本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，涉及一種用于多發(fā)性骨髓瘤診斷的分子標(biāo)志物，具體涉及骨髓細(xì)胞中的分子標(biāo)志物-foxm1基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)，是一種漿細(xì)胞異常增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％，嚴(yán)重危害人類健康。多發(fā)性骨髓瘤常伴有多發(fā)性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害等。由于正常免疫球蛋白的生成受抑制，因此容易出現(xiàn)各種細(xì)菌性感染

目前多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要依靠骨髓克隆性漿細(xì)胞比例和(或)活組織病理學(xué)檢查作為mm診斷基礎(chǔ)。2014年，國(guó)際骨髓瘤工作組(imwg)對(duì)mm診斷標(biāo)注進(jìn)行了修訂，定義骨髓克隆性漿細(xì)胞比例≥10％和/或活組織病理學(xué)檢查證實(shí)為漿細(xì)胞瘤；同時(shí)伴有以下一種或多種情況：高鈣血癥、腎功能不全、貧血和溶骨性骨損害；將骨髓克隆性漿細(xì)胞比例≥60％、受累血清游離輕鏈與未受累血清游離輕鏈比值≥100、mri檢查發(fā)現(xiàn)局灶性病變部位>1處(每處檢查的病灶直徑≥5mm)作為極高危無(wú)癥狀mm生物學(xué)標(biāo)志物納入mm診斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，mri、低劑量全身ct、fdg/pet及pet/ct等現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)被納入檢查輔助方法。

到目前為止，很多生物標(biāo)志物都不能很好的用來(lái)作為臨床診斷標(biāo)志。目前臨床常用的診斷標(biāo)志物是單克隆免疫球蛋白(m蛋白)，在mm患者血清中m蛋白所屬免疫球蛋白顯著增高而非m蛋白所屬免疫球蛋白含量顯著下降。但修訂后的mm診斷標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)單克隆蛋白水平并不是診斷活動(dòng)性mm所必需。

綜上，目前多發(fā)性骨髓瘤診斷的方法復(fù)雜、檢查項(xiàng)目多，缺少一種可靠、方便的臨床診斷方法。新的研究表明，在多發(fā)性骨髓瘤患者中，檢出foxm1基因的表達(dá)顯著增高，foxm1基因的表達(dá)水平與骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或抑制有直接關(guān)系。表明foxm1是一種高危的骨髓瘤基因，可為多發(fā)性骨髓瘤的臨床診斷提供可靠的判斷。

foxm1是fox家族中轉(zhuǎn)錄因子之一，特異性表達(dá)于增殖期細(xì)胞中，在細(xì)胞終末分化時(shí)消失。foxm1的表達(dá)水平與正常細(xì)胞的增殖、衰老及器官的形成過(guò)程密切相關(guān)，而其異常表達(dá)則通過(guò)影響基因組的穩(wěn)定性及有絲分裂過(guò)程的進(jìn)展等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，且foxm1在腫瘤干細(xì)胞的存在及維持干細(xì)胞多能性方面發(fā)揮重要作用，因此foxm1的表達(dá)水平將為腫瘤診斷、評(píng)估、預(yù)后等提供一個(gè)重要指標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明提供了一種分子標(biāo)志物foxm1基因的應(yīng)用，可用于多發(fā)性骨髓瘤的診斷。相比于目前的診斷方法，大大減少了檢查項(xiàng)目，降低成本；配合輔助診斷方法，準(zhǔn)確率高；具有及時(shí)性，特異性，靈敏性。

技術(shù)方案：骨髓細(xì)胞中的分子標(biāo)志物-foxm1基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)foxm1基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

上述用rt-pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與foxm1蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與foxm1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括與foxm1蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與foxm1基因的核酸序列雜交的探針。

上述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物，序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

一種用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，該工具能夠檢測(cè)樣本中foxm1基因的表達(dá)。

上述工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。

上述芯片包括基因芯片或蛋白質(zhì)芯片，所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)foxm1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的foxm1蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括foxm1蛋白的特異性抗體；所述試紙包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的試紙；所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑。

上述檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括針對(duì)foxm1基因的引物和/或探針。

有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了foxm1基因表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)。通過(guò)受試者中foxm1的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有多發(fā)性骨髓瘤、或者判斷受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn)，從而知道臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或治療方案。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的生物標(biāo)記物-foxm1基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷更及時(shí)、更特異、更方便、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷，從而降低多發(fā)性骨髓瘤的死亡率。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用基因芯片檢測(cè)foxm1基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異。分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診病人漿細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)foxm1基因的表達(dá)水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本。

圖2顯示利用qpcr檢測(cè)foxm1基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達(dá)差異。

圖3顯示利用rt-pcr檢測(cè)foxm1基因在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株、患者中和正常人中的表達(dá)差異。條帶1：人多發(fā)性骨髓瘤8226細(xì)胞株；條帶2：人多發(fā)性骨髓瘤u266細(xì)胞株；條帶3-10：患者多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)本；條帶11：正常人。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明提供了檢測(cè)foxm1基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，上面所提到的檢測(cè)foxm1基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過(guò)rt-pcr，實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)等檢測(cè)foxm1基因表達(dá)水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用rt-pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物；所述用免疫檢測(cè)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與foxm1蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：與foxm1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與foxm1蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與foxm1基因的核酸序列雜交的探針。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增foxm1基因的引物的序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中，高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，檢測(cè)foxm1基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)foxm1基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知foxm1基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)也屬于foxm1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種多發(fā)性骨髓瘤的工具，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)foxm1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的foxm1蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括foxm1基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括foxm1蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高多發(fā)性骨髓瘤診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)foxm1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括foxm1蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)foxm1基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)foxm1基因的引物和/或探針。根據(jù)基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)foxm1基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)foxm1基因表達(dá)水平的試劑。

所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè)foxm1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

與foxm1基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其他衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述foxm1蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述foxm1蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如：嵌合抗體，scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能夠保留與foxm1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對(duì)foxm1基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示。

用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的foxm1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源包括但不限于骨髓、血液、組織液、尿液、唾液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的foxm1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源是骨髓。

本發(fā)明的上下文中，“foxm1基因”包括foxm1基因以及foxm1基因的任何功能等同物的多核苷酸。foxm1基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列g(shù)enebank中foxm1基因(nc_000012.12)dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；

優(yōu)選地，foxm1基因的編碼序列包括以下任意一種：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼相同蛋白質(zhì)的dna序列；

(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述foxm1基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本發(fā)明的上下文中，foxm1基因表達(dá)產(chǎn)物包括foxm1蛋白以及foxm1蛋白的部分肽。所述foxm1蛋白的部分肽含有與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的功能域。

“foxm1蛋白”包括foxm1蛋白以及foxm1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括foxm1蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與foxm1的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，foxm1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。

(3)與seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又稱為序列統(tǒng)一性)，更優(yōu)選地，與seqidno.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述foxm1蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是foxm1蛋白的融合蛋白。對(duì)于與foxm1蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留foxm1蛋白的生物活性即可。

本發(fā)明的foxm1蛋白也包括對(duì)seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留foxm1蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“多發(fā)性骨髓瘤”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有多發(fā)性骨髓瘤、也包括受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)施例1篩選多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象：

收集多發(fā)性骨髓瘤患者8例，正常人8例

多發(fā)性骨髓瘤患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：所有多發(fā)性骨髓瘤的診斷根據(jù)who診斷多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)準(zhǔn)，所有初治多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本獲得病人的知情同意。

多發(fā)性骨髓瘤患者的排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移癌，反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥和未定性的單克隆免疫球蛋白病。

2、骨髓中總rna的提取

(1)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離：向收集到的骨髓標(biāo)本中加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，用滴管反復(fù)吹打混勻后于冰上放置10～15min，使骨髓標(biāo)本中的紅細(xì)胞充分裂解；1200rpm/min離心5min，棄上清，pbs洗滌細(xì)胞1次。棄上清，加入1mlpbs吹打混勻后轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，1200rpm/min離心5min，棄上清。每個(gè)樣本加1mltrizol，吹打混勻。

(2)每1mltrizol加入氯仿200μl，充分混勻劇烈震蕩15秒，室溫靜置10min等待分層。

(3)于4℃12000rpm/min離心15min。離心后可見(jiàn)管中混合物液面分為3層，最上層為無(wú)色水相，含有rna；中間層為白色絮狀，含有蛋白層與dna；最下層為紅色的酚-氯仿有機(jī)相。

取上層水相約400μl至另一ep管中，注意避免吸入中間的蛋白層，每管加入等體積異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，室溫靜置10min，于4℃12000rpm/min離心10min，可見(jiàn)管底白色沉淀。

棄上清，加入-20℃預(yù)冷的75％depc酒精1ml，懸起沉淀，4℃7500rpm/min離心5min。

棄上清，室溫放置10-20min風(fēng)干沉淀，依據(jù)沉淀量的多少酌情加入depc水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。

3、rna樣品的質(zhì)量分析

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品，od260/od280為1.8-2.0。

4、基因芯片雜交及掃描

采用affymetrixu133plus2.0microarrays檢測(cè)rna水平。多發(fā)性骨髓瘤患者組的數(shù)據(jù)可在nih基因表達(dá)綜合(geo)下gse2658檢索號(hào)查得，正常組和未定性的單克隆免疫球蛋白病的基因芯片數(shù)據(jù)在gse5900下。

5、芯片數(shù)據(jù)處理與分析

基因芯片的數(shù)據(jù)分析基于gco1.1軟件(affymetrix)，包含對(duì)與疾病相關(guān)相關(guān)的生存的單變量的對(duì)數(shù)等級(jí)檢測(cè)。對(duì)于兩組比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，p＜0.05有顯著意義。

7、結(jié)果

結(jié)果顯示(如圖1所示，分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診病人漿細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)foxm1基因的表達(dá)水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本)，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者foxm1基因的mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

實(shí)施例2qpcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達(dá)的基因

1、研究對(duì)象

篩選標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，多發(fā)性骨髓瘤患者46例，正常人66例。

2、骨髓中總rna的提取

步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄

根據(jù)takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行rna逆轉(zhuǎn)錄。采用10μl反應(yīng)體系，分別加入5×primescriptrtmastermix2μl，總rna0.5μg，加一定量rnasefreewater至10μl。37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s。產(chǎn)物cdna置-20℃冰箱保存。

4、qpcr

采用10μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加樣過(guò)程避光。配制以下反應(yīng)體系：2×sybgreenmastermix5μl，正向引物0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，模板cdna1μl，ddh2o3μl。擴(kuò)增foxm1基因的正向引物序列為5’-tgcccagcagtctcttacct-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-ctacccaccttctggcagtc-3’(seqidno.4)；擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno.5)，反向引物序列為5’-tggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno.6)，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者的foxm1基因的mrna水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，結(jié)果同基因芯片實(shí)驗(yàn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>南京中醫(yī)藥大學(xué)

<120>分子標(biāo)志物foxm1基因的應(yīng)用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19475

<212>dna

<213>人源

<400>1

tttcaaacagcggaacaaactgaaagctccggtgccagaccccacccccggccccggccc60

gggaccccctcccctcccgggatcccccggggttcccaccccgcccgcaccgccggggac120

ccggccggtccggcgcgagcccccgtccggggccctggctcggcccccaggttggaggag180

cccggagcccgccttcggagctacggcctaacggcggcggcgactgcagtctggaggtga240

gcgggatgcagcaatggagtcccaggcctggcctgggcacaggcggggagcaaggcctcc300

gggcgcggaggtcagggcgtctagcagcagggcacgggccacgagtggagatttgggtca360

cacgggaagaatctgagccagggtgcaagttttttctgcgtccacctcctggccgtggcc420

ttctcactgcttaaagcgccccttggccttccctggaagtctgacctccgcaccctgccc480

gcggcctcgggagggctggggtggcctaccttcttaggccgactgtggctgagatgaaga540

ctgagattgtactacattgagtcaaagaccaacctgcatacacactcccctgctcccagg600

ctgtctcaccactaggcaacaccgcctccatcttacttacccttttgcagggcccttttc660

ctggttcttgagaatgtagcaagatttccccgctcaggatggggatgggtcggaggagcc720

actctggaagtttcccgggcaagaaagtgttggcaataataataacgggctggtcaggaa780

gtagaagagaaaattaagacttagatatcctgtggaaaaagaggaataatatctactgat840

tgatgcggggagagagggaagcctggaaagatcggaggtgaaagtaaaactgagatttga900

aggtagaggtgtggagggcctgtgaactctatgcagatgacaaatgtcaaaaaagtgcag960

ttgcttttcagggagagaataagtgtcctaaaaaagagacagccaattcctctgtcttcc1020

aaagttccgtgaaatagaattacacaattttgcttaatggtagaatattccatgtatcta1080

ttaaaatcaacaaaaggccgggcgcagtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggag1140

gccgaggcgggtggatcacctgaggagttcaagaccagcctggcaaacatggtgaaaccc1200

tgtttctactaaaaaaaaaaaaaaaaaattagctgggcatggtggtgcatgcctgtaatt1260

gcagctactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccgggaggccgaggttgcag1320

tgagctgagattgcgccattgcactccagcctgggtgacaagagcgaagctccgtctcaa1380

aaaaaaaaaaaaaattaaaaaaaatcaacaaaagacttaaaaaaaaaagactacactgtt1440

agcatttcagaaccaccttagtgtaatgatgatagctcattgtggtactaagaagacagg1500

ggttatagtcttatttctggaaaagaaattaataaagtggcatgcttagttaaaatatat1560

ataaccacatgcaagtactaaaatgccactgtataaatacaatacaaattgtaaaagaaa1620

acatgctttttaaattagagcaagtataatagcctgtgaaataaatgtcaccctctagag1680

ttgttcagtgcacaagctgcacaactttacatgggccttcagtagaggtttccattttat1740

gtgaggttttgtaaactgggagatgatttttccagtagtgtggcaatagtacaatctgcc1800

tttcttccctgattctgtgtgcactggtcctatttacaaagtaatataaaaatcaaaagg1860

cttggccagacgcggtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcgggc1920

agatgacctgaggtcaggagtttgagaccagcctgagcaacatggtgaaaccctgtctct1980

actaaaaatacaaaaactagccgggcgtggtggtgggcacctgtaatcccagctactcag2040

gaggctgagacgtgggactcgcttaaacccaggaggcagaggttgcagtgaactgagatc2100

gtgccactgcactccagcctgggtgacaaagtgagactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaa2160

aaaaaaattaaaatcctttgtcttgaatggattatgggatcagagtttcatcaggactcc2220

taattaccatatgctttcctattctagcatcttccatttctgtccatacagtcattgcaa2280

gtgatctatttatattatagtaggcaattatagagatttccacatatttgtagctatccc2340

atccatttctgtagccaaatattctgaagcttcaaggagatctttgtcttatctccaacc2400

cagtcccatttttgccctttgaattgcttctgtctgctgtaattttagccttcttttgtc2460

agtaaagcttatctccttattatctgaggtctttacaaaagtccatggaatgtttacctg2520

ggcctttaggctcatgttcctggtcatataaagaggagcacctttctctaaaaggacctc2580

ttctcagcctaaacaatctctaacatcttgccactatttgcattttccagggtccacact2640

tgtgattctcaatggagagtgaaaacgcagattcataatgaaaactagcccccgtcggcc2700

actgattctcaaaagacggaggctgccccttcctgttcaaaatgccccaagtgaaacatc2760

agaggaggaacctaagagatcccctgcccaacaggagtctaatcaagcagaggcctccaa2820

ggaagtggcagagtccaactcttgcaagtttccagctgggatcaagattattaaccaccc2880

caccatgcccaacacgcaagtagtggccatccccaacaatgctaatattcacagcatcat2940

cacagcactgactgccaagggaaaagagagtggcagtagtgggcccaacaaattcatcct3000

catcagctgtgggggagccccaactcagcctccaggactccggcctcaaacccaaaccag3060

ctatgatgccaaaaggacagaagtgaccctggagaccttgggaccaaaacctgcagctag3120

ggatgtgaatcttcctagaccacctggagccctttgcgagcagaaacgggagacctgtgg3180

tatgtggtcttccagggaaaggggtgagggagcccagcctttcctctgtagtggcaaggt3240

gtgtagtcagtcttgatgcttacaacagtcaggcttctggccgagcacagtggctcatcc3300

ctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcggatcacttgaggtcagcagtttgg3360

actagcctggccaacatggtgaaacccgtctctactaaaaatataaaaaaactagccgag3420

cgtggtggcacacgtctgtagtcccagctactctggaggctgaggcaggagaatcgctga3480

acctgggaggtggaggttgcagtgagctgagattatgccactgcactccagcctggccac3540

agagggagactctgtctcaaaaaaaaaaataaaaatgaaaaaagaaggggtctcaaaaat3600

aaataaatgaagaaggggtctcactatgttgcccaggctggtctcggactcctgagctca3660

agggatccaaccatatgggcctcccaaggtgctgggattataggcatgaacgacagcgcc3720

tgacttcattttccttcttttttttttttttttttttgagatggagtcttgctctgttgc3780

ccaagctgtagtgcagtggtgcaatctcagctcactgcaatctccaccttctgggttcaa3840

gtgattctcctgcctcagccttctgagtagctgggattacaggcacccgccaccacacct3900

ggctaattttggtattttttagtagagacaggggtttgccatgttagccaggttggtctt3960

gaactcctgacctcaggtgattcgcccacctcggcctcccaaagtgctgggattacaggt4020

gtgagccactgcgcctggcctcattttccttcttgataaaggagaaaactgaagcaagag4080

gaggaaaatgactttttctttagagatgcggtctcgcactgtcacccaggctagagtgca4140

gtggcgcaatcacggctcactctagcctcgaatgcctggactcaagccattctcccacat4200

cagcctcccaagtagctgggactataggcatgcaccatcattcccagttaattttttttt4260

tctttttgcagagatggggtcccactatattgcccaggctgaaaagtgacttttttggtg4320

tgcatatctcaataattcttttgtaagcctgccttgattgatctctaaggctcagtgtgg4380

ctcagcttgaaatgcaatttgaactatgctcctaaatttgtcctgaaatgcataatgggg4440

cagagtaacttagagccacaatagattcagcatgtgttctccgtccctaaaggcagaggt4500

cttggacaagtgatccctagccaccaattctttcttttttattttttatttttctgagac4560

agagtctcactcaggctggagtgtagtggcgcaatgttggctcactgcagccttcgtctc4620

ccgggttcgagcaattctcctgtctcagcctcctgagtagctgggactacaggcgtgtgc4680

caccacacccagctaattttgtatttttagtagagacgaggtttcaccatgttggccagg4740

ctggtcttgaactcctgacctcaggagatccacccgcctcgccctcccaaagtgctagga4800

ttacaggtgtgagccactgcacccggcctgctagccaccaattctgatggacacacctgg4860

gcatctgatgaggcagctaagtggggtgttggattattttccctctagcagatggtgagg4920

cagcaggctgcactatcaacaatagcctatccaacatccagtggcttcgaaagatgagtt4980

ctgatggactgggctcccgcagcatcaagcaagagatggaggaaaaggagaattgtcacc5040

tggagcagcgacaggttaaggtgaattgttccgtccctcactaaagaaatcagatccagt5100

gtagggaattcctaggtagggaaatggatcaagtggcctgatggaccagaatttccaagt5160

tctggtattagctctccacttcatgctattctgcataacttttgagctatttttctgcct5220

gggatcttttctctcccatctgtgaaatttccttgagggcagagtcccttggtcactctg5280

tattccagccagcactgggtttagtattttgtccttagtaggtattcaggaaatgattaa5340

gaggtcttcattttgggaatccacctgaactttaaagatgcttcccaacagtatgaacag5400

tatgaattgaatagaatacaacaagttaattttattagaagatataatattaatagcaga5460

taaagtcagttatatatatacacgtatatatattttttttttttaagacagcgtcttgct5520

ctgttgcccaggctggagcgcaatggtgcagtcatggctctctgcagcctcgacctccag5580

ggctcaactgatccttctacctcagtcttccaagtagctgggacttgccagcttggtgca5640

tgccaccatgcccagctaatttttgtattttttgtagagatggggtttcgctatgttgcc5700

caggctgatttcaactcctgggctctagtgatcctcctgcctcagcctcccaaagggctg5760

ggattacaggcgtgaaccaccagcctggcctagatacgaattttaaatacttctctagca5820

atcaaaattgatctaacccaattgtgtagtctgggtttttttcccacagttaccaatata5880

acacatctagattctattgtatatatgtgtaaatcactcattcaacctttattttctttt5940

ttttctcaacttttattttaggttcagggggtacatgtgcaggtgtgttacatgggtata6000

ttgtgtgtcgctggggtttagtgtacaaatgattttgtcacccaggtagtgagtatagta6060

cctgctaggtagtttttctgtctccccctcctcccactctccaccctcaagaaggccctg6120

gtgtctagtgttcccttcttcatatccatgtgtgctcaatgtttagctcctgcttttttt6180

ttttttttttttttttttgagacgtagtctttctctgtctcctaggctggagtgcagtgc6240

tgcgatttcagctcactgctacctccacctcccaggtcaagtgattctcctgcctcagac6300

ttctgagtagctgggattacaggtgcccgctgccacgcccggctaatttttgtattttta6360

gtagagatggggtttcactatgttggccaggctggtcttgaactcctgacctcgtgatcc6420

acctgccttggccttccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgcgcccggcctct6480

ttttttttctttttgagacggattctctctttgttgccaggctggagtgcagtggcacaa6540

tctctgctcactgaaacctctgcatcccaggttcaagtgattctcctgcctcagcctccc6600

gagtagctgggactataggcgcccgccaccacgcccggctaatttttttatttttagtag6660

agatggggtttcaccatggtggccaggatggtctcaatctcttgacctcgtcatccaccc6720

gcctcagcctcccaaagtgttgggattacaggcgtgagccaccgtacccagcctagttcc6780

tacttataagtgagaacatgcaatatttggttttctgttcctgcattaaatcgcttagga6840

tcatagcctccagctcaacaatctttaaaagtgaaaatttggccaggcgcgataactcat6900

gcttgtaatcacagcactttgggaggccaaggtgagtggatcacctgacgtcgggagttc6960

cagaccagcctgaccccgcctctactagcaatacaaaattagctgggtgcagtagtacat7020

gcctataatcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggca7080

gagcttgcggtgagccaagatcgtgccattacactccaacctgggcaacaaaagtgaaac7140

tctgtctcaaaaaaaaaaaaaaagtgaaaatttacatgcgtgtatatgtaagtaaatatt7200

aattgtgctatatacataaaatttgtgtactttagaaagtaatatctccaattttaaaaa7260

tgtgaatgagaccgggcatagcggctgacaattgtaatcccagcactttgggaggccaag7320

gtgggcagattgcttgagcccgtaagttctaggccagcctgggcaacatagcaaaatcct7380

ggtctctactactaaaaatacgaaaaaaaaaaaaaaaatcgccaggcgcaatggctcatg7440

cctgtaatcccatcactctgggaggccaaggtgggtggatcacctgaggtcaggagttcg7500

agactagcctggccaatatggtaaaccccatctctactaaaaatacaaaaaaagtagctg7560

ggcgtggtggcaggcacctgtaatctcagctacttgggaggctgcagcaggagaatcgct7620

tgaacccaggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtaccattgtactccagcctggg7680

caacaagagtgaaactccatctcaaaaaaaaaaaaaaaattagctgggcgtggtggtgta7740

tgcctgtagtcccagctacttggaggctgagacaggaggatcacctgagcctgggaaggt7800

caaggctgcagtgagctgtgatccagccactgcacgctatcctgggtgacacagtgagac7860

cctgtctcaaaaaaagaaaaagaaatgtgattgatcagctctttgcctaaaacttagcta7920

actgtgtgctttgcagacattgtctgactcatagtcttgagaatgtttctctcatacaaa7980

cattgaaatgagatgcgtttattcacagcacatcaggaacagaaatgggactaagaccta8040

ggtttctagacccaaaagtctgaaaaacgggcgtggttttagtgtaacatcaatgctttg8100

agaatcaaagtacatactcaaactttcctaagaaatttcaactggaagggactggatttt8160

ctccaaattcaacaaaatgatggatgacaaaaccagtttcttattggctagggtctaggc8220

tagatcatctccaagattcttcccaactctaaaattttattctatgagatagtggtctca8280

gatgagtttgtttctagaccgtcctatgggataaaggtttctctagatgttcttcaaggg8340

cttgggttgggggtgcttctcatgaactctttcatgtcattccctgtgtcataaccctca8400

ggttgaggagccttcgagaccatcagcgtcctggcagaactctgtgtctgagcggccacc8460

ctactcttacatggccatgatacaattcgccatcaacagcactgagaggaagcgcatgac8520

tttgaaagacatctatacgtggattgaggaccactttccctactttaagcacattgccaa8580

gccaggctggaaggtaatgtgtcccacagcaaccaaaatcaaggtcagcccagcctgaca8640

gtctctccagtgctgtactgcaacttgtatctgggacagcagttaagtgcaaaggacact8700

agaatgataaacaaatgtatcttttagattgtgactcaatcttattgaatccaggcaaaa8760

tcattaagaagagctccttaactacttcatgtgttactacctaaagtccatggagggtct8820

tcaatgtagcactcaagcccacttttctgctacactcaacagccgtcctagatgccagca8880

gctagagtggctaagtagttttatgaaaatgtcttgattaaaaaaaaaaatgctgtctgt8940

gagcctcatgacccaagatgtcatctcctgtagcgtcacatagcatttctagtgggcagg9000

ggttttcctttcacttcattcatggaaagaccgagatgcctgtgagtcaacatagctcac9060

gcagttggtcggtgtcagagccacaaatgaggtcttctgacgggtgctcaattccaagtc9120

aagtgtgctttgttttcctcatggtagaactctttcttttttttttttttttttttgaga9180

cagagtctcgctctgtcacccaggctggagtgcaatggcagatctcaggtcactgcaacc9240

tcctccgcctccaaggttcaagcgattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggacta9300

caggcatgcgccaccacgcctggctaatttttttgtatttttagtagagacagtgtttca9360

ccatgttggtcaggctggtctcgaactcctaacctcaaatgatccacccgtctcgacctc9420

ccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccacacctggcccctcatggtagaactatg9480

ttttttttttttttgagatggagtctcgctctgtcacccaggctggagtgcagtggcgcg9540

atctcggctcactgcaagctccgcctcctgggttcacgccattctcctgcctcagcttcc9600

cgagtagctgggactacaggcgcccgccactacgcctggctaattcatggtagaactttt9660

aattttactcccttccatcagcttactttcctagttttttgtttgtttgttttttgagac9720

agggtctcaccctgttgcctgggctggagtgcagcctcagccccctgggctcaagctctt9780

ccctcctcaacatcccaagtagctgggataacaggtgcaccaccacagtccgctaatttt9840

ttttttgtagagacagttgcccaggctggttactatgttgcccaggctggtctgaactcc9900

tagtctcaagcactcctcctgccttagcctctcagtgcactgtgattacaggcgtgagcc9960

accacacccagccttaatttcctagtttcttgtttgtttgtttgagacggggcctcactc10020

tgtcacccaggctggagtgcagtgacatgatcttggctaacttcaacctctgcctcccag10080

gttcaagtgattcccctgcctcagcctcccgagtagctgggactaaaggcatgcgccacc10140

atgcctggctaatttttatatttttgatagagacagggtttcaccatgtttgctaggctg10200

gtctcaaactcctggcctcaagtgatccactcaccttggcctcccacagtgctgggatta10260

taggcgtgagccaccacgccgggcctaattccctagtttcttaatttctctgagccacct10320

ttcttgctattgatcactacctcacagccttactctgcttttctagcccctgacagctat10380

ctaggtcttttctttatcacaatctaaggttggcatcagtctttattcccgtagaataga10440

tgggtttatggctgaaggtgacggctctgcggtgtggagtgtcaggagagttgccaagag10500

ggctgcaaagacaccagacgaagcctgtgctgagcacagtgggaggggcctgaggctggt10560

ttccccatgtgtttgaagggtgatgtttctgaatctaaagtagctgataaccagttgtct10620

tgctcttcttccagaactccatccgccacaacctttccctgcacgacatgtttgtccggg10680

agacgtctgccaatggcaaggtctccttctggaccattcaccccagtgccaaccgctact10740

tgacattggaccaggtgtttaaggtgaatgccctgctttcctctaaatagggcctaagtt10800

ggaggttgtcatagccatctcaaaaggaaacaagttctgctagtgatgctttcatttgat10860

caggggagagttagaagccagccacccaattagtgacttgcacaaaacccagtgaattaa10920

gtacacttgacaaataccaaatgacacatttttgtgccagaccagagcaaggagaaggct10980

gttctgacccaacagaaagggctccccagggcagtgttttcctaacttccctgtgaatgg11040

gaattgcctgggacattgttaaaacacagcttcccagacccctctcttggggctcttgat11100

ttagtgcttctgggatgggcccaggaatttgtatttttagcaagcatctcaggtgattct11160

tacaagaaattctgggaatgcttgctctaaaaaaagcccttcctgctgggtgtggtggct11220

cacgtctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcaggtggatcacctaaggtcgggag11280

ttggagaccagcctgaccaacatggagaaactccgtctctactaaaaatacaaaaattag11340

ctgggtgtggtggcgcatgcctgtaatcccagctacttgggaggctgaggcaggagaatc11400

ccttgaacccaggaggcggtggttgtggagagctgaaatcgcaccattgcactccagcct11460

gggcaataagagtgaaagtctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcctgcct11520

taggctggagaccagaagctgagctaccagaacgtcttttcagaaagaagttattttggt11580

ttttcagagtgcccataaggctgctggtagctgtaaccattctcctgggaggggcagttg11640

tctggggtgtcttttgtcatcagtcaggaataagtgtttttcccaatccggtcaaattga11700

ccacgttggtggtaacttcatctcatttctctcccacaatgcctggccgccaccagccac11760

tggacccagggtctccacaattgcccgagcacttggaatcagtaaggttctttccctctg11820

gctcggggcttggccttgttttcctttcactgctcagcatggctttagtggacagagaca11880

agatgtgatgtggggaagggtccctatggccatgttttgtctaggtgccagccctagaca11940

cagaacaccctgagggtcaggcacacacccacttccctccccttccatgggcatcacaag12000

ggcacactgagcagagcagggcacagcaggggagcatgctgcagcagccacaagcgcatg12060

gcaccagcctcaggggcggcagttcgttcgctcacttttgtgcctagcttttctttgcca12120

cgcatatagctacctgctctggcatcccccaggggtgttgaggacacgtgggtgaagcgg12180

tagtgccactctgccatcatgtgtctgtaggccacccacctgcccactcatcacagtttt12240

ggagactgctcgcctacgtccatcccctcaggttggcctcctctctctgggctgtcatta12300

actcaagcacacaccaccagagcagctggtggggttttgccatcccctctttaccttatt12360

gtgttaacataggtttctttctctccccatctgccacaagcagcagcagaaacgaccgaa12420

tccagagctccgccggaacatgaccatcaaaaccgaactccccctgggcgcacgttagta12480

tgggagagtgggccttgggcctggtccttgttctggggccatatctttagggaaccagac12540

tctgggattctgttcccacctcaaagggatctgagcccagagaaggagagcaaagctcct12600

ggggctgagaaggggtgtactccagtccccctgctcctgatctctcgtgtttcctcctag12660

ggcggaagatgaagccactgctaccacgggtcagctcatacctggtacctatccagttcc12720

cggtgaaccagtcactggtgttgcagccctcggtgaaggtgccattgcccctggcggctt12780

ccctcatgagctcagagcttgcccgccatagcaagcgagtccgcattgcccccaaggtgg12840

gtgtcctattttcctctgaagagagattctggccaattaagaatgttggaccttcagctt12900

gcaaagcactctgataagtgttccttgagagcttataaatctagttgggtagaaaaggca12960

taaaaacatagggaagtgtaatagcattagaagagctaaaaaggtatttggattacaatg13020

taagtggtgtcagaaggcccataaatacctgatgagcttgtaagaattcagacaaaagtg13080

attgtgatagatgggctaggattattaaggaagatacacaagggaggcaggccttagaaa13140

gagatggatttggccgggcgctgtggcttacacctgtaatcccagcactttgggaggcca13200

aggcaggtggatcatgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacgtggcgaaacccc13260

gtctctactaaaaaatacaaaaattagctgggcttggtggcacatgcctgtaatcccagc13320

tacttgggaggctgaggctggagaatcacatgagcccaggaagggaagttgcagtgagcc13380

gagatcactgcactccagcctgggtgacagagcgagactctgtctcaaaaaaaaaaaaag13440

aaaagaaagaagtggatttgaggctagacgctgtgggtctcacttgtaatcccgacactt13500

tgggaggccgaggcaggggtattgcttacagccaagagttcgagaccagcctgggcaaca13560

tagcaagaccccagtctctgctaaaaatgcaaaaaaaaaaattagccacggtggtagtac13620

atgcctgtggtaccagctactcaggaggctgaggcagaaggatcacttgagtccaggagg13680

ttgaggctgcagtgagccctgtttgcaccactgcactccagcctgggcaacagtgaggcc13740

ctgtctcaaaaaagaaaagaaaaaaagtagatttgggtaagcaaacaggtgtagagagag13800

catgctaatgggcagtgccatggaggcgggaaatgcagttcgtacctggcagtagtaaag13860

tgactgggtcagactaactcagggtttctcaagtactattcacgttgacagctggagaat13920

tctttgttgggcgtgggagggactgtcctgtgcactgaagggtgtttagcagtatccctt13980

gttttccccactagacgccagtagcacccaccacaggcgcggcaatccaaatgcctccag14040

acattgccaaatgtcccctggcagggagggaatcacccctgcttgagtatcactggtcta14100

gcttgaggggaaggtgagaagggtaaattcagagccaacttggatcagccatcagatctg14160

cacttaacactgttaaagggttctgtgagtacgggctgacatgtaaccaaagtgaaaagc14220

ttcccccatccccttcagagagatgaaaatagcatagagtctggagtttagagcgacttg14280

ggtttgctttttttttaatatataaaatcttttaggccatgcacagtggctcacacctat14340

aatcctagtattttgggaggccaaggcaggaggatcacttgaggccaggagttcaagacc14400

agcctgggcagcaaagtaagaccctgtctgtaacaaaaaaaaaaaaatttttttttaatt14460

agccaggcattttcatgtatacctgttgtcccagccacttgggaggctgaggcagaagga14520

ttacttgagctccagagctggaggctgcaatgagctataatcgtgccactgcattctagc14580

ttaggcaacaaaatgagaccctgtctctaaaaaacattttctttaattataaataaaaca14640

tattacacacaaaattataccacacatacataatttagcgtaaattcattcatgtggccg14700

tagcatgtgccctgtttgggttttcatgcagtgggttttctcccctttcctttttggctc14760

cctctccaccctaccatcacccacatcacccctactcccaagataactggttgataattt14820

atgatgctttcttgcatattttatcaatgctcttagttatactatacatgtatagcgata14880

gccattttatatgtacacatacaacacacagaacattgataatgtaatcatgttgtgcat14940

acttctctacatgtctctttttttttttttttttcctgagacggagtctcactctgtcgc15000

ccaggctggagtgcaatggcatgatcttggctcactgcaacctccgcctcctgggttcaa15060

gcgattctcctgcctcggcctcctgagtagctgcgatcacaggcgcacgtcaccacgccc15120

agctaatttttgtatttttagtagagatggggtttcaccatgttggtcaggctggtctcg15180

agctcctgacctcatgatccgcctgccttggcctcccaaagtgttgagattacaggaatg15240

acccaccacgcccagcctctacatgtctctaactcaacaatgcctcatggaatttcttcc15300

aagtcacttggcatagtcctaattcattattttttagtgtccatgtaatattccatgatg15360

tggctacaccacagatttttcagccattccacttttatggacagattctgtttctcaaat15420

tttgcccaatgaacgacactgcaataaatatgtttgcaaggatctctcttactagtgctt15480

tcatttctctaggatagagtcccagatgtgagattgttgggtgagaaggtattttaaatt15540

ctactaaatattgctagattgctttccaaaaaagctatgataagtcatgtttaaaccagc15600

aatatatgataagatctatatctttgccagcaattggtattattagtctgtttaatatct15660

gccaatctaatatgtataggttatatcttcttaattttttaaaatgttttatttatttat15720

ttttaaattttttatttccataggtttttggggaacaggtggtgtttggttacatgagta15780

agttctttagtggcgatctgcgagattttggtacacccatcaccagcttgtttaatttta15840

tctttctttgtttatcagtaagtctgagcaccttgtcattatgtttggtgacttggaatt15900

gtcctctatgaattggttatttatgaacattgcccatttttatataggttttgttatcaa15960

tttgtgagagctctttttttttttttttgagacggagtcttgctctgtcacccaggctgg16020

agtgcagtggcgtgatctcagctcactgcagactctgcctcctgggttcaagcgattctc16080

ctgcctcagcctcccaagtagctgggattacaggcgcccaccactgcgcccagctaattt16140

ttgtattttttagtagagacagggtttcaccatcttggccaggctggtcacgaactcctg16200

acctcatgatccacccacctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcataagccacca16260

cgcccagcctgtgagagttttttttttttttgagatggagtcttgctatgtcacccaggc16320

tgaagtacagtggtgtgatcttggcaacctctgcctcccgggttcaagcaattctcgtgc16380

ctcagcctcccgagtagctgggattacaggtgcatgccaccacgcccggctaattttgta16440

tttttagtagagacaaggtttcaccatgttggtcaggctggtctcgaacttctgacctca16500

ggtgatctgcctgccttggcctcccaaagtgctggattacaggcgtgagccaccgcaccc16560

agccccctgtgagagctctttgttgttaaaataatcttctttcttttatgctgaagatat16620

ttttctacttctattgtttatctctttactttcctttcttttcttttctgagacaggatc16680

ttgctatgttgcctagtctggagtgcagtggtgtaatgaaggctcactacatccttgacc16740

tcccaggctcaagtgatcttcccacctcagcctcccacctgtagctggaactacaggtgc16800

atgccaccacatccagctaattaaaaaaaatttttttgtagagatgggatctcactatgt16860

tgctcaggctggtctcaaactggcctcagtgtcttgcagtgctgggattacaggcattgt16920

ttgttgtttcttaactttgtttatggtatctcttgccacagtaaaattttaaagttttat16980

gtagtcaaatgtctctcttctcttttacagtttctgggtttccagtcttggttaagaagg17040

tcacccgcaccctcagattgtatatgtagtctcctagattctctttcaggatttgtatga17100

ttttaaggttttcattttttttttaaagccagtcaaatttagcagttgggggttgtgtac17160

caactttagtgacaataatgtcactacccgctaccatcagagcagcctaaggttcttatt17220

ttcatgcattaaatctttgtatacagtgtaagacaagcatgcaattttatttcctctcgg17280

atgaatgctattataattatgccactacatactacatacccgcatcttttacccccagaa17340

ttgaactaccaacttcaacatacatcgtattctcatatttaatagattttaagacttcaa17400

aacgacacaaagaggatcagaacccgtatgtgatatttttgtgcgtcctgtctggtgacc17460

gttggttcaccttatctctgtttccctttcaggtgctgctagctgaggaggggatagctc17520

ctctttcttctgcaggaccagggaaagaggagaaactcctgtttggagaagggttttctc17580

ctttgcttccagttcagactatcaaggaggaagaaatccagcctggggaggaaatgccac17640

acttagcgagacccatcaaagtggagagccctcccttggaagagtggccctccccggccc17700

catctttcaaagaggaatcatctcactcctgggaggattcgtcccaatctcccaccccaa17760

gacccaagaagtcctacagtgggcttaggtccccaacccggtgtgtctcggaaatgcttg17820

tgattcaacacagggagaggagggagaggagccggtctcggagaaaacagcatctactgc17880

ctccctgtgtggatgagccggagctgctcttctcagaggggcccagtacttcccgctggg17940

ccgcagagctcccgttcccagcagactcctctgaccctgcctcccagctcagctactccc18000

aggaagtgggaggaccttttaagacacccattaaggaaacgctgcccatctcctccaccc18060

cgagcaaatctgtcctccccagaacccctgaatcctggaggctcacgcccccagccaaag18120

tagggggactggatttcagcccagtacaaacctcccagggtgcctctgaccccttgcctg18180

accccctggggctgatggatctcagcaccactcccttgcaaagtgctcccccccttgaat18240

caccgcaaaggctcctcagttcagaacccttagacctcatctccgtcccctttggcaact18300

cttctccctcagatatagacgtccccaagccaggctccccggagccacaggtttctggcc18360

ttgcagccaatcgttctctgacagaaggcctggtcctggacacaatgaatgacagcctca18420

gcaagatcctgctggacatcagctttcctggcctggacgaggacccactgggccctgaca18480

acatcaactggtcccagtttattcctgagctacagtagagccctgcccttgcccctgtgc18540

tcaagctgtccaccatcccgggcactccaaggctcagtgcaccccaagcctctgagtgag18600

gacagcaggcagggactgttctgctcctcatagctccctgctgcctgattatgcaaaagt18660

agcagtcacaccctagccactgctgggaccttgtgttccccaagagtatctgattcctct18720

gctgtccctgccaggagctgaagggtgggaacaacaaaggcaatggtgaaaagagattag18780

gaaccccccagcctgtttccattctctgcccagcagtctcttaccttccctgatctttgc18840

agggtggtccgtgtaaatagtataaattctccaaattatcctctaattataaatgtaagc18900

ttatttccttagatcattatccagagactgccagaaggtgggtaggatgacctggggttt18960

caattgacttctgttccttgcttttagttttgatagaagggaagacctgcagtgcacggt19020

ttcttccaggctgaggtacctggatcttgggttcttcactgcagggacccagacaagtgg19080

atctgcttgccagagtcctttttgcccctccctgccacctccccgtgtttccaagtcagc19140

tttcctgcaagaagaaatcctggttaaaaaagtcttttgtattgggtcaggagttgaatt19200

tggggtgggaggatggatgcaactgaagcagagtgtgggtgcccagatgtgcgctattag19260

atgtttctctgataatgtccccaatcataccagggagactggcattgacgagaactcagg19320

tggaggcttgagaaggccgaaagggcccctgacctgcctggcttccttagcttgcccctc19380

agctttgcaaagagccaccctaggccccagctgaccgcatgggtgtgagccagcttgaga19440

acactaactactcaataaaagcgaaggtggacatg19475

<210>2

<211>1574

<212>prt

<213>人源

<400>2

metlysthrserproargargproleuileleulysargargargleu

151015

proleuprovalglnasnalaprosergluthrserglugluglupro

202530

lysargserproalaglnglngluserasnglnalaglualaserlys

354045

gluvalalagluserasnsercyslyspheproalaglyilelysile

505560

ileasnhisprothrmetproasnthrglnvalvalalaileproasn

65707580

asnalaasnilehisserileilethralaleuthralalysglylys

859095

gluserglyserserglyproasnlyspheileleuilesercysgly

100105110

glyalaprothrglnproproglyleuargproglnthrglnthrser

115120125

tyraspalalysargthrgluvalthrleugluthrleuglyprolys

130135140

proalaalaargaspvalasnleuproargproproglyalaleucys

145150155160

gluglnlysarggluthrcysaspglyglualaalaglycysthrile

165170175

asnasnserleuserasnileglntrpleuarglysmetserserasp

180185190

glyleuglyserargserilelysglnglumetgluglulysgluasn

195200205

cyshisleugluglnargglnvallysvalglugluproserargpro

210215220

seralasertrpglnasnservalsergluargproprotyrsertyr

225230235240

metalametileglnphealaileasnserthrgluarglysargmet

245250255

thrleulysaspiletyrthrtrpilegluasphispheprotyrphe

260265270

lyshisilealalysproglytrplysasnserilearghisasnleu

275280285

serleuhisaspmetphevalarggluthrseralaasnglylysval

290295300

serphetrpthrilehisproseralaasnargtyrleuthrleuasp

305310315320

glnvalphelysglnglnglnlysargproasnprogluleuargarg

325330335

asnmetthrilelysthrgluleuproleuglyalaargarglysmet

340345350

lysproleuleuproargvalsersertyrleuvalproileglnphe

355360365

provalasnglnserleuvalleuglnproservallysvalproleu

370375380

proleualaalaserleumetsersergluleualaarghisserlys

385390395400

argvalargilealaprolysvalleuleualaglugluglyileala

405410415

proleuserseralaglyproglylysgluglulysleuleuphegly

420425430

gluglypheserproleuleuprovalglnthrilelysglugluglu

435440445

ileglnproglygluglumetprohisleualaargproilelysval

450455460

gluserproproleugluglutrpproserproalaproserphelys

465470475480

glugluserserhissertrpgluaspserserglnserprothrpro

485490495

argprolyslyssertyrserglyleuargserprothrargcysval

500505510

serglumetleuvalileglnhisarggluargarggluargserarg

515520525

serargarglysglnhisleuleuproprocysvalaspgluproglu

530535540

leuleuphesergluglyproserthrserargtrpalaalagluleu

545550555560

propheproalaaspserseraspproalaserglnleusertyrser

565570575

glngluvalglyglyprophelysthrproilelysgluthrleupro

580585590

ileserserthrproserlysservalleuproargthrprogluser

595600605

trpargleuthrproproalalysvalglyglyleuasppheserpro

610615620

valglnthrserglnglyalaseraspproleuproaspproleugly

625630635640

leumetaspleuserthrthrproleuglnseralaproproleuglu

645650655

serproglnargleuleusersergluproleuaspleuileserval

660665670

propheglyasnserserproseraspileaspvalprolysprogly

675680685

serprogluproglnvalserglyleualaalaasnargserleuthr

690695700

gluglyleuvalleuaspthrmetasnaspserleuserlysileleu

705710715720

leuaspileserpheproglyleuaspgluaspproleuglyproasp

725730735

asnileasntrpserglnpheileprogluleuglnalaalalysala

740745750

lysalaalaalaalalysglyglyglyglyprometlysthrserpro

755760765

argargproleuileleulysargargargleuproleuprovalgln

770775780

asnalaprosergluthrsergluglugluprolysargserproala

785790795800

glnglngluserasnglnalaglualaserlysgluvalalagluser

805810815

asnsercyslyspheproalaglyilelysileileasnhisprothr

820825830

metproasnthrglnvalvalalaileproasnasnalaasnilehis

835840845

serileilethralaleuthralalysglylysgluserglyserser

850855860

glyproasnlyspheileleuilesercysglyglyalaprothrgln

865870875880

proproglyleuargproglnthrglnthrsertyraspalalysarg

885890895

thrgluvalthrleugluthrleuglyprolysproalaalaargasp

900905910

valasnleuproargproproglyalaleucysgluglnlysargglu

915920925

thrcysalaaspglyglualaalaglycysthrileasnasnserleu

930935940

serasnileglntrpleuarglysmetserseraspglyleuglyser

945950955960

argserilelysglnglumetgluglulysgluasncyshisleuglu

965970975

glnargglnvallysvalglugluproserargproseralasertrp

980985990

glnasnservalsergluargproprotyrsertyrmetalametile

99510001005

glnphealaileasnserthrgluarglysargmetthrleulys

101010151020

aspiletyrthrtrpilegluasphispheprotyrphelyshis

102510301035

ilealalysproglytrplysasnserilearghisasnleuser

104010451050

leuhisaspmetphevalarggluthrseralaasnglylysval

105510601065

serphetrpthrilehisproseralaasnargtyrleuthrleu

107010751080

aspglnvalphelysproleuaspproglyserproglnleupro

108510901095

gluhisleugluserglnglnlysargproasnprogluleuarg

110011051110

argasnmetthrilelysthrgluleuproleuglyalaargarg

111511201125

lysmetlysproleuleuproargvalsersertyrleuvalpro

113011351140

ileglnpheprovalasnglnserleuvalleuglnproserval

114511501155

lysvalproleuproleualaalaserleumetsersergluleu

116011651170

alaarghisserlysargvalargilealaprolysvalphegly

117511801185

gluglnvalvalpheglytyrmetserlysphepheserglyasp

119011951200

leuargasppheglythrproilethrserleupheasnpheile

120512101215

pheleucysleuservalleuleualaglugluglyilealapro

122012251230

leuserseralaglyproglylysgluglulysleuleuphegly

123512401245

gluglypheserproleuleuprovalglnthrilelysgluglu

125012551260

gluileglnproglygluglumetprohisleualaargproile

126512701275

lysvalgluserproproleugluglutrpproserproalapro

128012851290

serphelysglugluserserhissertrpgluaspsersergln

129513001305

serprothrproargprolyslyssertyrserglyleuargser

131013151320

prothrargcysvalserglumetleuvalileglnhisargglu

132513301335

argarggluargserargserargarglysglnhisleuleupro

134013451350

procysvalaspgluprogluleuleuphesergluglyproser

135513601365

thrserargtrpalaalagluleupropheproalaaspserser

137013751380

aspproalaserglnleusertyrserglngluvalglyglypro

138513901395

phelysthrproilelysgluthrleuproileserserthrpro

140014051410

serlysservalleuproargthrproglusertrpargleuthr

141514201425

proproalalysvalglyglyleuasppheserprovalglnthr

143014351440

serglnglyalaseraspproleuproaspproleuglyleumet

144514501455

aspleuserthrthrproleuglnseralaproproleugluser

146014651470

proglnargleuleusersergluproleuaspleuileserval

147514801485

propheglyasnserserproseraspileaspvalprolyspro

149014951500

glyserprogluproglnvalserglyleualaalaasnargser

150515101515

leuthrgluglyleuvalleuaspthrmetasnaspserleuser

152015251530

lysileleuleuaspileserpheproglyleuaspgluasppro

153515401545

leuglyproaspasnileasntrpserglnpheileprogluleu

155015551560

glnalaalalysalalysalaalaalaalalys

15651570

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgcccagcagtctcttacct20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctacccaccttctggcagtc20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gcaccgtcaaggctgagaac20

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tggtgaagacgccagtgga19