本發(fā)明涉及生物檢驗檢疫領(lǐng)域，具體的說涉及一種用于檢測雞蛋清中溶菌酶的方法。
背景技術(shù)：
溶菌酶又稱為n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，胞壁質(zhì)酶，是一種能水解致病菌中粘多糖的堿性酶。對革蘭氏陽性菌的抗菌能力最強(qiáng)，也能抑制革蘭氏陰性菌和真菌，還具有抗氧化能力。溶菌酶作為一種生物體內(nèi)的非特異性免疫因子，在抑殺病原體時不易產(chǎn)生抗藥性，并具有無毒、無害、無殘留、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)良的抗菌特性。溶菌酶不僅在生物體內(nèi)有非特異性免疫功能，哺乳動物還可以通過乳汁將這種功能傳遞給幼崽，提高幼崽的抗病力，家禽通過蛋清傳遞給種蛋，提高胚胎發(fā)育的抵抗力。在食品工業(yè)(防腐劑)、醫(yī)藥(酶類抗菌藥)、飼料(替代抗生素)和生物工程(生物酶)等領(lǐng)域，溶菌酶已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用，并有替代抗生素的趨勢。
雞蛋中的溶菌酶含量最高，占蛋清蛋白的3.5％，是提取溶菌酶的最佳來源。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越強(qiáng)，越有利于雞蛋的儲藏，因此測定雞蛋蛋清中的溶菌酶對我國溶菌酶生產(chǎn)、禽蛋產(chǎn)品加工有重要的指導(dǎo)作用，也為蛋品質(zhì)評定提供了一個重要參數(shù)。
最早對溶菌酶的研究始于20世紀(jì)初，1922年英國弗萊明發(fā)現(xiàn)人的鼻涕、唾液、眼淚有強(qiáng)大的溶菌活性，并將這種溶菌因子成為溶菌酶。此后在人和動物的多種組織、分泌液以及植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)溶菌酶的存在，其中雞蛋蛋清中的溶菌酶含量最高，已成為溶菌酶生產(chǎn)的主要原料。但是蛋清中溶菌酶的定量測定還沒有一個較便捷的方法。傳統(tǒng)的方法是先提取蛋清中的溶菌酶，再測定提取液中的蛋白含量。由于不可能完全提取蛋清中的溶菌酶，這種方法計算出的蛋清溶菌酶含量比實際的數(shù)值偏低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種檢測雞蛋清中溶菌酶的方法，該方法包括如下步驟：
(1)用稀釋好的單克隆抗體3e4(2μg/ml)包被elisa板，100μl/孔，4℃包被過夜；
(2)0.5％的pbst洗滌3次，5min/次，拍干；
(3)加入2.5％的脫脂奶粉溶液封閉，200μl/孔，37℃包被1h；
(4)0.5％的pbst洗滌3次，5min/次，拍干；
(5)加入系列稀釋的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或者待檢樣品及辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體(1:1600倍稀釋)，各100μl/孔，37℃孵育1h；
(6)0.5％的pbst洗滌3次，5min/次，拍干；
(7)加入tmb底物溶液，100μl/孔，37℃避光反應(yīng)15min；
(8)加入3m硫酸終止反應(yīng)，50μl/孔；
(9)酶標(biāo)儀450nm處讀值，記錄od值；
(10)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢樣品中溶菌酶的含量。
其中所述的單克隆抗體3e4是通過溶菌酶免疫balb/c雌性小鼠制備得到的；
其中所述的多克隆抗體是通過溶菌酶免疫新西蘭大白兔后得到；
具體的說，單克隆抗體3e4是通過如下方法制備得到的：
(a)采用皮下免疫方案免疫健康balb/c雌性小鼠：用1mg/ml的溶菌酶100μl與等量的弗氏完全佐劑混合，采用超聲乳化，以乳化后滴入水中不擴(kuò)散為準(zhǔn)，大約40min；用酒精棉對小鼠要免疫的部位進(jìn)行消毒，皮下多點(diǎn)注射；首免后2周用1mg/ml的溶菌酶100μl與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后皮下注射小鼠，二免后10天，對免疫小鼠采血，檢測血清抗體水平，來確定是否需要三免；
(b)細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆化：
融合前5天用與步驟(a)中相同劑量、相同方法加強(qiáng)免疫一次。尾靜脈采血，分離血清作為陽性對照，小鼠頸脫位致死，75％酒精消毒體表5min，無菌條件下取出小鼠脾臟，用電動移液槍吸取dmem培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾臟細(xì)胞懸液，放入含有10mldmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基的玻璃平皿中，用平頭鑷子夾碎脾臟，反復(fù)吹打制成脾細(xì)胞懸液。用滅菌銅網(wǎng)過濾除去脂肪類塊狀組織，過濾后細(xì)胞懸液吸入15ml離管，300g，4℃離心10min。吸凈上清，加入5ml預(yù)冷的0.17mnh4cl重懸細(xì)胞，放入4℃冰箱，靜置10min溶解紅細(xì)胞，計數(shù)脾細(xì)胞。按脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞8:1的比例充分混合，在37℃水浴下與50％peg1000進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合后的細(xì)胞按照脾細(xì)胞2×106/ml，100μl/孔的要求，輕輕加入所需預(yù)溫的ht培養(yǎng)基(sigma公司)。24h后，每孔補(bǔ)加含有2倍量a(aminoperin)的ht培養(yǎng)基，每孔100μl。4天后，半量換預(yù)溫的hat培養(yǎng)基(ht培養(yǎng)基中添加aminopterin，稱為hat培養(yǎng)基)。7天后，半量換預(yù)溫的ht培養(yǎng)基。每天觀察細(xì)胞，標(biāo)記融合的細(xì)胞，待克隆細(xì)胞生長至孔底1/4面積以上時，利用間接elisa法對上清液進(jìn)行抗體效價檢測，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。對抗體效價高、細(xì)胞生長狀態(tài)良好的孔，利用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化，直到陽性率連續(xù)3次不低于90％，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。陽性雜交瘤細(xì)胞腹腔注射預(yù)先經(jīng)石蠟油處理過的雌性balb/c小鼠，1×106個細(xì)胞/只，注意觀察小鼠的腹水及存活情況，及時抽取腹水。如發(fā)現(xiàn)小鼠活動受限，要立即處死放腹水。5000r/min離心去除雜物，用飽和硫酸銨和proteingresin純化抗體，經(jīng)紫外吸收法測定mab濃度，通過sds-page電泳分析其純度。先后三次細(xì)胞融合的融合率分別為17.7％、19.4％和78.2％，陽性率分別為0、0和1.89％，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為3e4，其親和力常數(shù)為4.1×108mol/l。
其中所述的多克隆抗體是通過溶菌酶免疫新西蘭大白兔后得到；
具體的說所述的多克隆抗體是通過如下方法制備得到的：
(a)用溶菌酶免疫健康新西蘭大白兔3只，免疫劑量為500μg/只，一免是將溶菌酶與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，乳化完全后多點(diǎn)注射于兔子頸部及背部皮下，2周后加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫為溶菌酶與等體積的弗氏不完全佐劑，免疫劑量和免疫方法同第一次免疫，第三次加強(qiáng)免疫是將未乳化的溶菌酶，進(jìn)行兔子的耳靜脈注射，注射量500μg/只。靜脈注射后7天采集靜脈血測定血清效價，當(dāng)血清效價達(dá)到24及以上時，頸動脈采血并在37℃放置2h，4℃靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體。
(b)多克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法純化收集的兔血清，具體步驟如下：(1)兔血清4℃，12000rpm離心15min，去除雜質(zhì)。(2)取1份血清與2份醋酸鹽緩沖液(0.06mol/l，ph4.8)混合，室溫攪拌下逐滴加入正辛酸75μl/ml兔血清。(3)室溫混合30min。(4)4℃靜置2h以上，使其充分沉淀。(5)4℃，12000rpm離心30min，棄沉淀。(6)上清經(jīng)砂芯漏斗過濾后，于50倍體積的0.01mpbs(ph7.4)中4℃透析6h。(7)在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨，使成50％飽和度，邊加邊攪拌，4℃靜置1h以上。(8)4℃，10000rpm離心30min，棄上清。(9)沉淀用適量含137mmnacl、2.6mmkcl、0.2mmedta的pbs(ph7.4)溶解，于50～100倍體積的上述pbs中4℃過夜透析。(10)取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后，以紫外分光光度計檢測蛋白含量，sds-page檢測抗體濃度，并分裝保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>
(c)辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記多克隆抗體
純化后的多克隆抗體用一種活化的辣根過氧化物酶試劑盒(hrp，galaxybio公司)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作方法如下：(1)取100μl抗體溶液(1mg/ml)轉(zhuǎn)入reagentⅰ活化辣根過氧化物酶，稍離心，使辣根過氧化物酶沉到管底，辣根酶管壁上的干粉hrp要完全沖洗溶解?？偟姆磻?yīng)體系控制在100μl/mg活化hrp左右，體系增大影響標(biāo)記率，按照按mg活化hrp對應(yīng)抗體100-500μg，hrp：x的分子mol比保持在30:15～1左右。(2)以reagentⅱ調(diào)ph值至9.5左右，4℃過夜。(3)加入reagentⅲ(約3倍體積的reagentⅱ)，確保酶結(jié)合ph在7.0左右，可以多加reagentⅲ調(diào)整，混勻終止反應(yīng)。(4)加甘油至50％，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明還提供了一種檢測溶菌酶的試劑盒，該試劑盒包括：
前述的單克隆抗體3e4和辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體；以及包被液、封閉液、洗液、系列稀釋的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)多抗稀釋液、底物溶液和終止液；
該試劑盒中還包括使用說明書。
其中單克隆抗體3e4為包被抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體為檢測抗體；包被液為ph＝7.2±0.1的磷酸緩沖液pbs；封閉液為2.5％(重量含量)脫脂奶粉溶液；洗液為0.5％pbst；溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的系列稀釋濃度分別為0、1.5、3、6、12和24μg/ml；酶標(biāo)多抗稀釋液為pbst(0.01m的pbs，含tween-200.5％)，底物溶液為tmb溶液，終止液為3m硫酸。
本發(fā)明以特異性高的單克隆抗體為包被抗體，以hrp標(biāo)記的多克隆抗體為檢測抗體，實驗操作程序簡單，時間短，且靈敏度高，最低檢測限可達(dá)到0.3125ng/ml，可以制備快速、有效、低成本的溶菌酶檢測試劑盒，容易實現(xiàn)，具有很好的推廣價值。
附圖說明
圖1實施例3中繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線
具體實施方式
實施例1溶菌酶免疫balb/c小鼠(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院)，制備單克隆抗體
(一)體的免疫方法如下：
用1mg/ml的溶菌酶(南京建成生物工程研究所)100μl與等量的弗氏完全佐劑混合，超聲乳化40min。腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射100μg/100μl的溶菌酶，兩周后進(jìn)行二次免疫，100μg/100μl溶菌酶與等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫每次間隔兩周，三免后10天尾靜脈檢測小鼠血清效價。
(2)細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆化：
強(qiáng)免后5天，小鼠尾靜脈采血，分離血清留作陽性對照，無菌采集小鼠脾臟，用移液槍吸取dmem培養(yǎng)基(hyclone公司)反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細(xì)胞懸液，nh4cl處理脾細(xì)胞中紅細(xì)胞，將脾細(xì)胞按8:1的比例與sp2/0細(xì)胞充分混合，將融合后的細(xì)胞按照脾細(xì)胞2×106/ml，100μl/孔的要求，輕輕加入所需預(yù)溫的ht培養(yǎng)基。24h后，每孔補(bǔ)加含有2倍量a(aminoperin，sigma公司)的ht培養(yǎng)基，每孔100μl。4天后，半量換預(yù)溫的hat培養(yǎng)基(sigma公司)。7天后，半量換預(yù)溫的ht培養(yǎng)基。每天觀察細(xì)胞，標(biāo)記融合的細(xì)胞，待克隆細(xì)胞生長至孔底1/4面積以上時，利用間接elisa法對上清液進(jìn)行抗體效價檢測，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。并選擇陽性高，細(xì)胞生長狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽性為止。先后三次細(xì)胞融合的融合率分別為17.7％、19.4％和78.2％，陽性率分別為0、0和1.89％，經(jīng)過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為3e4，其親和力常數(shù)為4.1×108mol/l。
(三)單抗亞型鑒定及腹水大量制備：
選用sigma公司小鼠單克隆抗體mab亞型鑒定試劑盒(mousemonoclonalantibodyisotypereagent)，根據(jù)操作說明使用elisa方法鑒定單抗亞型。具體方法如下：
(1)用溶菌酶2μg/ml包被酶標(biāo)板，4℃過夜；
(2)棄掉抗原，pbst洗滌3次，5min/次，甩干；
(3)加入適當(dāng)稀釋的腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃，1h；
(4)pbst洗滌3次，5min/次；
(5)加入2.5％脫脂奶粉溶液作為封閉液，200μl/孔，37℃作用1h，洗滌方法同上；
(6)用2.5％脫脂奶粉溶液稀釋單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)液上清，100μl/孔加入，37℃作用1h，洗滌方法同上；
(7)按說明書加入1:1000稀釋的goatanti-mouseigg1、igg2a、igg2b、igg3、igm和iga抗體，100μl/孔，室溫孵育30min，洗滌；
(8)加入稀釋的hrp標(biāo)記兔抗羊igg二抗，100μl/孔，37℃作用1h，洗滌；
(9)每孔加入tmb底物溶液100μl，室溫避光作用15min；
(10)加入3mh2so4，50μl/孔，終止反應(yīng)；
(11)提前預(yù)熱酶標(biāo)儀，讀值結(jié)果見如下表1，判定3e4抗體屬于igg2b亞型。
表1mab亞型鑒定結(jié)果
小鼠腹水大量制備的具體操作：取健壯的8～10周齡雌性balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500μl高壓滅菌的石蠟油，5天后腹腔注射處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞1～2×106個/只，注射細(xì)胞5～7天后，選擇腹腔明顯膨脹，行動不便的小鼠，將注射器針頭插入小鼠腹腔內(nèi)，引流腹腔內(nèi)淡黃色液體至離心管中，5000rpm離心10min，取淡黃色上清，分裝、標(biāo)記后-80℃保存?zhèn)溆?。約間隔2天，待小鼠體內(nèi)腹水再次聚積后，同樣方法獲取腹水。
(四)辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水：
具體操作如下：
(1)腹水4℃，12000rpm離心15min，去除雜質(zhì)。
(2)取1份腹水與2份醋酸鹽緩沖液(0.06mol/l，ph4.8)混合，室溫攪拌下逐滴加入正辛酸33μl/ml腹水。
(3)室溫混合30min。
(4)4℃靜置2h以上，使其充分沉淀。
(5)4℃，12000rpm離心30min，棄沉淀。
(6)上清經(jīng)砂芯漏斗過濾后，加入1/10體積的0.1mpbs(ph7.4)，用2mnaoh調(diào)ph值到7.4。
(7)冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/ml的硫酸銨，使成45％飽和度。
(8)4℃靜置1h以上。
(9)4℃，10000rpm離心30min，棄上清。
(10)沉淀用適量含137mmnacl、2.6mmkcl、0.2mmedta的pbs(ph7.4)溶解，于50～100倍體積的上述pbs中4℃過夜透析。
(11)取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后，以紫外分光光度計檢測蛋白含量，sds-page檢測抗體濃度，并分裝保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>
(五)間接elisa檢測純化后腹水效價：
具體操作如下：
(1)用溶菌酶蛋白(南京建成生物工程研究所)包被酶標(biāo)板，4℃過夜；
(2)棄掉抗原，pbst洗滌3次，5min/次，甩干；
(3)純化后的腹水從5千倍開始倍比稀釋，每個濃度有2個重復(fù)孔，37℃孵育1h，同時設(shè)定陰性對照孔，陰性對照是注射骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腹水；
(4)pbst洗滌3次，5min/次，甩干；
(5)每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1:10000倍稀釋)，37℃孵育1h；
(6)洗滌方法同上；
(7)每孔加入tmb底物溶液100μl，室溫顯色15min，酶標(biāo)儀讀od450nm值記錄結(jié)果。
(六)單克隆抗體分子量及腹水蛋白含量測定：
將純化前和純化后的腹水經(jīng)變性sds-page電泳后，以marker中標(biāo)記蛋白在凝膠中的相對遷移率為橫坐標(biāo)，以標(biāo)記蛋白分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)抗體輕鏈和重鏈在凝膠中的遷移情況，計算單抗3e4分子量為154，368da。利用bca法測定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)吸光度值，查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出3e4的腹水蛋白含量為11.78mg/ml。
(七)單克隆抗體親和力測定：
具體操作如下：
將抗原溶菌酶按照8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml包被酶標(biāo)板，將單抗從一定濃度開始倍比稀釋，其余步驟與間接elisa法一致。以抗體濃度(mol/l)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，可在一個坐標(biāo)系內(nèi)作出4條s形曲線。找出s形曲線的頂部，設(shè)定為odmax。在曲線中分別找出4條曲線各自50％odmax對應(yīng)的抗體濃度。將4個濃度兩兩一組，根據(jù)下列公式計算單抗的親和力常數(shù)。
ka＝(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)
其中n為每組中兩個包被濃度的倍數(shù)，[ab’]t和[ab]t分別為每組中兩個50％odmax對應(yīng)的抗體濃度(mol/l)
根據(jù)該公式可求得3e4單抗的親和力常數(shù)為4.1×108mol/l，屬于高親和力抗體，適合elisa檢測。
實施例2溶菌酶多克隆抗體的制備
(一)免疫得到多克隆抗體
用溶菌酶免疫健康新西蘭大白兔(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院)3只，免疫劑量為500μg/只，一免是將溶菌酶與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，乳化完全后多點(diǎn)注射于兔子頸部及背部皮下，2周后加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫為溶菌酶與等體積的弗氏不完全佐劑，免疫劑量和免疫方法同第一次免疫，第三次加強(qiáng)免疫是將未乳化的溶菌酶，進(jìn)行兔子的耳靜脈注射，注射量500μg/只。靜脈注射后7天采集靜脈血測定血清效價，當(dāng)血清效價達(dá)到24及以上時，頸動脈采血并在37℃放置2h，4℃靜置過夜后3000rpm離心20min，收集血清，即獲得多克隆抗體。
(二)辛酸-硫酸銨法純化多克隆抗體：
具體操作如下：
(1)兔血清4℃，12000rpm離心15min，去除雜質(zhì)。
(2)取1份血清與2份醋酸鹽緩沖液(0.06mol/l，ph4.8)混合，室溫攪拌下逐滴加入正辛酸75μl/ml兔血清。
(3)室溫混合30min。
(4)4℃靜置2h以上，使其充分沉淀。
(5)4℃，12000rpm離心30min，棄沉淀。
(6)上清經(jīng)砂芯漏斗過濾后，于50倍體積的0.01mpbs(ph7.4)中4℃透析6h。
(7)在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，4℃靜置1h以上。
(8)4℃，10000rpm離心30min，棄上清。
(9)沉淀用適量含137mmnacl、2.6mmkcl、0.2mmedta的pbs(ph7.4)溶解，于50～100倍體積的上述pbs中4℃過夜透析。
(10)取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后，以紫外分光光度計檢測蛋白含量，sds-page檢測抗體濃度，并分裝保存至-80℃?zhèn)溆谩?/p>
(三)辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體
純化后的多克隆抗體用活化的辣根過氧化物酶試劑盒(galaxybio公司)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法按照試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作方法如下：(1)取100μl抗體溶液(1mg/ml)轉(zhuǎn)入reagentⅰ活化辣根過氧化物酶，稍離心，使辣根過氧化物酶沉到管底，辣根酶管壁上的干粉hrp要完全沖洗溶解?？偟姆磻?yīng)體系控制在100μl/mg活化hrp左右，體系增大影響標(biāo)記率，按照按mg活化hrp對應(yīng)抗體100-500μg，hrp：x的分子mol比保持在30:15～1左右。(2)以reagentⅱ調(diào)ph值至9.5左右，4℃過夜。(3)加入reagentⅲ(約3倍體積的reagentⅱ)，確保酶結(jié)合ph在7.0左右，可以多加reagentⅲ調(diào)整，混勻終止反應(yīng)。(4)加甘油至50％，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例3溶菌酶雙抗夾心elisa檢測方法的操作
(1)用實施例1中制備得到的抗溶菌酶的單抗3e42μg/ml包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃包被過夜；
(2)0.5％的pbst洗滌3次，每次5min；
(3)新鮮配制的2.5％脫脂奶粉(上海生工生物工程有限公司)溶液作為封閉劑，200μl/孔，37℃封閉1h；
(4)0.5％的pbst洗滌3次，每次5min；
(5)將溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品用生理鹽水分別稀釋為0、1.5、3、6、12、24μg/ml的濃度(對應(yīng)a1-a6孔)、及用生理鹽水進(jìn)行1000倍稀釋的待檢樣品—蛋清(共86個，分別對應(yīng)其余86個孔，上海家禽育種有限公司)，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的多抗(實施例2中制備得到的)(1:1600)，各100μl/孔，37℃孵育1h；
(6)0.5％的pbst洗滌3次，每次5min；
(7)加入tmb底物溶液，100μl/孔，37℃孵育15min，立即加入3m硫酸終止反應(yīng)，50μl/孔，酶標(biāo)儀測定od450nm值。
(8)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算部分待檢樣品中溶菌酶的含量，計算結(jié)果見如下表2。
表2各樣品中溶菌酶的濃度
實施例4溶菌酶雙抗夾心elisa檢測試劑盒的組裝
試劑盒包括：包被用的單克隆抗體3e4、辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體、包被液、封閉劑、洗液、系列稀釋的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)多抗稀釋液、底物溶液和終止液；以及說明書一份；
其中包被抗體為實施例1中制備得到的單克隆抗體3e4，檢測抗體為實施例2中制備得到的辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體；封閉劑為2.5％脫脂奶粉溶液；洗液為0.5％pbst；溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的系列稀釋濃度分別為0、1.5、3、6、12和24μg/ml；酶標(biāo)多抗稀釋液為pbst(0.01m的pbs，含tween-200.5％)；底物溶液為tmb溶液；終止液為3m硫酸。