本發(fā)明涉及一種用于檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的試劑盒。
背景技術(shù)：
豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征，是豬的重要傳染病，以妊娠母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道癥狀為主要特征。豬藍(lán)耳病是由豬繁殖呼吸與綜合征病毒引起的。患病豬和帶毒豬是本病的重要傳染源，主要傳播途徑是接觸感染、空氣傳播和精液傳播，也可通過胎盤垂直傳播。易感豬可經(jīng)口、鼻腔、肌肉、腹腔、靜脈及子宮內(nèi)接種等多種途徑而感染病毒，豬感染病毒后2～14周均可通過接觸將病毒傳播給其他易感豬。從病豬的鼻腔、糞便及尿中均可檢測到病毒。
豬藍(lán)耳病1987年首次在美國報(bào)道，此后在加拿大、德國、西班牙、英國也相繼報(bào)道了該病的發(fā)生。1995年，我國大陸發(fā)現(xiàn)了此病，且在多個(gè)省份開始流行。豬藍(lán)耳病現(xiàn)已成為我國危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要原因之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的試劑盒。
本發(fā)明提供了一種用于檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的試劑盒，包括用于檢測特定snp的物質(zhì)；所述特定snp為豬基因組dna中特異引物對的靶序列的第125位核苷酸；所述特異引物對由引物f和引物r組成；
所述引物f為如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；
(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；
所述引物r為如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；
(b2)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子。
所述特定snp為g/a多態(tài)。
所述試劑盒中，所述用于檢測特定snp的物質(zhì)為所述特異引物對。
所述試劑盒還包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體：基于所述特定snp，aa基因型的待測豬對豬藍(lán)耳病病毒的抗性高于gg基因型的待測豬。
所述試劑盒還包括記載有如下所述“檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的方法”的載體。
所述待測豬為大白豬。
本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的應(yīng)用，為如下(c1)或(c2)：
(c1)檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性中的應(yīng)用；
(c2)豬的育種。
所述待測豬為大白豬。所述豬為大白豬。
本發(fā)明還保護(hù)用于檢測特定snp的物質(zhì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述特定snp為豬基因組dna中特異引物對的靶序列的第125位核苷酸；所述特異引物對由引物f和引物r組成；
所述引物f為如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；
(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；
所述引物r為如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；
(b2)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子；
所述試劑盒的功能為檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒的抗性。
所述應(yīng)用中，所述用于檢測特定snp的物質(zhì)為所述特異引物對。
所述待測豬為大白豬。
本發(fā)明還保護(hù)一種特異引物對，由引物f和引物r組成；
所述引物f為如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；
(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；
所述引物r為如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；
(b2)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子。
本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒的抗性。所述待測豬為大白豬。
本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對的應(yīng)用，為如下(c1)或(c2)：
(c1)檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性中的應(yīng)用；
(c2)豬的育種。
所述待測豬為大白豬。所述豬為大白豬。
本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的方法，包括如下步驟：
以待測豬的基因組dna為模板，采用所述特異引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；
如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且第125位核苷酸為g，該待測豬的基因型為gg；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且第125位核苷酸為a，該待測豬的基因型為aa；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，其中一種第125位核苷酸為g，另一種第125位核苷酸為a，該待測豬的基因型為ga；
aa基因型的待測豬對豬藍(lán)耳病病毒的抗性高于gg基因型的待測豬。
所述待測豬為大白豬。
以上任一所述豬藍(lán)耳病病毒具體可為atccvr-2385毒株。
應(yīng)用本發(fā)明提供的方法對豬進(jìn)行育種，可對待選豬進(jìn)行早期篩選，有效地緩解實(shí)際生產(chǎn)中的豬藍(lán)耳病問題，提高經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的檢測方法操作簡單、費(fèi)用低廉、準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動化的直接檢測。本發(fā)明將在豬的育種工作中發(fā)揮巨大作用。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
實(shí)施例中，用于檢測豬藍(lán)耳病抗體的試劑盒為購自將來商城的貨號為jl21926-48t的豬藍(lán)耳病抗體(prrs-ab)elisa試劑盒(江萊生物)。
實(shí)施例中，用于攻毒的豬藍(lán)耳病病毒(豬繁殖呼吸與綜合征病毒)為atccvr-2385。
豬藍(lán)耳病的發(fā)病表征為：采食量下降、喜臥懶動、體溫40.5℃左右、有眼屎淚斑、耳朵發(fā)紺、眼瞼水腫、眼結(jié)膜炎、咳嗽、喘氣。
實(shí)施例、
一、試驗(yàn)群體的獲得
40天的大白豬仔豬(體重為11±2kg)，取血檢測豬藍(lán)耳病抗體(抗體檢測)，采集鼻拭子檢測豬藍(lán)耳病病毒(病毒檢測)，篩除抗體檢測為陽性和/或病毒檢測為陽性的仔豬，抗體檢測為陰性且病毒檢測為陰性的仔豬組成試驗(yàn)群體。
二、基因型檢測
試驗(yàn)群體的各個(gè)仔豬，分別進(jìn)行如下操作：
1、取血，提取基因組dna。
2、以步驟1提取的基因組dna為模板，采用f和r組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
f(序列表的序列1)：5’-tgagaggggccctccaggtga-3’；
r(序列表的序列2)：5’-tgtgatgtgtggagcacttcc-3’。
3、將步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果獲得各個(gè)仔豬的基因型。
各個(gè)仔豬的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物均為240bp。根據(jù)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果，試驗(yàn)群體的所有待測豬分別屬于3種基因型。
如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且第125位核苷酸為g，該仔豬的基因型為gg。如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物只有一種且第125位核苷酸為a，該仔豬的基因型為aa。如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物有兩種，其中一種第125位核苷酸為g，另一種第125位核苷酸為a，該仔豬的基因型為ga。
從試驗(yàn)群體中，隨機(jī)取21頭gg基因型的個(gè)體組成gg組(均對個(gè)體進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記為gg)，隨機(jī)取21頭aa基因型的個(gè)體組成aa組(均對個(gè)體進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記為aa)。
三、飼養(yǎng)
在與外界隔離的環(huán)境中，將gg組和aa組混合飼養(yǎng)?；旌巷曫B(yǎng)即gg組個(gè)體和aa組個(gè)體均可以自由接觸。與外界隔離的環(huán)境即與外界不發(fā)生豬藍(lán)耳病病毒傳播的環(huán)境。
四、發(fā)病豬的獲得
步驟三中的仔豬飼養(yǎng)至9月齡時(shí),從gg組和aa組中各隨機(jī)抽取1頭取出，用豬藍(lán)耳病病毒進(jìn)行攻毒，持續(xù)觀察，兩頭豬均出現(xiàn)豬藍(lán)耳病的發(fā)病表征且鼻拭子均可檢測到豬藍(lán)耳病病毒。
將從gg組抽取并進(jìn)行上述步驟得到的發(fā)病豬命名為發(fā)病豬-gg。將從aa組抽取并進(jìn)行上述步驟得到的發(fā)病豬命名為發(fā)病豬-aa。
五、模擬感染
步驟三中的仔豬飼養(yǎng)至10月齡時(shí)，以步驟四獲得的發(fā)病豬為傳染源，模擬感染：即同一天，將發(fā)病豬-gg和發(fā)病豬-aa放回原群體。
六、統(tǒng)計(jì)發(fā)病率
從步驟五中放入發(fā)病豬開始計(jì)天數(shù)，40天后統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病情況，即各組中具有豬藍(lán)耳病的發(fā)病表征的豬的個(gè)數(shù)(統(tǒng)計(jì)不含發(fā)病豬-gg和發(fā)病豬-aa)。
以上步驟進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。
gg組的三次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)病豬的頭數(shù)分別為：10只、10只、12只。
aa組的三次重復(fù)試驗(yàn)中發(fā)病豬的頭數(shù)分別為：4只、5只、6只。
結(jié)果表明，aa基因型的豬對豬藍(lán)耳病病毒的抗性顯著高于gg基因型的豬。
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<110>北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院
<120>用于檢測待測豬對豬藍(lán)耳病病毒抗性的試劑盒
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