本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葛根scot分子標記的pcr反應體系。

背景技術(shù)：

葛根（puerarialobata(wild.)ohwi）是豆科葛屬（puerariadc.）多年生植物，是中國衛(wèi)生部首批批準的藥食同源兩用植物，素有“北參南葛”、“亞洲人參”之美譽。葛根含有葛根素、黃酮、多糖等多種藥用成分，具有解肌、透疹、止瀉、除煩、降脂、降糖、解酒、美容豐胸等功效（李國輝等，2010；胥甜甜，2014）。葛根富含淀粉，可作為非糧生物質(zhì)新能源，避開產(chǎn)業(yè)發(fā)展中＂與民爭糧，與糧爭地＂的瓶頸，具有巨大的開發(fā)潛力。此外葛根生長迅速、適應性好、抗逆性強，且根系深、水土保持能力強，加上其作為豆科特有的固氮能力，可作為貧瘠區(qū)域的綠化植物和土壤改良植物。2014國際葛根健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇透露，我國野葛和栽培葛面積近100萬公頃，具有很好的市場前景。

葛根在中國種植歷史悠久，但長期以來其遺傳育種工作較為落后，基本靠采收野生資源供藥用，對葛根的研究主要集中在藥理研究、營養(yǎng)成分分析等方面，種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、品種選育等沒有得到足夠重視。近年來，隨著人們對藥食同源兩用食物的關(guān)注，葛根產(chǎn)業(yè)隨之發(fā)展，葛根片、葛根粉、葛花茶、葛根保健飲料、葛根解酒飲料等葛產(chǎn)品的開發(fā)，葛根種質(zhì)資源收集和鑒定、遺傳多樣性研究逐漸開展起來，但大多研究是采用田間性狀等形態(tài)指標進行鑒定，容易受到環(huán)境、主觀判斷等因素的影響。采用分子標記的方法可以有效的避開以上弊端。目前關(guān)于分子標記在葛根上的研究尚少，僅有利用rapd（周精華等，2013）、issr（郭艷艷等，2013；陳俊意等，2015；袁燦等，2017）、srap（陳大霞等，2011）這三種分子標記方法開展過研究，其他分子標記方法在葛根上的應用未見報道。

目標起始密碼子多態(tài)性標記（scot）是collard等（2009）在水稻上提出的基于spar（單引物擴增反應）的新的目的基因分子標記方法，其原理是根據(jù)植物基因中的atg翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性，設計單引物并對基因組進行擴增。scot標記結(jié)合了issr標記和rapd標記的優(yōu)點，操作簡單，成本低廉，多態(tài)性豐富，能有效地產(chǎn)生與性狀聯(lián)系的標記，是一種能跟蹤性狀的新的分子標記，有利于分子標記輔助育種。目前已有前人將該技術(shù)成功應用于龍眼（陳虎等，2010）、柑橘（韓國輝等，2011）、花生（熊發(fā)前等，2010）、菊花（李丕睿等，2013）、蘭花（高嶺等，2013）、牡丹（侯小改等，2011）和菠蘿（陳香玲等，2012）等作物的遺傳多樣性分析中。雖然國內(nèi)外陸續(xù)有人對葛根做了分子標記研究，但尚未見scot分子標記應用于葛根的相關(guān)研究報道。因此，建立葛根的科學合理的scot-pcr反應體系，尋求最佳理論組合，既可以加快試驗進程，為后續(xù)工作提供科學的依據(jù)和指導作用，又可以提高分子標記輔助育種的效率，縮短育種年限，為進一步研究葛根遺傳多樣性及地理變化、相關(guān)標記開發(fā)、種源遺傳分化等相關(guān)研究具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：針對上述存在的不足，本發(fā)明提供了一種葛根scot分子標記的pcr反應體系。本發(fā)明是首次建立葛根scot-pcr反應體系，彌補了葛根scot分子標記相關(guān)研究的空白，豐富了葛根分子生物學研究的手段和方法。利用本發(fā)明獲得的scot-pcr反應條帶清晰、穩(wěn)定性高、操作簡單、成本低廉、多態(tài)性好，能夠?qū)崿F(xiàn)對葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種等相關(guān)領(lǐng)域的研究，具有很大的科學價值與應用價值。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種葛根scot分子標記的pcr反應體系，所述pcr反應體系總共有20μl，該pcr反應體系中含有dna50ng，mg²⁺1.5mmol/l，dntp0.25mmol/l，引物0.8μmol/l，taqdna聚合酶0.5u，余量為ddh2o。

進一步地，所述反應體系的pcr擴增程序為：94℃預變性4min；94℃30s，50℃1min，72℃90s，進行35個循環(huán)；72℃延伸5min；擴增產(chǎn)物4℃保存。

進一步地，所述引物為sc1-sc36中的任意一種。

申請人在創(chuàng)造性實驗過程中發(fā)現(xiàn)，目前報道的應用于葛根遺傳多樣性分析的分子標記只有rapd、issr、srap這3種，其中，rapd標記具有穩(wěn)定性和重復性差的缺點；srap標記需要通過聚丙烯酰胺膠來檢測pcr反應產(chǎn)物，過程繁瑣，工作量大，試驗費用高；相比之下，scot標記結(jié)合了issr標記和rapd標記的優(yōu)點，且通過瓊脂糖膠即可檢測，具有操作簡單，工作量小，成本低廉，多態(tài)性豐富，且穩(wěn)定性和重復性都很好的優(yōu)點。本發(fā)明是首次建立葛根scot-pcr反應體系，彌補了葛根scot分子標記相關(guān)研究的空白，豐富了葛根分子生物學研究的手段和方法，為葛根scot分子標記應用于種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析及連鎖圖譜構(gòu)建等奠定了一定基礎。

綜上所述，本發(fā)明由于采用了上述方案，具有以下積極效果：

（1）目前報道的應用于葛根的分子標記只有rapd、issr和srap這3種，本發(fā)明是首次建立葛根scot-pcr反應體系，彌補了葛根scot分子標記相關(guān)研究的空白，豐富了葛根分子生物學研究的手段和方法。

（2）本發(fā)明所建立的葛根scot-pcr反應體系擴增出的條帶穩(wěn)定性高，條帶清晰，多態(tài)性好，具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種等研究，具有很大的科學價值與應用價值。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步解釋說明，構(gòu)成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限制，在附圖中：

圖1為本發(fā)明實施例1中葛根scot-pcr反應體系的正交設計中16個反應體系的瓊脂糖電泳結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實施例2葛根scot分子標記的引物篩選結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實施例3不同葛根材料的多態(tài)性分析結(jié)果。

附圖中：圖1中電泳條帶序號1-16分別對應1-16個體系；圖2中電泳條帶序號1-36分別對應sc1-sc36；圖3中電泳條帶序號1-6代表的葛根品種為：1廣西鹿寨野葛，2桂粉葛1號，3藤縣葛根，4藤縣地方種，5平樂沙子鎮(zhèn)粉葛1號，6平樂沙子鎮(zhèn)粉葛2號。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖以及實施例對本發(fā)明一種葛根scot分子標記的pcr反應體系，作進一步說明。

試驗材料與試劑：葛根材料采集自廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所育種基地，其中，1號廣西鹿寨野葛，2號桂粉葛1號，3號藤縣葛根，4號藤縣地方種，5號平樂沙子鎮(zhèn)粉葛1號，6號平樂沙子鎮(zhèn)粉葛2號。所用的36條scot引物序列參照collard和mackill（2009），編號分別為sc1-sc36，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。taqdna聚合酶、dntps混合液、10×pcrbuffer(mg²⁺plus)、瓊脂糖等均購自takara公司。

實施例1：葛根scot-pcr反應體系的建立方法

（1）基因組dna的提取與檢測

采集無病蟲害葛根健康植株幼嫩葉片并使用takaradna提取試劑盒來提取1號廣西鹿寨野葛的dna，用紫外分光光度計檢測dna濃度，并將提取的dna稀釋成50ng/μl，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）葛根scot-pcr反應體系的優(yōu)化

scot-pcr反應體系確定為20μl，先以預擴增較好的引物sc27（5’-accatggctaccaccgtg-3’）作為葛根scot-pcr擴增體系建立的初選引物，以1號廣西鹿寨野葛為材料，進行葛根scot-pcr反應體系的優(yōu)化。其中，dna、mg²⁺、dntp、引物、taqdna聚合酶的5個因素分別設置了4個不同的水平（詳見表1），進行正交試驗，共16個組合，每個組合設3次重復，體積不足用ddh2o補齊至20μl。

表1scot-pcr反應體系的因素及水平

（3）pcr擴增與擴增產(chǎn)物的檢測

pcr擴增程序：94℃預變性4min；94℃30s，50℃1min，72℃90s，進行35個循環(huán)；72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，設定電壓為110v，運行時間為30min。經(jīng)gelred核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后拍照。

（4）葛根scot-pcr反應體系的正交試驗結(jié)果

葛根scot-pcr反應體系的正交試驗設置詳見表2，葛根scot-pcr反應體系的正交試驗擴增結(jié)果詳見圖1。

表2pcr反應體系正交試驗設計［l16（4⁵）］（20μl）

從圖1和表2可看出，16個組合的擴增效果各不相同。利用直觀分析法對16個體系的3次重復電泳圖條帶進行打分，再進行平均，獲得ki及r值。由于r越大，表明該因素對scot-pcr反應體系影響越大；ki越大，則表明該水平越好，因此，5個因素對scot-pcr反應體系的影響順序為：taqdna聚合酶＞dna＞引物＞dntp＞mg²⁺，結(jié)合ki確定最佳scot-pcr反應體系（20μl）：dna50ng，mg²⁺1.5mmol/l，dntp0.25mmol/l，引物0.8μmol/l，taqdna聚合酶0.5u。

實施例2：葛根scot分子標記的引物篩選

（1）基因組dna的提取與檢測

采集無病蟲害葛根健康植株幼嫩葉片并使用takaradna提取試劑盒來提取1號廣西鹿寨野葛的dna，用紫外分光光度計檢測dna濃度，并將提取的dna稀釋成50ng/μl，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）葛根scot-pcr反應體系的優(yōu)化及pcr擴增

以1號廣西鹿寨野葛dna為材料，分別以36條scot引物進行pcr反應，pcr反應體系總共有20μl，其中dna50ng，mg²⁺1.5mmol/l，dntp0.25mmol/l，引物0.8μmol/l，taqdna聚合酶0.5u，余量為ddh2o。pcr擴增程序為：94℃預變性4min；94℃30s，50℃1min，72℃90s，進行35個循環(huán)；72℃延伸5min；擴增產(chǎn)物4℃保存。

（3）pcr擴增產(chǎn)物的檢測

pcr產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，設定電壓為110v，運行時間為30min。經(jīng)gelred核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后拍照。結(jié)果（圖2）顯示，利用本發(fā)明擴增出來的pcr反應條帶清晰、數(shù)目豐富，背景干凈，36條scot引物均能在葛根中擴增出清晰可辨的條帶，說明這36條引物均可結(jié)合本發(fā)明的葛根scot-pcr體系應用于對葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種等研究，同時，證明本發(fā)明建立的葛根scot-pcr反應體系是高效可行的。

實施例3：不同葛根材料的多態(tài)性分析

（1）基因組dna的提取與檢測

采集無病蟲害葛根健康植株幼嫩葉片并使用takaradna提取試劑盒來提取1廣西鹿寨野葛，2桂粉葛1號，3藤縣葛根，4藤縣地方種，5平樂沙子鎮(zhèn)粉葛1號，6平樂沙子鎮(zhèn)粉葛2號共六份葛根材料的dna，用紫外分光光度計檢測dna濃度，并將提取的dna稀釋成50ng/μl，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）葛根scot-pcr反應體系的優(yōu)化及pcr擴增

隨機挑選sc2、sc3、sc11、sc27、sc28、sc29、sc30、sc32這8條scot引物，以6個葛根材料為模板，進行pcr反應，pcr反應體系體系總共有20μl，其中dna50ng，mg²⁺1.5mmol/l，dntp0.25mmol/l，引物0.8μmol/l，taqdna聚合酶0.5u，余量為ddh2o。pcr擴增程序為：94℃預變性4min；94℃30s，50℃1min，72℃90s，進行35個循環(huán)；72℃延伸5min；擴增產(chǎn)物4℃保存。

（3）pcr擴增產(chǎn)物的檢測

pcr產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，設定電壓為110v，運行時間為30min。經(jīng)gelred核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統(tǒng)成像后拍照。結(jié)果（圖3）所示，利用本發(fā)明擴增出來的pcr反應條帶清晰、數(shù)目豐富，背景干凈，除了sc30外，其他的7條引物均擴增出了差異條帶（圖3箭頭處所示），表明優(yōu)化后的葛根scot-pcr反應體系擴增效果良好且穩(wěn)定，多態(tài)性好，可應用于葛根種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析、葛根遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等相關(guān)領(lǐng)域的研究。

綜上所述，本發(fā)明是首次建立葛根scot-pcr反應體系，彌補了葛根scot分子標記相關(guān)研究的空白，豐富了葛根分子生物學研究的手段和方法。本發(fā)明所建立的葛根scot-pcr反應體系擴增出的條帶穩(wěn)定性高，條帶清晰，多態(tài)性好，具有操作簡單、靈敏度高、重復性好等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對葛根種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種等研究，具有很大的科學價值與應用價值。

以上所述僅為發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。