本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及copd診斷用分子標志物，具體地該分子標志物為loc100505635。

背景技術(shù)：

慢性阻塞性肺疾病(copd)，是一種破壞性的肺部疾病，是一組以不完全可逆且進行性發(fā)展的氣流受限為特征的炎癥性疾病，氣流受限通常呈進行性發(fā)展并與肺對有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，通常伴有全身及肺外的不良效應(yīng)。copd是影響人類健康的重要公共衛(wèi)生問題，目前居于全球死因的第四位。copd的發(fā)病率逐年增高，與吸煙和日益嚴重的環(huán)境污染有關(guān)，尤其在發(fā)展中國家。在我國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)40歲以上的人群，copd的發(fā)病率約8.2％。copd的發(fā)病機制尚未完全明確，吸煙是copd發(fā)生發(fā)展中最重要的致病因素，吸煙可以誘導(dǎo)肺內(nèi)大量炎癥細胞聚集，如中性粒細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞，t、b淋巴細胞等，這些炎癥細胞與上皮細胞，成纖維細胞，氣道平滑肌細胞等在吸煙及有害氣體顆粒的刺激下活化，釋放出大量細胞因子，炎癥趨化因子和蛋白酶，氧化劑，炎癥反應(yīng)及信號級聯(lián)放大，導(dǎo)致不可控氣道炎癥，小氣道破壞，肺氣腫發(fā)生。

目前copd的診斷主要依靠肺功能檢查、胸部x線檢查、胸部ct檢查等，但是肺功能檢查(肺活量測定法)，是一種費時且昂貴的規(guī)程，只能由?？品蝺?nèi)科醫(yī)師實施。但是上述方法不能有效的和其他疾病諸如哮喘、支氣管炎、肺纖維化、結(jié)核區(qū)分開來。因此尋找copd特異性的診斷方法對于疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)無蛋白編碼功能的rna。，即非編碼rna，在人類疾病中發(fā)揮重要作用。目前，研究表明長鏈非編碼rna(lncrna)具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如與細胞代謝、細胞凋亡、細胞周期、細胞黏附運動等有關(guān)，并可通過多種途徑如調(diào)節(jié)dna甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)、作為mirna的前體、mrna降解、磷酸化作用、蛋白修飾等發(fā)揮功能，正如同內(nèi)源性mirna研究已取得重要成果一樣，1ncrna在疾病診斷和治療領(lǐng)域代表了另一類重要的分子來源，其研究前景巨大。

目前針對lncrna在人類疾病中的研究仍處在起步階段，lncrna與copd的發(fā)生和/或發(fā)展的機制的關(guān)系有待進一步研究，因為lncrna在copd的發(fā)生機制中的角色尚未闡明，因此探尋lncrnacopd的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一提供一種copd診斷用標志物，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

本發(fā)明的目的之二，提供一種copd的診斷產(chǎn)品，該產(chǎn)品能夠?qū)崿F(xiàn)copd的早期診斷，且具有較高的靈敏度和特異性。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測樣本中l(wèi)oc100505635表達水平的試劑在制備診斷copd產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，loc100505635在copd患者中表達上調(diào)。

進一步，所述試劑包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測loc100505635基因表達水平的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，上述列舉的檢測方法只是用來對本發(fā)明的方案進行說明，而不是限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本領(lǐng)域常用的任何手段來進行基因表達水平的檢測，所述手段不是本發(fā)明的重要組成部分。

進一步，所述用實時定量pcr檢測loc100505635基因表達水平的試劑至少包括一對特異性擴增loc100505635基因的引物。

進一步，所述特異性擴增loc100505635基因的引物序列如seqidno.2～3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷copd的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括檢測loc100505635表達水平的試劑，其中所述產(chǎn)品包括(但不限于)芯片、試劑盒、制劑。

進一步，所述試劑選自：

特異性識別loc100505635的探針；或

特異性擴增loc100505635的引物。

進一步，所述特異性擴增loc100505635的引物序列如seqidno.2～3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷copd的試劑盒，所述試劑盒包括測定人血液樣本中l(wèi)oc100505635的表達水平的試劑，其中高于loc100505635參照水平的loc100505635水平指示copd。

進一步，所述試劑包括特異性擴增loc100505635的引物，優(yōu)選的所述引物序列如seqidno.2～3所示。

進一步，所述試劑盒還包括包含sybrgreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系、用于擴增管家基因的引物對；所述sybrgreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系包含：pcr緩沖液、dntps、sybrgreen熒光染料。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明的試劑盒還包括檢測一種或多種其他copd標志物的試劑，任選的與試劑盒的說明書在一起。

本發(fā)明中的試劑盒包括一種或多種無菌容器，這樣的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝、或本領(lǐng)域已知的其它合適的容器形式。這樣的容器可以由塑料、玻璃、層壓紙、金屬箔、或適于容器藥物的其它材料。

在本發(fā)明中，術(shù)語“樣本”是指出于體外評估目的自個體獲得的生物學(xué)樣本，本發(fā)明中樣本或患者樣本可以包括任何體液。優(yōu)選的樣本是血液，諸如血清、血漿或全血。

在本發(fā)明中，參照樣本是自表觀健康個體的參照群提供的、用于體外評估目的的生物樣本。如本發(fā)明所使用的，“參照水平”指在表觀健康個體的參照群中建立的值。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在進行測量結(jié)果與參照濃度比較時，參照濃度可以使用陰性參照樣本、陽性參照樣本、或包括一種或超過一種這些類型對照的混合參照樣本來測定。陰性參照樣本優(yōu)選會包括來自不吸煙者、沒有診斷copd的的對照吸煙者或其他。陽性參照樣本優(yōu)選會包括來自有診斷copd的受試者的樣本。

表述“將測定得到的濃度與參照濃度比較”僅僅用于進一步例示對熟練技術(shù)人員顯而易見的內(nèi)容。在對照樣本中建立參照濃度。對照樣本可以是內(nèi)部或外部對照樣本。在一個實施方案中，使用內(nèi)部對照樣本，即在測試樣本中以及在自同一受試者采集的一份或多份其它樣本中評估標志物水平以確定所述標志物的水平是否存在任何變化。在另一個實施方案中，使用外部對照樣本。對于外部對照樣本，將自個體衍生的樣本中標志物的存在或量與其在已知患有給定狀況或已知有給定狀況風(fēng)險的個體或已知沒有給定狀況的個體(即“正常個體”)中的存在或量比較。例如，可以將患者樣本中的標志物水平與已知與特定copd過程相關(guān)的水平比較。通常，直接或間接地將樣本的標志物水平與診斷關(guān)聯(lián)起來，而且例如使用標志物水平來確定個體是否有copd風(fēng)險。或者，例如，可以將樣本的標志物水平同已知與copd患者中對治療的響應(yīng)、copd的診斷、選擇針對copd的適宜藥物的指導(dǎo)、判斷疾病進展風(fēng)險、或跟蹤copd患者相關(guān)的標志物水平比較。根據(jù)目的診斷用途，選擇適宜的對照樣本并在它們中為標志物建立對照或參照值。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在一個實施方案中，自年齡匹配的且沒有混淆疾病的參照群體獲得此類對照樣本。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在對照樣本中建立的絕對標志物值會依賴于所使用的測定法。優(yōu)選使用來自100名表征較好的個體(來自適宜參照群體)的樣本來建立對照(參照)值。還優(yōu)選參照群體可以選擇成由20、30、50、200、500或1000名個體組成。健康個體代表用于建立對照值的一種優(yōu)選參照群體。

“分子標志物”也稱為“生物標志物”，是在組織或細胞中的表達水平與正?；蚪】导毎蚪M織的表達水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。在本發(fā)明中，loc100505635可以與其他一種或多種copd的分子標志物組成標志物組應(yīng)用于copd的診斷，某些標志物組合在篩選copd中會是有利的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，有多種方式使用兩種或多種標志物的測量來改進調(diào)查中的診斷問題。

生物標志物可以個別測定，或者同時測定，例如使用芯片琥珀基于珠的陣列技術(shù)。然后獨立解讀生物標志物的表達水平，例如使用每種標志物的個別截留，或者它們的組合進行解讀。

在本發(fā)明中，可以以不同方式實施和實現(xiàn)將標志物水平與某種可能性或風(fēng)險關(guān)聯(lián)起來的步驟。優(yōu)選的，在數(shù)學(xué)上組合loc100505635和一種或多種其他標志物的測定水平，并將組合值與實際的診斷問題關(guān)聯(lián)起來，可以通過任何適宜的現(xiàn)有技術(shù)生物信息學(xué)方法將標志物值與loc100505635的測定組合。

優(yōu)選的，在標志物組合中應(yīng)用的方法是一種對數(shù)函數(shù)。優(yōu)選的，應(yīng)用此方法的結(jié)果是單一值。根據(jù)實際的診斷問題，能容易地將此類值與例如個體關(guān)于copd的風(fēng)險或有助于評估copd患者者的其它有意診斷用途關(guān)聯(lián)起來。以一種優(yōu)選的方式，此類對數(shù)函數(shù)是如下獲得的：a)將個體分類入組，例如正常人、有copd風(fēng)險的個體、具有急性或慢性肺部炎癥的患者等等，b)通過單變量分析來鑒定在這些組之間差異顯著的標志物，c)對數(shù)回歸分析以評估標志物的可用于評估這些不同組的獨立差別值，并d)構(gòu)建對數(shù)函數(shù)來組合獨立差別值。在這種類型的分析中，標志物不再是獨立的，而是代表一個標志物組合。

在本發(fā)明中，術(shù)語“芯片”、“陣列”、“生物芯片”可互換使用，而且指在共同基片上排列的多種探針、標志物的集合，該基片可以是硅片、尼龍帶、塑料帶、或玻璃載片。

“陣列”、“宏陣列”或“微陣列”指有意創(chuàng)建的物質(zhì)(諸如分子、標志物、開口、微線圈、檢測儀和/或傳感器)集合，其附著至基片或固體表面(諸如玻璃、塑料、硅片或其它形成陣列的材料)或在基片或固體表面(諸如玻璃、塑料、硅片或其它形成陣列的材料)上裝配。陣列可用于同時測量大量(例如數(shù)十、數(shù)千或數(shù)百萬)反應(yīng)或組合的水平。陣列也可含有少量物質(zhì)，例如一個、少數(shù)或一打。陣列中的物質(zhì)可以彼此相同或不同。陣列可以采取多種形式，例如可溶性分子的文庫、固定化分子的文庫、固定化抗體的文庫、拴系至樹脂珠、硅片、或其它固體支持物的化合物的文庫。陣列可以是宏陣列或微陣列，取決于陣列上的墊的大小。宏陣列一般含有約300微米或更大的墊大小，而且能容易地通過凝膠和印跡掃描儀來成像。微陣列一般會含有小于300微米的墊大小。

“固體支持物”指不溶性、官能化、聚合材料，可以對其附著或共價結(jié)合(常常經(jīng)由接頭)文庫成員或試劑，從而固定化或容許它們易于與過量的試劑、可溶性反應(yīng)副產(chǎn)物、或溶劑分開(通過過濾、離心、清洗等)。

在本發(fā)明中，“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

所述探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊商標，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊商標，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnμcleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有seqidno.1指定的序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cdna序列，諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列。

在本發(fā)明中，術(shù)語“包括”用于指短語“包括但不限于”，并與短語“包括但不限于”可以互換使用。

在本發(fā)明中，基因“l(fā)oc100505635”指基因或從該基因轉(zhuǎn)錄的mrna，由于它是非蛋白編碼基因，故不存在蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在人類中，位于6號染色體的短臂2區(qū)2帶上，一種代表性的loc100505635的基因序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明中，實驗至少采用3次重復(fù)實驗，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，使用spss18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)p<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了loc100505635在copd患者中差異表達，通過檢測loc100505635的表達水平可以判斷早期copd患者。

本發(fā)明提供了一種copd的分子標志物，為copd的機理研究以及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測loc100505635在copd患者中的表達情況圖。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例qpcr測序驗證loc100505635基因的差異表達

1、對loc100505635基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。收集正常人和copd患者的血液各80例，患者均知情同意，上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、rna樣品的制備及質(zhì)量分析

2.1rna樣品的制備

(1)每0.25ml液體樣本加入0.75ml裂解液rls，用加樣槍吹打液體樣品幾次以幫助裂解樣品中細胞。每5～10×10⁶個細胞至少加入0.75ml裂解液rls。裂解液rls和液體樣品的終體積比總是3：1；

(2)在ep管中加入0.75ml裂解液rls，再加入0.25ml血液樣本，用力連續(xù)震搖30s，混勻，在15-30℃條件下孵育10min以使核蛋白體完全分解。

(3)每0.75ml裂解液rls加0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s并室溫下放置5min；

(4)于4℃12000rpm離心10min，把水相轉(zhuǎn)移到新管中；

(5)加入1倍體積70％乙醇，顛倒混勻，得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管內(nèi))。

(6)12000rpm離心45s，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管；

(7)加0.5ml去蛋白液re，12000rpm離心45s，棄掉廢液；

(8)加入0.5ml漂洗液rw，12000rpm離心45s，棄掉廢液；

(9)重復(fù)步驟(8)；

(10)將吸附柱ra放回孔收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液；

(11)取出吸附柱ra，放入一個rnasefree離心管中，根據(jù)預(yù)期rna產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μlrnasefreewater，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

2.2rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanovueplus儀器對所提取的rna濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

采用fastqμantcdna第一鏈合成試劑盒(貨號：kr106)進行mrna反轉(zhuǎn)錄，首先去除基因組dna反應(yīng)，在試管中加入5×gdnabμffer2.0μl，總rna1μg，加rnasefreeddh2o使總體積至10μl，水浴鍋中42℃加熱3min，再將10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述試管中一起混合共20μl，水浴鍋中42℃加熱15min，95℃加熱3min。

(2)引物設(shè)計

根據(jù)loc100505635和gapdh的序列，設(shè)計引物，由博邁德公司合成。具體引物序列如下：

loc100505635基因的引物序列為：

正向引物：5’-cctcagccctaccttccact-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-gcagctcctcaagttcatccc-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列為：

正向引物：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.5)

(3)qpcr擴增檢驗

用superrealpremixplus(sybrgreen)(貨號：fp205)，進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。

采用20μl反應(yīng)體系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，滅菌蒸餾水4.8μl。每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

擴增程序為：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40個循環(huán)，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

(4)cdna模板濃度的篩選

將各樣本cdna混合后，以此為模板進行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀釋，稀釋后樣品各取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行模板濃度的篩選。

根據(jù)溶解曲線，可以看出，當(dāng)cdna的進行10倍稀釋時，pcr的擴增效率較高，溶解曲線單峰比較好。

(5)樣品realtimepcr檢測

將各樣品cdna10倍稀釋后取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，2^-δδct法進行相對定量。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與正常人相比，loc100505635基因在copd患者中表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>常州市第二人民醫(yī)院

<120>copd診斷用分子標志物

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>665

<212>dna

<213>人源

<400>1

ccagccatcatcaagcccagagtagaccccaaaagaggaaagtaagacaagaatgagggt60

catcatggggagaaggaagtcttggagagaaccctcacttgactttggcagcttctggaa120

gatgttgcagctctgaaggcatgtttagaatatcaggaaaatgcttctccaggatcatga180

tcagataactctccactctaagcctcctgcaaccctcagccctaccttccactttgggct240

ttgcctcagccagccgctcctggaatttcttcttgaagaagagggcttgcagtcgctgct300

ggtagtggtcaatcctgtagacaaggaggtcaatgtcactcttctctgggatgaacttga360

ggagctgcaaagagcaggcgcaagtcacacaagcaactggtttcccaaaggatccaaaaa420

actgagagggaagagatttggggaagatgtcacttttcctcatctgactttgccttggag480

tcagatgggagaatgactcctggagaacacttagccttttccagctttccccaagaaagg540

ctggcccagggaggcttctataaaccttctccctaactcttccagcctgatttctccttg600

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agttc665

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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