本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(snp)是指由于單個核苷酸發(fā)生變異而引起的基因組水平上dna序列的多態(tài)性，其形式包括單個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。目前，snp作為第三代的分子標(biāo)記，在基因組上分布非常廣泛，早已成為分子生物學(xué)的研究熱點。snp位點豐富，大約1000bp就會出現(xiàn)一個；其遺傳穩(wěn)定性高，一般只有2種等位型的堿基組成，具有二態(tài)性。在檢測時只需要通過一個簡單的“+/-”方式即可進(jìn)行基因分型。這使得檢測和分析易于實現(xiàn)自動化。因此，snp應(yīng)用于畜禽育種領(lǐng)域非常廣泛。

肌肉脂肪是近年來比較受關(guān)注的指標(biāo)，肌肉脂肪對于肉品質(zhì)的作用主要為三個方面：1)一定的脂肪含量可以增加肉的嫩度，雞肉脂肪中含飽和脂肪酸比較多，其熔點較高，可口性較好。有報道證明，肌肉脂肪含量的多少與肌肉嫩度呈正相關(guān)。2)肌肉脂肪含量的多少與肉品的多汁性有關(guān)，高品質(zhì)肉塊比低品質(zhì)肉塊更多汁的原因是肌肉脂肪含量高。3)肌肉脂肪含量與肉品的風(fēng)味有關(guān)，脂類和一些脂溶性物質(zhì)是一些風(fēng)味物質(zhì)的前體物，脂肪含量越高肉塊越香。

近幾十年來，人們大力追求家畜家禽的肌肉產(chǎn)量和生長速度，取得了巨大的成就。然而，在改善肉質(zhì)方面卻進(jìn)步緩慢，改良品種的肉質(zhì)與國內(nèi)一些地方品種相比，甚至還有退步。好在，肉質(zhì)問題逐漸被育種人員慢慢重視起來，期望培育出兼具高產(chǎn)肉量與肉質(zhì)優(yōu)良的畜禽。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記可作為選育優(yōu)質(zhì)肉雞的分子標(biāo)記，有助于培育出肉質(zhì)、風(fēng)味良好的優(yōu)質(zhì)文昌雞。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記，位于acvr2b基因第八內(nèi)含子上，以acvr2b基因(ncbireferencesequencenc_006089.4)的第一個堿基為第1位點，第86033位點的a/t堿基突變、第86034位點的g/c堿基突變、第86035位點的a/t堿基突變、第86036位點的c/g堿基突變、第86037位點的a/t堿基突變、第86046位點的a/t堿基突變或第86156位點的t/c堿基突變；

所述的雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記在雞肌間脂肪寬度性狀研究和/或雞育種中的應(yīng)用；

所述的雞肌間脂肪寬度性狀研究優(yōu)選包括利用上述分子標(biāo)記鑒定雞肌間脂肪寬度性狀；

所述的雞肌間脂肪寬度性狀研究優(yōu)選還包括利用上述分子標(biāo)記調(diào)節(jié)雞肌間脂肪寬度性狀；

一種用于鑒定上述雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記的引物，包括引物acvr2b-f和引物acvr2b-r，其核酸序列如下所示：

引物acvr2b-f：5'-ctcactgaccatccatct-3'；

引物acvr2b-r：5'-gacagggaacaaaaacaa-3'；

一種檢測雞肌間脂肪寬度性狀的方法，包含如下步驟：

檢測雞acvr2b基因(ncbireferencesequencenc_006089.4)，以第一個堿基為第1位點起，第86033位點是a堿基還是t堿基、第86034位點的g堿基還是c堿基、第86035位點的a堿基還是t堿基、第86036位點的c堿基還是g堿基、第86037位點的a堿基還是t堿基、第86046位點的a堿基還是t堿基或第86156位點的t堿基還是c堿基；

所述的雞優(yōu)選為文昌雞；

一種選育肉質(zhì)優(yōu)良的文昌雞的方法，包含如下步驟：

檢測文昌雞的acvr2b基因，被測定的文昌雞的acvr2b基因以第一個堿基為起點的第86033位點，第86034位點，第86035位點，第86036位點，第86037位點，第86046位點，第86156位點；當(dāng)?shù)?6033位點，第86034位點，第86035位點，第86036位點，第86037位點，第86046位點，第86156位點分別為aa、gc、aa、gg、aa、at、cc基因型時，表明被測文昌雞的肌間脂寬性狀具有優(yōu)勢，否則不具有優(yōu)勢；優(yōu)勢個體保留，不具優(yōu)勢個體淘汰；

所述的檢測方法優(yōu)選為：設(shè)計引物acvr2b-f和acvr2b-r，對被測雞dna進(jìn)行pcr反應(yīng)及測序；

所述pcr反應(yīng)的程序優(yōu)選為94℃預(yù)變性3min；98℃變性10s；53℃退火30s；72℃延伸50s；38個循環(huán)；72℃后延伸5min；

所述pcr反應(yīng)的體系優(yōu)選為：

本發(fā)明的原理：

人工選擇旨在針對特定經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行育種，使目標(biāo)性狀的表現(xiàn)逐漸強化，而不需要的性狀則可能逐漸退化。snp是在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的dna序列多態(tài)性。

本發(fā)明提供的snp位于acvr2b基因第八內(nèi)含子上，為acvr2b基因以第一個堿基為起點的第86033位點的a/t堿基突變，第86034位點的g/c堿基突變，第86035位點的a/t堿基突變，第86036位點的c/g堿基突變，第86037位點的a/t堿基突變，第86046位點的a/t堿基突變，第86156位點的t/c堿基突變。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明研究并確定雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記，使用該分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，能夠極大地加快文昌雞肌間脂肪寬度提高進(jìn)程。

(2)本發(fā)明提供的雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記各snp位點的優(yōu)勢基因型頻率較高，容易收集大量的該基因型的父母代進(jìn)行大規(guī)模育種。

(3)本發(fā)明提供的雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記各優(yōu)勢基因型與劣勢基因型對比，該兩種基因型個體的肌間脂寬差異顯著，通過人工選育，容易獲得較大育種成效。

(4)本發(fā)明通過上述雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記及鑒定該分子標(biāo)記的引物對，可建立高效準(zhǔn)確的分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，將其應(yīng)用于雞肌間脂肪寬度性狀遺傳改良中，從而提高雞肌間脂肪寬度，進(jìn)而改善雞肉的肉質(zhì)及風(fēng)味，降低企業(yè)生產(chǎn)成本，提高企業(yè)利潤，增加核心競爭力。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例中120只文昌雞(120日齡)，購自海南省龍泉文昌雞實業(yè)有限公司；

實施例中dna抽提采用hipureasblooddnaminikits(購自magen公司)，pcr反應(yīng)中所用的2×taqmastermix(dyeplus)購自vazyme公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成。

實施例1

(1)肌間脂肪寬度測定：掀開雞胸部皮膚，用游標(biāo)卡尺測量胸肌邊緣脂肪帶中下段、胸骨劍突末端處的寬度。測定數(shù)據(jù)如表1所示。

表1文昌雞肌間脂肪寬度測定數(shù)據(jù)

(2)dna獲?。簩﹄u進(jìn)行翅下靜脈采血，使用dna抽提試劑盒抽提dna，操作方法參照說明書。

(3)引物合成：根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫公布的acvr2b基因的序列(ncbireferencesequencenc_006089.4)為模板，使用primerorimer5.0軟件對acvr2a基因第八內(nèi)含子設(shè)計引物，引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。引物序列如表2所示。acvr2b基因序列(960bp)如下所示：

tgaacaagtccagctcccccagcctgtattcgtaggggaggtgctccagccctatctgtgcttagcagaggcatttggattatgctcttagtggtgttttaactttgggtgagtcccaagcagtctgaaagttggagttggtagtctttttaggtccctttcaatgggctatgtattcatcccacttggagtggaatgggatgaatatataggcctttcttttttagcatgtgcttcttttgctaccttttagaggggccgggagggatacagagttagccagtagtgtgaagtcctacgcagagtgcaggtgagaaaaaaaacaactcactgaccatccatcttgttgtctgtatcttattttgagagtaatttacccaggactgttgctgtctccttgtccctcccaaggctgtgctttctctccctcctttgcccttttgccatccctgtgccttgttcttccctgggctgagagaggggcagctcaacagggttggaatgcattcctctggtaggcagggctttaggatgcctggagttatgtgcccgaagtgcagtgtgagctcctgcagagagcaggagcacagaccttcacatcacacatgggtcctaacccagcagcacagtgctgtccacttgcatcttacagacaccaacagcggggagcagctggggaaggaaggaaggagcagatccacccagggctgctagacctagagattacagcatggtgcactgcactctgattcagccttgtgccataataaaccctcctaaacttgcttcttatctctctgtagggacttcaagagtaaaaacgtcttgctgaagaacgacttaacggcggtgctagccgattttggtcttgctgtacggtttgaacctggaaaacctccaggggacacccatggacaggtaatcattatctttcaaaatagcattgtaagaagtcaggcc

表2引物信息表

(4)pcr反應(yīng)及測序：反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，53℃退火30s，72℃延伸50s，38個循環(huán)；72℃后延伸5min；4℃保存。反應(yīng)體系如表3所示，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶符合要求的送上海生工生物科技公司測序。

表3pcr反應(yīng)體系(50μl)

(5)snp篩查：根據(jù)測序結(jié)果，比對峰圖，找出有突變的堿基位點，進(jìn)行基因分型。

(6)snp關(guān)聯(lián)分析：根據(jù)分型結(jié)果以及對文昌雞屠體測定的數(shù)據(jù)，進(jìn)行snp與各屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析。利用sas9.2軟件進(jìn)行多態(tài)位點與性狀的關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計模型如下：y＝μ+g+h+f+e；其中y代表性狀表型，μ代表均值，g代表基因型效應(yīng)，h代表批次效應(yīng)，f代表家系效應(yīng)，e代表殘差。對不同基因型的個體平均值進(jìn)行t檢驗。當(dāng)p>0.05時表示差異不顯著，當(dāng)p<0.05或p<0.01時表示差異顯著或極顯著。統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。

根據(jù)表4可知，分子標(biāo)記的snp位于acvr2b基因以第一個堿基為起點的第86033位點的a/t堿基突變，第86034位點的g/c堿基突變，第86035位點的a/t堿基突變，第86036位點的c/g堿基突變，第86037位點的a/t堿基突變，第86046位點的a/t堿基突變與肌間脂肪寬度性狀顯著相關(guān)(p<0.05)，第86156位點的t/c堿基突變與肌間脂肪寬度性狀極顯著相關(guān)(p<0.01)，說明上述分子標(biāo)記顯著影響雞的肌間脂肪寬度性狀，可以通過對雞的此snp位點的輔助選擇，從而提高該群體肌間脂肪寬度，進(jìn)而加快育種進(jìn)程。另外根據(jù)表4還可知，第86033位點，第86034位點，第86035位點，第86036位點，第86037位點，第86046位點，第86156位點分別為aa、gc、aa、gg、aa、at、cc基因型時，比其他基因型的平均肌間脂肪寬度高，說明上述基因型對平均肌間脂肪寬度性狀是最有利的。肌間脂肪寬度性狀是生長性狀的重要指標(biāo)，因此，我們在進(jìn)行育種的過程中需要保留第86033位點，第86034位點，第86035位點，第86036位點，第86037位點，第86046位點，第86156位點分別為aa、gc、aa、gg、aa、at、cc基因型的種雞，淘汰其他基因型的種雞。

表4snp關(guān)聯(lián)結(jié)果

實施例2

一種選育肉質(zhì)優(yōu)良的文昌雞的方法，包含如下步驟：

(1)采集選育群體內(nèi)每個個體的血樣，抽提dna；

(2)根據(jù)雞acvr2b基因(ncbireferencesequencenc_006089.4)，合成引物acvr2b-f和引物acvr2b-r(表2)；

(3)以dna為模板，pcr擴(kuò)增上述snp所在的序列片段，pcr擴(kuò)增體系參照表3，pcr擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，53℃退火30s，72℃延伸50s，38個循環(huán)；72℃后延伸5min；4℃保存；

(4)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，對比測序結(jié)果，如果第86033位點，第86034位點，第86035位點，第86036位點，第86037位點，第86046位點，第86156位點分別為aa、gc、aa、gg、aa、at、cc基因型時，表明被測文昌雞的肌間脂寬性狀具有優(yōu)勢，否則不具有優(yōu)勢；優(yōu)勢個體應(yīng)當(dāng)保留，不具優(yōu)勢個體應(yīng)當(dāng)淘汰。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種雞肌間脂肪寬度相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>引物acvr2b-f

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<220>

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cacacatgggtcctaacccagcagcacagtgctgtccacttgcatcttacagacaccaac660

agcggggagcagctggggaaggaaggaaggagcagatccacccagggctgctagacctag720

agattacagcatggtgcactgcactctgattcagccttgtgccataataaaccctcctaa780

acttgcttcttatctctctgtagggacttcaagagtaaaaacgtcttgctgaagaacgac840

ttaacggcggtgctagccgattttggtcttgctgtacggtttgaacctggaaaacctcca900

ggggacacccatggacaggtaatcattatctttcaaaatagcattgtaagaagtcaggcc960