本發(fā)明屬于農業(yè)生物工程領域，涉及用于抗咪草煙除草劑基因型檢測的功能標記as-als及其應用。

背景技術：

水稻是全世界近一半人口的主糧，也是我國主要的糧食作物之一。水稻傳統(tǒng)的栽培方式以人工栽種為主，費時費力，隨著人力成本的提高，水稻栽培成本也大幅提高，效益低下。近年來，隨著我國新型城鎮(zhèn)化和現代農業(yè)的發(fā)展，水稻生產正在向集約化、規(guī)?；C械化發(fā)展，機插秧、直播等輕簡栽培已成為發(fā)展趨勢。然而，直播稻田容易滋生雜草及雜草稻，嚴重影響水稻生長、產量及稻谷品質。人工除草的成本極高，制約了水稻生產朝著高產、高效、低成本方向發(fā)展，不利于發(fā)展現代農業(yè)。因此，開展抗除草劑的水稻育種和應用對于水稻優(yōu)質、高效生產有著重要的意義。

咪唑啉酮類除草劑是由美國氰胺公司開發(fā)成功的一類高效廣譜低毒的除草劑，目前已經有6種商品化，包括：咪唑煙酸、咪唑乙煙酸、咪草酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙和甲基咪草煙。其中咪唑乙煙酸，又稱為咪草煙，是一種常用于大豆田的高效除草劑，能有效防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草(石磊.農藥市場信息,2003,7:16.)。咪草煙的作用機理是通過抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，als)，從而抑制側鏈氨基酸的合成(gastons,etal.physiologiaplantarum,2002,114(4):524-532.)。

本發(fā)明人所在團隊擬現有水稻品種資源材料中篩選抗咪草煙的水稻材料。找到抗咪草煙的水稻材料als基因序列突變位點，開發(fā)抗咪草煙的水稻材料als基因分子標記。

該基因可以通過回交轉育到栽培品種中，但傳統(tǒng)上需要進行噴施除草劑逐代篩選鑒定，其過程經歷多代的雜交和回交，育種周期長，而且該基因為顯性基因，表型選擇難以剔除雜合基因型，更加大了育種周期和難度。因此，利用分子標記輔助選擇(marker-assistedselection,mas)技術，進行基因型篩選鑒定，加快雜交后代的早代穩(wěn)定，對于抗除草劑基因快速轉育、加快育種進程具有重要意義。本發(fā)明根據該位點的突變，設計了等位基因特異pcr標記，進行基因型選擇，加快早代穩(wěn)定，建立了抗除草劑分子育種技術體系。

技術實現要素：

技術問題

本發(fā)明的目的是針對將抗除草劑基因檢測過程繁瑣的問題，提供一個用于檢測樣品中攜帶抗除草劑或感除草劑基因的分子標記as-als；

本發(fā)明的另一目的是提供了一種as-als標記用于檢測水稻品種中含有抗除草劑或感除草劑基因的檢測方法；

本發(fā)明的又一目的是提供了一種as-als標記用于檢測雜交后代抗除草劑或感除草劑基因的攜帶情況，利于分子標記輔助選育抗除草劑新品系。

技術方案

本發(fā)明提供了一種用于抗咪草煙除草劑基因型檢測的功能標記as-als，所述抗咪草煙除草劑基因型為als基因編碼區(qū)第1880位堿基g轉換為a的突變，一種能夠通過兩個pcr檢測，明確als基因第1880位堿基為g(感咪草煙)，還是為a(抗咪草煙)的鑒定方法，從而能夠快速篩選樣品中是攜帶抗咪草煙，還是攜帶感咪草煙的基因型。本發(fā)明的準確性高、操作簡單、檢測效率高、成本低廉，具有很強的實用價值。

具體而言，本發(fā)明根據水稻als基因第1880位堿基的功能突變位點，設計的功能標記as-als包含兩個引物組合：f1n和f1m；

其中所述的f1n引物組合包含上下游兩個引物：as-als-f1與as-alsn-r2-2，所述的f1m引物組合包含上下游兩個引物：as-als-f1與as-alsm-r2-1：

所述的as-als-f1序列：5’-gaggcaatcatcgctactgg-3’，

所述的as-alsn-r2-2序列：5’-tgtccttgaatgcgcccctac-3’，

所述的as-alsm-r2-1序列：5’-tgtccttgaatgcgcccctat-3’

含有感咪草煙als-g基因型的樣品能被f1n引物組合擴增出547bp條帶，含有抗咪草煙als-a基因型的樣品能被f1m引物組合擴增出547bp條帶，同時含有als-g和als-a基因型的樣品能同時被f1n和f1m兩種引物組合擴增出547bp條帶。

利用所述的功能標記as-als檢測樣品中als基因型的方法，其特征在于，含有感咪草煙als-g基因型的樣品能被f1n引物組合擴增出547bp條帶，含有抗咪草煙als-a基因型的樣品能被f1m引物組合擴增出547bp條帶。含有als-g和als-a基因型的樣品能同時被f1n和f1m兩種引物組合擴增出547bp條帶。

利用所述的功能標記as-als檢測分別以含有感咪草煙als-g基因型的品種和含有抗咪草煙als-a基因型的品種配組后代als基因型的方法，其特征在于，含有感咪草煙als-g基因型的材料能被f1n引物組合擴增出547bp條帶，含有抗咪草煙als-a基因型的材料能被f1m引物組合擴增出547bp條帶，同時含有als-g和als-a基因型的材料能同時被f1n和f1m兩種引物組合擴增出547bp條帶。

有益效果

本發(fā)明人所在團隊利用從7403份水稻品種資源材料中篩選到一個抗咪草煙的水稻材料“金粳818”。通過對“金粳818”的als基因序列進行測序分析發(fā)現，其als基因編碼區(qū)與其它粳稻品種間存在一個堿基的突變，即”金粳818”als基因編碼區(qū)第1880位堿基由g突變?yōu)閍。

該基因可以通過回交轉育到栽培品種中，但傳統(tǒng)上需要進行噴施除草劑逐代篩選鑒定，其過程經歷多代的雜交和回交，育種周期長，而且該基因為顯性基因，表型選擇難以剔除雜合基因型，更加大了育種周期和難度。因此，利用mas技術，進行基因型篩選鑒定，加快雜交后代的早代穩(wěn)定，對于抗除草劑基因快速轉育、加快育種進程具有重要意義。本發(fā)明根據該位點的突變，設計了等位基因特異pcr標記，進行基因型選擇，加快早代穩(wěn)定，建立了抗除草劑分子育種技術體系。

本發(fā)明所提供的檢測抗除草劑或感除草劑基因的功能標記as-als及其應用，具有如下優(yōu)點：

通過本發(fā)明獲得了一個功能標記as-als，該標記不是與als基因連鎖的標記，而是根據功能突變位點開發(fā)而成，鑒定結果能直接反應植株的抗性，不存在遺傳交換的風險；

對功能標記進行了引物組合的篩選和pcr反應條件的優(yōu)化，擴增產物準確可靠且效果穩(wěn)定，無假陽性現象；

該功能標記能夠快速準確的區(qū)分抗除草劑或感除草劑基因(包括秈稻和粳稻)，彌補了噴施農藥帶來的農藥殘留、植株抗性分離等副作用，能加快新品種選育進程；

本發(fā)明提供了一種能夠通過兩個pcr檢測，明確als基因第1880位堿基為g(感咪草煙)，還是為a(抗咪草煙)的鑒定方法，從而能夠快速篩選樣品中是攜帶抗咪草煙，還是攜帶感咪草煙的基因型。本發(fā)明的準確性高、操作簡單、檢測效率高、成本低廉，具有很強的實用價值。

附圖說明:

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1不同引物組合對日本晴和“金粳818”的pcr擴增結果

a為日本晴，b為“金粳818”；m為dl2000標記，由大到小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-11分別為1、as-alsn-f2-1和as-als-r1-1；2、as-alsn-f2-1和as-als-r1-2；3、as-alsn-f2-2和as-als-r1-1；4、as-alsn-f2-2和as-als-r1-2；5、as-alsm-f2-1和as-als-r1-1；6、as-alsm-f2-1和as-als-r1-2；7、as-alsm-f2-2和as-als-r1-1；8、as-alsm-f2-2和as-als-r1-2；9、as-als-f1和as-alsn-r2-1；10、as-als-f1和as-alsn-r2-2；11、as-als-f1和as-alsm-r2-1。

圖2引物組合提高退火溫度優(yōu)化后pcr擴增結果

a為日本晴，b為“金粳818”；m為dl2000標記，由大到小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-11分別為as-alsn-f2-1與as-als-r1-1組合(第1組)、as-alsn-f2-1與as-als-r1-2組合(第2組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-1組合(第3組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-2組合(第4組)、as-als-f1與as-alsn-r2-2組合(第10組)和as-als-f1與as-alsm-r2-1組合(第11組)。

圖3不同材料的as-als功能標記檢測結果

a：as-als-f1與as-alsn-r2-2組合；b：as-als-f1與as-alsm-r2-1；m為dl2000標記，由大到小分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；1-9分別為“金粳818”、日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16、淮稻5號和“南粳9108/金粳818”雜交種

圖4as-als標記檢測f2群體及表型對應情況

圖中僅列出部分f2單株檢測的結果。m為dl2000dna標記(由大到小分別為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，p1為“金粳818”，p2為南粳9108，f1為“南粳9108/金粳818”雜交種，1-21為f2群體單株；r表示單株表現為抗除草劑，s表示單株表現為感除草劑。

圖5噴施除草劑后f2代植株表型

1為“金粳818”，2為南粳9108，3為“南粳9108/金粳818”雜交種，4為als-a純合基因型后代，5為雜合基因型后代，6為als-g純合基因型后代。

圖6as-als標記檢測高代品系及表型對應情況

m為dl2000dna標記(由大到小分別為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，p1為“金粳818”，p2為南粳9108，1-22為bc3f3群體單株；r表示單株表現為抗除草劑，s表示單株表現為感除草劑。

具體實施方式

以下結合附圖說明，以具體實施例對本發(fā)明的技術方法進行說明：

(下面詳細描述本發(fā)明的實施方式，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施方式僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。)

本發(fā)明人所在團隊通過大量的研究從7403份水稻品種資源材料中篩選到一個抗咪草煙的水稻材料“金粳818”。通過對“金粳818”的als基因序列進行測序分析發(fā)現，其als基因編碼區(qū)第1880位存在一個堿基g轉換為a的突變。

該基因可以通過回交轉育到栽培品種中，但傳統(tǒng)上需要進行噴施除草劑逐代篩選鑒定，其過程經歷多代的雜交和回交，育種周期長，而且該基因為顯性基因，表型選擇難以剔除雜合基因型，更加大了育種周期和難度。因此，利用mas技術，進行基因型篩選鑒定，加快雜交后代的早代穩(wěn)定，對于抗除草劑基因快速轉育、加快育種進程具有重要意義。本發(fā)明根據該位點的突變，設計了等位基因特異pcr標記，進行基因型選擇，加快早代穩(wěn)定，建立了抗除草劑分子育種技術體系。

1、分子標記的設計及檢測

基于抗除草劑品種“金粳818”與感除草劑品種日本晴在als基因第1880位堿基的差異，開發(fā)分子標記，如表1，其中設置11個引物組合：1、as-alsn-f2-1和as-als-r1-1；2、as-alsn-f2-1和as-als-r1-2；3、as-alsn-f2-2和as-als-r1-1；4、as-alsn-f2-2和as-als-r1-2；5、as-alsm-f2-1和as-als-r1-1；6、as-alsm-f2-1和as-als-r1-2；7、as-alsm-f2-2和as-als-r1-1；8、as-alsm-f2-2和as-als-r1-2；9、as-als-f1和as-alsn-r2-1；10、as-als-f1和as-alsn-r2-2；11、as-als-f1和as-alsm-r2-1。部分引物引入了堿基錯配。

表1als基因分子標記設計(小寫字母加粗標識的堿基表示錯配堿基，下劃線加粗的堿基表示功能突變位點堿基)

用ctab方法提取日本晴和“金粳818”苗期葉片的基因組dna(murraymg,etal.,nucleicacidsresearch,1980,8(19):4321-4326)，步驟如下：

(1)取0.2g新鮮組織葉片放在2ml離心管中，加入液氮研磨；

(2)加入650μlctab提取液(2％ctab，100mmtrisph8.0，20mmedtaph8.0，1.4mnacl)，混勻，65℃水浴1h；

(3)加入650μl氯仿：異戊醇(24:1)，充分混勻；

(4)12000rpm離心5min；

(5)取上清400μl，加入預冷的無水乙醇800μl，-20℃放置20min；

(6)12000rpm離心5min；

(7)去上清，加入200μl70％乙醇，懸浮清洗兩次；

(8)去除乙醇，干燥，用200μl1×te緩沖液溶解；

(9)用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提基因組質量，存于-20℃冰箱備用。

以日本晴(感除草劑品種)和“金粳818”的基因組為模板進行引物篩選，通過上述引物組合進行pcr擴增。pcr反應的體系為dna模板2μl，10×pcrbuffer2μl，mgcl2(5mmol/l)2μl，dntp(2mmol/l)2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，taq酶0.2μl，ddh2o7.8μl。擴增條件為94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，結束反應。pcr反應在eppendorfmastercycle熱循環(huán)儀中進行。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像儀中拍照，如圖1所示。結果發(fā)現，as-alsn-f2-1與as-als-r1-1組合(第1組)及as-alsn-f2-1與as-als-r1-2組合(第2組)僅能在日本晴品種中擴增，但擴增效率較低。as-alsm-f2-1與as-als-r1-1組合(第5組)、as-alsm-f2-2與as-als-r1-1組合(第7組)、as-alsm-f2-2與as-als-r1-2組合(第8組)僅能在“金粳818”中擴增。而as-als-f1與as-alsn-r2-2組合(第10組)和as-als-f1與as-alsm-r2-1組合(第11組)分別能在日本晴和“金粳818”中高效擴增，而在另一個品種中有微弱擴增。

2、分子標記引物的選擇與優(yōu)化

基于上述擴增結果，選擇6對分子標記[as-alsn-f2-1與as-als-r1-1組合(第1組)、as-alsn-f2-1與as-als-r1-2組合(第2組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-1組合(第3組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-2組合(第4組)、as-als-f1與as-alsn-r2-2組合(第10組)和as-als-f1與as-alsm-r2-1組合(第11組)]進一步優(yōu)化條件。pcr反應的體系與之前相同，pcr程序中將退火溫度提高到60℃。pcr產物在1％的瓊脂糖凝膠電泳中分離，于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。結果如圖2所示，as-alsn-f2-1與as-als-r1-1組合(第1組)、as-alsn-f2-1與as-als-r1-2組合(第2組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-1組合(第3組)、as-alsn-f2-2與as-als-r1-2組合(第4組)均不能有效擴增出目的條帶。而as-als-f1與as-alsn-r2-2組合(第10組)能在日本晴品種中獲得特異有效擴增，as-als-f1與as-alsm-r2-1組合(第11組)能在“金粳818”中獲得單一有效擴增。且這兩個引物組合獲得的條帶明亮、清晰，檢測結果可靠。將as-als-f1與as-alsn-r2-2組合命名為f1n，將as-als-f1與as-alsm-r2-1組合命名為f1m，將這兩組引物作為檢測als-g/a的分子標記，命名為as-als。

3、不同水稻材料的as-als功能標記檢測(以下品種均為公知公用品種)

利用上述開發(fā)的as-als功能標記檢測“金粳818”、日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16號、淮稻5號以及“南粳9108/金粳818”雜交種。其中“金粳818”為粳稻品種，抗咪草煙；日本晴、南粳45、南粳9108、淮稻5號為粳稻，感咪草煙；9311、ir36、南京16號為秈稻，感咪草煙；“南粳9108/金粳818”雜交種抗咪草煙。結果如圖3所示，“金粳818”只能被f1m擴增，為抗咪草煙類型；日本晴、9311、南粳45、南粳9108、ir36、南京16、淮稻5號只能被f1n擴增，為感咪草煙類型；“南粳9108/金粳818”雜交種能同時被f1n和f1m擴增。表明as-als功能標記對秈稻和粳稻均具有多態(tài)性，能同時用于粳稻和秈稻資源的篩選及抗除草劑遺傳改良。

4、as-als標記檢測f2群體及表型

進一步利用as-als標記檢測“金粳818”、南粳9108、“南粳9108/金粳818”雜交種及它們的93個f2單株，我們發(fā)現，所有攜帶als-a型基因的f2群體單株都表現為抗除草劑，而所有不攜帶als-a型(即只攜帶als-g型)基因的f2群體單株均表現為感除草劑(圖4和圖5)?；蛐蜋z測結果與表型鑒定結果完全對應。as-als標記與抗/感除草劑表型完全共分離，同時還能檢測到抗性雜合基因型，表明我們開發(fā)的as-als標記可用于抗咪草煙育種的精準選育，在f2代篩選抗性的純合基因型，可以進行早代選擇。

5、as-als標記在回交育種中的應用

為了明確as-als標記在抗除草劑品系選育中的應用，我們以“金粳818”為供體親本，以9311為輪回親本進行連續(xù)回交3代，每一代均對雜交種檢測保留als-g/a基因型的單株，與輪回親本雜交；對bc3f2單株保留純合單株，再自交一代，結合農藝性狀選擇，獲得除草劑抗性穩(wěn)定且的bc3f3株系。圖6為利用as-als標記對農藝性狀優(yōu)良的株系隨機檢測的結果，表明這些株系都攜帶純合als-a等位基因，這些株系抗性穩(wěn)定，不再分離。因此，利用as-als標記輔助選擇als-a基因可以快速獲得除草劑抗性穩(wěn)定的水稻材料。

sequencelisting

<110>江蘇省農業(yè)科學院

<120>用于抗除草劑咪草煙基因型檢測的功能標記as-als及其應用

<130>說明書

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