巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用和檢測方法與流程

文檔序號：11767746閱讀：388來源：國知局

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巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用和檢測方法與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子標(biāo)記，尤其涉及一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用和檢測方法。

背景技術(shù)：

巴氏新小綏螨屬蜱螨亞綱，寄螨目，革螨亞目、植綏螨科，小新綏螨屬，因其發(fā)育歷期短、死亡率低、產(chǎn)卵率高、擴(kuò)散力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是最好的生物防治天敵之一。巴氏新小綏螨是多食性捕食螨，除了捕食葉螨和薊馬外，還可以捕食蚜蟲、木虱、粉虱、介殼蟲、跳蟲、跗線螨、絲狀菌和蚊蠅類的幼蟲等。

阿維菌素是一種新型生物殺蟲殺螨劑，是目前使用較為廣泛的農(nóng)藥制劑，在柑橘果園中主要用于防治柑橘全爪螨。本實(shí)驗(yàn)室研究表明，阿維菌素同樣對巴氏新小綏螨具有較強(qiáng)的毒力，室內(nèi)生物測定lc50值為50.03mg/l,因此在施藥過程中很容易造成巴氏新小綏螨大量死亡，化學(xué)防治與生物防治無法協(xié)調(diào)開展。

通過室內(nèi)篩選獲得抗藥性巴氏新小綏螨，釋放到果園后，捕食螨可以有效應(yīng)對農(nóng)藥脅迫，這對于巴氏新小綏螨的田間種群建立與害螨的綜合防控具有很高的實(shí)用價值。目前螨類對阿維菌素的抗性產(chǎn)生普遍認(rèn)為是由于其靶標(biāo)谷氨酸門控氯離子通道基因(nbglucl)發(fā)生基因突變而導(dǎo)致的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明根據(jù)巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感和抗性品系分類領(lǐng)域的空白，提供一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的另一目的是提供該分子標(biāo)記在巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感品系和抗性品系分類中的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案：一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明還提供了一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記的特異性正反向引物，所述引物序列如下：

4f：5’-aaacgaaacgggctactgt-3’；

4r：5’-cttctgcgtggactcgtta-3’。

本發(fā)明還提供了一種巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記的檢測方法：先提取單頭待測巴氏新小綏螨的總dna，以總dna為模板用權(quán)利要求3中的特異性正反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到包含突變區(qū)域的nbglucl基因片段，將得到的基因片段與權(quán)利要求1中的巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記進(jìn)行序列比對，即可判斷該品系是對阿維菌素的敏感品系還是抗性品系。

所述pcr體系為：pcrmastermix25μl，正反向引物各2μl，待測樣本dna模板50～100ng，補(bǔ)充ddh2o至50μl。

所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明定位了巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記。該標(biāo)記的特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，通過對巴氏新小綏螨待測樣本的該分子標(biāo)記的分析，即可得知待測樣本是對阿維菌素的敏感品系還是抗性品系。從而可以隨時監(jiān)測捕食螨的抗藥性，有利于“以蟲殺蟲”的生物防治策略，對于減少化學(xué)農(nóng)藥的使用、環(huán)境保護(hù)、果園可持續(xù)發(fā)展有重要意義。

2)本發(fā)明提供了巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記的特異性正反向引物，還提供了優(yōu)化的pcr體系和擴(kuò)增程序，可以成功快速地從巴氏新小綏螨中擴(kuò)增出一條499bp的dna條帶，該條帶即是與巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性密切相關(guān)的序列，該方法操作簡便快捷，檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高。

附圖說明

圖1為巴氏新小綏螨抗性品系和敏感品系中的nbglucl基因snp分析，ss：敏感品系；rs：抗性品系。

圖2為巴氏新小綏螨抗性品系和敏感品系中的nbglucl基因?qū)?yīng)的氨基酸序列差異分析，ss：敏感品系；rs：抗性品系。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1巴氏新小綏螨抗、敏品系谷氨酸門控氯離子通道基因克隆及snp分析

1.材料

1.1供試螨源

供試螨源

敏感品系：巴氏新小綏螨采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所果園周圍的檸檬樹葉上，采集后在室內(nèi)進(jìn)行多代不接觸農(nóng)藥飼養(yǎng)，對其進(jìn)行毒力測定，確定其lc50值處于較低水平，對阿維菌素沒有明顯的抗性。

抗性品系：使用巴氏新小綏螨敏感品系作為抗性篩選的原始材料，經(jīng)過多代篩選，巴氏新小綏螨對阿維菌素的lc50由50.03mg/l提高到了20572.3mg/l，其抗性種群較敏感種群增長了411.2倍。此后每隔一段時間視其種群密度對其進(jìn)行藥劑處理，保證其抗性不會出現(xiàn)衰退。

上述巴氏新小綏螨均為已知材料，且本實(shí)驗(yàn)室均有保存，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2試劑

reagentkit為反轉(zhuǎn)錄試劑盒(takara公司，日本)，dna純化回收試劑盒(天根公司，中國)，pmd-19tvector試劑盒(takara公司，日本)，dh5α感受態(tài)細(xì)胞(天根公司，中國)，pcrmastermix(天根公司，中國)，trizol(invitrogen，美國)。

2.方法

2.1巴氏新小綏螨抗性和敏感品系的總rna提取

對巴氏新小綏螨抗性和敏感品系分別采用trizol試劑提取總rna。

2.2cdna的合成

將前述得到的總rna采用rtreagentkit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cdna，方法步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系20μl，反應(yīng)條件：37℃，15min；85℃，5sec。

2.3巴氏新小綏螨谷氨酸門控氯離子通道基因及設(shè)計(jì)引物克隆

通過人工查找，在巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到谷氨酸門控氯離子通道基因nbglucl。

設(shè)計(jì)如表1所示的3對引物對nbglucl基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：pcrmastermix25μl，ddh2o18μl，正反向引物各2μl，前述得到的cdna模板3μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

表1nbglucl基因擴(kuò)增引物

pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(120v，電泳緩沖液為1％tae)，溴化乙錠(eb)染色，拍照，并對擴(kuò)增圖譜進(jìn)行比較分析。在紫外燈下切下目的條帶，采用dna純化回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段與pmd19-t載體按照摩爾比3：1的量在16℃下連接過夜；連接液轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌體涂布在含amp+iptg+x-gal的lb固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)12-16h，最后挑取白色單菌落，菌液pcr驗(yàn)證過后送華大測序公司進(jìn)行測序。

克隆所得序列使用dnaman5.2.2(lynonbiosoft)軟件進(jìn)行拼接組裝。dna序列利用在線網(wǎng)站ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行blast比對。最終獲得1689bp巴氏新小綏螨對阿維菌素敏品敏感品系和抗性品系的nbglucl基因全長(分別是seqidno.1和seqidno.2)。

實(shí)施例2巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記的獲得

運(yùn)用序列比對軟件bioxm2.6對敏感品系和抗性品系目標(biāo)基因進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)1202位點(diǎn)上存在突變堿基，敏感體系g堿基突變?yōu)榭剐云废档腶堿基。同時堿基的突變最終導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，如圖2所示，利用bioxm2.6軟件將堿基片段翻譯成氨基酸片段，發(fā)現(xiàn)了氨基酸突變，第401位點(diǎn)處敏感品系甘氨酸(g)突變?yōu)榭剐云废档奶於彼?d)。

根據(jù)抗性突變位點(diǎn)所處的位置，對巴氏新小綏螨進(jìn)行抗性標(biāo)記：

1)引物設(shè)計(jì)：選取目標(biāo)基因912位點(diǎn)上游附近和1392位點(diǎn)下游附近的核苷酸序列，運(yùn)用primerpremier5引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出能夠快速克隆出突變位點(diǎn)所在區(qū)域的引物對4f/4r，序列為4f：5'-aaacgaaacgggctactgt-3'；4r：5'-cttctgcgtggactcgtta-3'，可克隆出包含全部突變區(qū)域的499bp堿基--即巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如seqidno.3所示。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系：pcrmastermix25μl，ddh2o18μl，4f/4r特異性正反性引物各2μl，待測樣本dna模板3μl。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

2)突變頻率檢測：取100頭未交配過的雌性巴氏新小綏螨敏感品系(ss♀)和100頭雄性巴氏新小綏螨抗性品系(rr♂)進(jìn)行雜交，獲得雜交f2代群體。實(shí)驗(yàn)組用500mg/l的阿維菌素處理f2，存活個體作為實(shí)驗(yàn)材料；對照組用清水處理f2代，存活個體作為實(shí)驗(yàn)材料。各取30頭實(shí)驗(yàn)組和對照組巴氏新小綏螨，應(yīng)用tissueex-amppcrkit(abm公司)，以及上述特異性引物4f/4r，對單頭巴氏新小綏螨進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測每頭螨的基因型(g/g,g/d,d/d)及突變頻率。回收pcr產(chǎn)物目的片段，送測序公司測序，結(jié)果如表2所示，f2代實(shí)驗(yàn)組甘氨酸(gly)突變?yōu)樘於彼?asp)的頻率為96.70％，說明阿維菌素處理后，存活下來的個體絕大多數(shù)存在asp突變位點(diǎn)，而清水對照組asp突變頻率為48.3％，符合性狀分離比。以上監(jiān)測結(jié)果可以說明g401d與巴氏新小綏螨抗性性狀連鎖。

表2巴氏新小綏螨f2代基因型突變頻率

序列表

<110>西南大學(xué)

<120>巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用和檢測方法

<160>11

<210>1

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>巴氏新小綏螨對阿維菌素敏感品系谷氨酸門控氯離子通道基因

<400>1

atgttgcaagacgtatacaacaaccaccacgaaaacagccttagctgcaacgaacacgac60

actacaagcagcagcagtagcagctgcgccagcggcagcagtagcagcggaagacgtcag120

tcagaaacccgagcagacaataaacttccagttttccgaaatgaacaatctacggcggag180

aggagaacggagttgccgagaagaacattcaccttggccatcgtggctgctatcgcagtt240

ctcagcgtcccggtggtcggcgttgaagctcggcccgcagacccacggagtcagatcgcc300

catcagtttatgaactatacagataagcagatcctggattatctcgttaacaacagcaga360

tacgactacaggaacagacccgaagaccacacaagggtgaatgtcagcgtcttattgctc420

agcatgtcctcaccggatgaatccagtttgaaatacgagatcgagtttctgctgatccaa480

aaatggatcgatcagcgtctggcgtatcacgaaaccggctcgaatcattcgcatctgaat540

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gaagatgaaactaaggagcacgaggagtgcaccgagtattgtggtcaaggagagtttaag660

actccactcaatccggttcatatgagccttcgtctttatcccaatggcactgtcgtctac720

acgatgagaagacacatgaccctggtctgtcaggggaacctacaaatattcccattcgac780

aacccgaagtgcccattcgccgtcgagtcgatgtcgtatgaggagagccagctcaagatt840

gactggtcccaggaagaggaaaacatcacgagggcgtcctcacttcgtgcgctaaatgcc900

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tcctgcctgagagttctgctcgtattcacgagagacaagtcattctacatttcaacggtg1020

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aactcattccggtcgacactccccgtcgtctcgaacctgacggcaatgaatctgtgggac1200

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taccgtaacctgggccagcatactcgtcacagaagatacagttacgcgtcttcggtggcc1320

tcaaagaatcatccacaagcaacgccacttcttcaacagaacaacaataaacacaatgtc1380

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cctgaagaagaacaggaccggggtttcggtcgatttcgaactgtggcaatgctattcgtc1500

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gaatattaa1689

<210>2

<211>1689

<212>dna

<213>人工序列

<223>巴氏新小綏螨對阿維菌素抗性品系谷氨酸門控氯離子通道基因

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