樣品進(jìn)行再次干燥，以保證樣品中無水并排除空氣中的濕氣對(duì)后續(xù)衍生步驟的影響(空氣濕度控制在35％以下)。

(3)氮?dú)獯蹈珊?，迅速加?0μl甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)并加蓋密封，振蕩30s，置于30℃搖床(200rpm)上反應(yīng)90min。反應(yīng)完畢后，開啟密封蓋，迅速加入80μl硅烷化試劑bstfa(含1％tmcs)，并立即加蓋密封，振蕩30s，置于70℃烘箱中反應(yīng)60min，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，再振蕩10s，室溫下靜置1小時(shí)后進(jìn)樣檢測(cè)。

(4)采用leco公司的氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用儀(agilent6890ngc/pegasushttof-ms)進(jìn)行分析測(cè)定。

氣相色譜條件：色譜柱為db-5ms毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度270℃；離子源溫度220℃，接口溫度270℃，程序升溫起始溫度為80℃，保持2min；以10℃/min的速度升至180℃，再以6℃/min的速度升至230℃，最后以40℃/min的速度升至295℃，保持8min。載氣為氦氣，載氣流速為1ml/min。

質(zhì)譜條件：離子源為標(biāo)準(zhǔn)ei源，電子能量為70ev；全掃描方式掃描。掃描范圍：m/z30-600；以20張/秒進(jìn)行質(zhì)譜圖采集。

2、基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-q-tof-ms)平臺(tái)的血清樣本前處理及檢測(cè)

(1)將收集的血清樣本室溫下解凍，渦旋混勻后取80μl置干凈的離心管中，分別加入10μl2-氯苯丙氨酸水溶液(0.3mg/ml)和10μl十七烷酸(1mg/ml)作為內(nèi)標(biāo)。

(2)然后加入400μl萃取溶劑(水∶甲醇∶乙腈＝1∶2∶7)，渦旋振蕩2min，充分混勻，超聲1min，-20℃靜置10min以幫助蛋白沉淀。4℃，12，000rpm，離心20min。取上清液150μl于玻璃進(jìn)樣瓶的尖底內(nèi)襯管，用于uplc-q-tofms正離子檢測(cè)。

(3)另外，取上清液150μl于1.5ml離心管，-80℃凍存，負(fù)離子檢測(cè)備用。負(fù)離子進(jìn)樣檢測(cè)前，渦旋混勻2min，4℃，12，000rpm，離心15min，取100μl于玻璃進(jìn)樣瓶的尖底內(nèi)襯管，用于uplc-q-tof-ms負(fù)離子檢測(cè)。

(4)采用美國waters公司超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(acquityultraperformancelc-q-tofpremier)進(jìn)行分析測(cè)定。

液相色譜條件：

1)正離子模式(es+)：流動(dòng)相a為含1％(v/v)甲酸的水溶液，流動(dòng)相b為含1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；

2)負(fù)離子模式(es-)：流動(dòng)相a為水溶液，流動(dòng)相b為乙腈溶液。

流動(dòng)相洗脫梯度如下表：

表3流動(dòng)相洗脫梯度

質(zhì)譜條件：以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣。飛行管檢測(cè)模式v型；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度350℃；錐孔氣流50l/h；脫溶劑氣650l/h；

對(duì)于電噴霧電離正離子(esi+)模式：毛細(xì)管電壓設(shè)為3.2kv，錐孔電壓設(shè)為35v，亮氨酸腦啡肽作為鎖定質(zhì)量數(shù)：m/z＝556.2771；

對(duì)于電噴霧電離負(fù)離子(esi-)模式：毛細(xì)管電壓設(shè)為3kv，錐孔電壓設(shè)為50v，亮氨酸腦啡肽作為鎖定質(zhì)量數(shù)：m/z＝554.2615。

質(zhì)荷比范圍：50-1000m/z；掃描時(shí)間設(shè)為0.3s，掃描時(shí)間間隔為0.02s。

三、數(shù)據(jù)處理

1、gc-tof-ms數(shù)據(jù)的提取及代謝物鑒定

采用leco公司的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件包c(diǎn)hromatofsoftware(版本4.34，leco，usa)對(duì)于原始gc-tofms數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，得到由化合物的樣本信息(物質(zhì)名及特征性指標(biāo)m/z)、保留時(shí)間及峰強(qiáng)度組成的三維矩陣數(shù)據(jù)。通過將譜峰的保留時(shí)間和質(zhì)荷比信息導(dǎo)入nist11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索匹配(質(zhì)譜碎片離子圖匹配度閾值設(shè)為＞800)，并利用合作實(shí)驗(yàn)室(上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院賈偉教授課題組)自行建立的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜庫進(jìn)行代謝物的鑒定。

2、uplc-q-tof-ms數(shù)據(jù)的提取及代謝物鑒定

采用waters公司提供的商業(yè)軟件masslynx(v4.1waters，manchester，u.k.)對(duì)原始uplc-q-tofms數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，得到由樣本名(觀測(cè)值)、保留時(shí)間(r.t.)-質(zhì)荷比(m/z)成對(duì)的分配峰指數(shù)及離子峰強(qiáng)度(變量)組成的三維數(shù)據(jù)矩陣。

相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：色譜保留時(shí)間范圍設(shè)為0～9.5min；提取質(zhì)荷比范圍及窗口分別設(shè)為50-1000da和0.05da；最小峰強(qiáng)度設(shè)為基峰的5％；保留時(shí)間的容許誤差設(shè)為0.3min。數(shù)據(jù)處理中，剔除了數(shù)據(jù)矩陣中在大于80％樣本中均缺失的峰、內(nèi)標(biāo)峰、一些溶劑峰和系統(tǒng)冗余峰。通過合作實(shí)驗(yàn)室自行建立的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜庫和開放的人類代謝組數(shù)據(jù)庫(hmdb，http：//www.hmdb.ca/)搜索匹配鑒定血清代謝譜中的代謝物。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，設(shè)定匹配標(biāo)準(zhǔn)為：精確質(zhì)量數(shù)差異(實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)與數(shù)據(jù)庫中質(zhì)量數(shù))＜0.02da，保留時(shí)間差異(實(shí)測(cè)保留時(shí)間與數(shù)據(jù)庫中保留時(shí)間)＜0.5min。對(duì)于hmdb數(shù)據(jù)庫搜索匹配標(biāo)準(zhǔn)為：準(zhǔn)分子峰精確質(zhì)量數(shù)差異(實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)與數(shù)據(jù)庫記載)＜0.005da。

四、差異代謝標(biāo)志物篩選

1、結(jié)直腸癌潛在的代謝性診斷標(biāo)志物篩選

利用臨床樣本1中訓(xùn)練樣本集的血清代謝數(shù)據(jù)，通過多維統(tǒng)計(jì)分析(正交偏最小二乘法-判別分析，opls-da)建立crc患者和健康對(duì)照者的診斷模型，再利用測(cè)試樣本集對(duì)建立的診斷模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行檢驗(yàn)。然后結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)分析(opls-da)、單維統(tǒng)計(jì)分析(mann-whitneyu檢驗(yàn))、以及經(jīng)典的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析(roc曲線)來進(jìn)行結(jié)直腸癌相關(guān)代謝性標(biāo)志物的篩選，并對(duì)其進(jìn)行代謝通路分析。設(shè)定潛在的代謝性診斷標(biāo)志物篩選標(biāo)準(zhǔn)為：opls-da模型中的變量重要性投影值vip＞1，mann-whitneyu檢驗(yàn)p＜0.05，且roc曲線分析曲線下面積(auc)＞0.85。經(jīng)篩選，有12個(gè)差異代謝物：5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、β-羥基丁酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸符合上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，如表4所示：

表4.結(jié)直腸癌潛在的代謝性診斷標(biāo)志物篩選結(jié)果

^avip，variableimportanceintheprojection，變量重要性投影值。^b，p，uplc-q-tof-ms平臺(tái)正離子模式；n，uplc-q-tof-ms平臺(tái)負(fù)離子模式；g，gc-tof-ms平臺(tái)

這12個(gè)潛在診斷標(biāo)志物在crc病人組和健康對(duì)照者組中的變化情況如圖1所示，結(jié)果顯示它們?cè)谟?xùn)練集和測(cè)試集中具有一致的變化趨勢(shì)，具備良好的穩(wěn)定性，可以作為結(jié)直腸癌早期篩查和診斷的代謝標(biāo)志物。

2、結(jié)直腸癌潛在的代謝性預(yù)后標(biāo)志物篩選

利用臨床樣本2的血清代謝數(shù)據(jù)，對(duì)兩組crc患者(預(yù)后良好組vs預(yù)后不良組)的血清代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(mann-whitneyu檢驗(yàn))和經(jīng)典的醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析(roc分析)，基于統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)差異代謝物的篩選，設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為：mann-whitneyu檢驗(yàn)p＜0.05，且roc分析中auc＞0.7。經(jīng)篩選，有8個(gè)差異代謝物：檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸、延胡索酸滿足上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，如表5所示。

表5.結(jié)直腸癌潛在的代謝性預(yù)后標(biāo)志物篩選

這8個(gè)潛在預(yù)后標(biāo)志物在兩組crc患者(預(yù)后良好組vs預(yù)后不良組)之間的變化情況如圖2所示，結(jié)果顯示它們?cè)诮Y(jié)直腸癌預(yù)后不良病人中顯著下調(diào)，可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后代謝標(biāo)志物。

實(shí)施例2代謝性診斷標(biāo)志物在臨床上區(qū)分crc患者和健康人的roc分析

一、取樣

樣本的收集同實(shí)施例1中臨床樣本1。

二、血清樣本前處理及檢測(cè)

血清的處理及檢測(cè)方法同實(shí)施例1。

三、數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理方法也同實(shí)施例1

四、roc分析

1、β-羥基丁酸的roc分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件spss(v19，ibm，usa)對(duì)其進(jìn)行roc分析。結(jié)果如圖3所示：在訓(xùn)練樣本集和測(cè)試樣本集中，利用血清中β-羥基丁酸水平來區(qū)分crc患者和健康人的曲線下面積(auc值)分別高達(dá)0.925和0.951，而且其診斷敏感度均高于90％，特異度也達(dá)80％以上。

2、12個(gè)代謝性診斷標(biāo)志物組合變量的roc分析

利用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件中的邏輯回歸算法，擬合代謝物組合變量p＝160.4073+(-0.2908)×5-羥色胺+(0.0214)×溶血磷脂酰膽堿(c14：0)+(-0.0263)×溶血磷脂酰膽堿(c16：1)+(0.0072)×α-酮丁酸+(-0.0354)×延胡索酸+(-0.0122)×天冬氨酸+(-0.0001)×β-羥基丁酸+(-0.1423)×2-辛烯二酸+(-0.0004)×甘油+(-0.0502)×甘油酸+(-0.0130)×色氨酸+(0.0098)×順烏頭酸。對(duì)該組合變量進(jìn)行roc分析，計(jì)算其曲線下面積(auc)。

結(jié)果顯示：該代謝物組合變量在訓(xùn)練集中區(qū)分crc病人和健康對(duì)照者的auc值高達(dá)1.00，靈敏度和特異度均為1.00。其在測(cè)試集中區(qū)分crc病人和健康對(duì)照者的auc值達(dá)0.977，敏感度為0.927，特異度為0.965，如圖4所示。該組合變量p具有很好的診斷準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，篩選出的這12個(gè)關(guān)鍵性差異代謝物可用作結(jié)直腸癌潛在的診斷標(biāo)志物。

實(shí)施例3代謝標(biāo)記物在不同病理分期的結(jié)直腸癌患者中的分析

一、取樣

樣本的收集同實(shí)施例1中臨床樣本1。

二、血清樣本前處理及檢測(cè)

血清的處理及檢測(cè)方法同實(shí)施例1。

三、數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理方法也同實(shí)施例1。

四、根據(jù)臨床病理資料進(jìn)行分析，其中，延胡索酸隨著病理嚴(yán)重程度的增加(i期→iv期)依次降低(如圖5所示)，而且在早期患者(i期+ii期)和晚期患者(iii期+iv期)之間存在顯著差異(p＝0.03)。血清β-羥基丁酸在早期的crc患者中已經(jīng)顯著升高，而且隨著病理嚴(yán)重程度的增加(i期→iv期)而依次升高(如圖6所示)。

實(shí)施例4代謝性預(yù)后標(biāo)志物在臨床上輔助監(jiān)控結(jié)直腸癌患者的預(yù)后

一、取樣

樣本的收集同實(shí)施例1中臨床樣本2。

二、血清樣本前處理及檢測(cè)

血清的處理及檢測(cè)方法同實(shí)施例1。

三、數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理方法也同實(shí)施例1

四、roc分析

1、8個(gè)代謝性預(yù)后標(biāo)志物組合變量的roc分析

利用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件中的邏輯回歸算法，擬合預(yù)后代謝物組合變量q＝4.17005+(-0.00534)×檸檬酸+(-0.00032)×鳥氨酸+(-0.00244)×單棕櫚酸甘油酯+(-0.00023)×肌酐+(-0.00065)×甲硫氨酸+(0.00138)×瓜氨酸+(-0.00004)×色氨酸+(-0.00004)×延胡索酸，對(duì)該組合變量進(jìn)行roc分析，計(jì)算其曲線下面積(auc)。

結(jié)果顯示：該代謝物組合變量區(qū)分預(yù)后良好和預(yù)后不良的兩組結(jié)直腸癌病人的auc值達(dá)0.821，如圖7所示中點(diǎn)畫線所示，而傳統(tǒng)預(yù)后標(biāo)記物cea的auc值僅為0.656，如圖7所示中長虛線所示。該組合變量q具有比傳統(tǒng)預(yù)后標(biāo)記物更好的預(yù)后準(zhǔn)確性，篩選出的這8個(gè)差異代謝物可用作結(jié)直腸癌潛在的預(yù)后監(jiān)控標(biāo)志物。

2、進(jìn)一步地，利用spss統(tǒng)計(jì)分析軟件中的邏輯回歸算法，聯(lián)合以上8個(gè)差異代謝物和cea擬合綜合指標(biāo)i＝6.1298+(-0.0212)×檸檬酸+(-0.0006)×鳥氨酸+(-0.0045)×單棕櫚酸甘油酯+(-0.0005)×肌酐+(0.0033)×甲硫氨酸+(0.0024)×瓜氨酸+(-0.0007)×色氨酸+(0.0020)×延胡索酸+(0.1561)×cea。

結(jié)果顯示：該綜合指標(biāo)區(qū)分預(yù)后良好和預(yù)后不良的兩組crc病人的auc值高達(dá)0.906，圖7中實(shí)黑線所示。聯(lián)合使用上述8個(gè)代謝性標(biāo)志物和臨床指標(biāo)cea，將能更好地輔助結(jié)直腸癌的預(yù)后監(jiān)控。

五、生存分析

基于roc分析結(jié)果，設(shè)定約登指數(shù)為最大值時(shí)所對(duì)應(yīng)的綜合指標(biāo)值為區(qū)分閾值(cutoff＝-1.2126)，將52例有預(yù)后信息的結(jié)直腸癌病人分為兩組：高水平組(綜合指標(biāo)＞-1.2126，n＝34)和低水平組(綜合指標(biāo)＜-1.2126，n＝18)，然后進(jìn)行kaplan-meier生存分析。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：綜合指標(biāo)值處于高、低水平的兩組結(jié)直腸癌病人之間的生存率存在非常顯著的差異(log-rank檢驗(yàn)，p＜0.0001)，結(jié)果如圖8所示。進(jìn)一步說明該綜合指標(biāo)(即聯(lián)合cea和8個(gè)crc預(yù)后相關(guān)的代謝性標(biāo)志物)具有良好的臨床應(yīng)用潛能。

實(shí)施例5輔助結(jié)直腸癌早期篩查及診斷試劑盒1

用于輔助結(jié)直腸早期篩查及診斷的試劑盒包括：三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩劑(60mm)、四乙酸二氨基乙烯二鈉鹽(25mm)、β-羥基丁酸脫氫酶(32m)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(2.5mm)、氯化鎂(2mm)、蔗糖(35mm)。

一、取樣

收集96例經(jīng)檢查確診的結(jié)直腸癌患者和80例健康對(duì)照者的血清，編號(hào)后置于-80℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)中選用了來自多個(gè)中心的臨床樣本，crc患者樣本來源于中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心的住院患者，健康對(duì)照組樣本來源于中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院的體檢中心。本發(fā)明的所有臨床樣本均得到中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、檢測(cè)

1、采用本發(fā)明所述輔助結(jié)直腸早期篩查及診斷試劑盒和自動(dòng)生化分析儀定量分別檢測(cè)96例crc病人血清樣本和80例健康對(duì)照者血清樣本中β-羥基丁酸的濃度。

2、將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖9所示：新一批多中心來源的臨床樣本中，crc患者的血清β-羥基丁酸水平顯著高于健康對(duì)照者的水平(fc＝2.64，p＜0.0001)，與基于色譜-質(zhì)譜平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果一致，驗(yàn)證了該診斷試劑盒用作輔助crc臨床篩查和診斷的可靠性。

實(shí)施例6輔助結(jié)直腸癌早期篩查及診斷試劑盒2

用于輔助結(jié)直腸癌早期篩查及診斷試劑盒包括：β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸，血清樣本處理液，洗脫液；

(1)標(biāo)準(zhǔn)品：β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸，所述標(biāo)準(zhǔn)品分別用于對(duì)應(yīng)的血清樣本中β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸、順烏頭酸的定性；

(2)血清樣本處理液：所述血清樣本處理液用于預(yù)處理來自受試者的血清樣品，包括試劑1和試劑2，

試劑1包括甲醇-氯仿混合溶液(體積比為3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)、含1％三甲基氯硅烷的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(含1％tmcs的bstfa)；

試劑2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、水-甲醇-乙腈混合溶液(體積比為1∶2∶7)；

(3)洗脫液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，純水和乙腈。

利用該試劑盒中的血清樣本處理液對(duì)血清樣本進(jìn)行處理，通過gc-tof-ms和uplc-q-tof-ms平臺(tái)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，洗脫液使用該試劑盒中的洗脫液，利用該試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)血清樣本中β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸進(jìn)行定性定量分析，最后得出血清樣本中β-羥基丁酸、5-羥色胺、溶血磷脂酰膽堿(c14：0)、溶血磷脂酰膽堿(c16：1)、α-酮丁酸、延胡索酸、天冬氨酸、2-辛烯二酸、甘油、甘油酸、色氨酸和順烏頭酸的濃度。

實(shí)施例7輔助結(jié)直腸癌預(yù)后監(jiān)測(cè)試劑盒

用于輔助結(jié)直腸癌預(yù)后監(jiān)測(cè)的試劑盒1包括：檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，血清樣本處理液，洗脫液；

(1)標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸，所述標(biāo)準(zhǔn)品分別用于對(duì)應(yīng)的血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的定性；

(2)血清樣本處理液：所述血清樣本處理液用于預(yù)處理來自受試者的血清樣品，包括試劑1和試劑2，

試劑1包括甲醇-氯仿混合溶液(體積比為3∶1)，2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)、含1％三甲基氯硅烷的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺；

試劑2包括2-氯苯丙氨酸(0.3mg/ml)、十七烷酸(1mg/ml)、水-甲醇-乙腈混合溶液(體積比為1∶2∶7)；

(3)洗脫液：0.1％(v/v)甲酸的水溶液，0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，水和乙腈。

一、取樣

收集10例經(jīng)手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌病人和10例對(duì)照者的血清樣本，編號(hào)后置于-80℃冰箱保存。結(jié)直腸癌病人樣本來源于中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院的住院患者，對(duì)照者為經(jīng)手術(shù)切除治療三年以上且無復(fù)發(fā)的結(jié)直腸癌病人，樣本同樣來源于中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院。本發(fā)明的所有臨床樣本均得到中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、檢測(cè)

1、采用本發(fā)明所述輔助結(jié)直腸預(yù)后試劑盒檢測(cè)10例結(jié)直腸病人血清樣本和10例對(duì)照者血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的濃度。利用該試劑盒中的血清樣本處理液對(duì)每一例血清樣本進(jìn)行處理，通過gc-tof-ms和uplc-q-tof-ms平臺(tái)對(duì)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，洗脫液使用該試劑盒中的洗脫液，利用該試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸進(jìn)行定性定量分析，最后得出血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的濃度。

2、將10例結(jié)直腸癌病人血清樣本中預(yù)后標(biāo)志物(檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸)濃度和10例對(duì)照者血清樣本中檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸的濃度均值進(jìn)行對(duì)比，判斷其預(yù)后情況，判斷標(biāo)準(zhǔn)定為：檸檬酸、鳥氨酸、單棕櫚酸甘油酯、肌酐、甲硫氨酸、瓜氨酸、色氨酸和延胡索酸8個(gè)標(biāo)記物的全部下調(diào)判斷為結(jié)直腸癌病人轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，否則判斷為無進(jìn)展生存，同時(shí)，結(jié)合病人臨床隨訪資料分析該預(yù)后試劑盒的結(jié)果。結(jié)果如表6所示：

表6結(jié)直腸癌預(yù)后檢測(cè)試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)

由表6可知，結(jié)直腸癌預(yù)后檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果為10例病人中有6例結(jié)直腸癌病人轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，有4例無進(jìn)展生存，臨床隨訪資料顯示，10例病人中有4例轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，6例無進(jìn)展生存，其中標(biāo)號(hào)分別為4、10號(hào)病人的試劑盒檢測(cè)結(jié)果和臨床隨訪結(jié)果不一致。結(jié)果顯示：試劑盒檢測(cè)結(jié)果與臨床結(jié)果的符合率達(dá)80％。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。