本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領域：
，具體涉及用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物及檢測方法。
背景技術(shù)：
：胃癌(gastriccancer)是死亡率和發(fā)病率較高的人類惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，每年大約有70萬的人口死于胃癌。在全球最常見的惡性腫瘤中胃癌排第4位，僅次于肺癌、腸癌和乳腺癌。同時，更為嚴峻的是胃癌的全球發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出了逐年上升的趨勢。在我國，胃癌也是常見的消化系腫瘤，相對全球胃癌發(fā)病率更高，其5年總生存率只有30％左右，占惡性腫瘤死亡的第一位。目前，制約胃癌患者5年生存率的主要原因是多數(shù)患者就診時已為晚期。因此，明確胃癌的患病原因、尋找早期診斷就顯得尤為重要。目前已知胃癌的發(fā)生與胃部一般疾病(如胃炎、胃切除手術(shù)等)、幽門螺桿菌感染、生活習慣以及易感遺傳因素等有關。而胃癌的家庭聚集現(xiàn)象以及在相同的暴露環(huán)境下只有少數(shù)人患病的事實表明，個體是否患胃癌在很大程度上還取決于個體的遺傳易感性。基因的多態(tài)性是導致疾病發(fā)生遺傳易感性的重要方面，其中以單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphsm，snp)最為常見。snp是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性，它是人類可遺傳的基因組變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。snp在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。近年來，單核苷酸多態(tài)性(snp)在胃癌易感性研究中備受關注，全基因組掃描及遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)，psca基因的rs2294008位點、rs2976392位點以及plce1基因的rs2274223位點、rs3781264位點增加個人患胃癌的風險。因此，通過對這些位點檢測，有助于胃癌的早期預測預防。但迄今為止，本領域未發(fā)現(xiàn)為胃癌易感風險檢測提供一組密切相關的易感基因及引物的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物及檢測方法，其引物特異性好，檢測方法準確性高，可用于胃癌的風險評估，為胃癌的疾病預防提供指導。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物，這些引物包括psca基因rs2294008位點的引物、psca基因rs2976392位點的引物、plce1基因rs2274223位點的引物和plce1基因rs3781264位點的引物；其中，psca基因rs2294008位點的正向引物為5′-agaaggacaaagggagag-3′(seqidno：1)，反向引物為5′-ctcctcatcagcatctct-3′(seqidno：2)；psca基因rs2976392位點的正向引物為5′-acattgagggtgacaaga-3′(seqidno：3)，反向引物為5′-atggggtgagtgagtaagt-3′(seqidno：4)；plce1基因rs2274223位點的正向引物為5′-gcagaggttgtctttcttt-3′(seqidno：5)，反向引物為5′-gagatgtgcttcaaaagtg-3′(seqidno：6)；plce1基因rs3781264位點的正向引物為5′-ctttttcccttcatcactc-3′(seqidno：7)，反向引物為5′-agtagtcttgtgggactgag-3′(seqidno：8)。采用上述引物檢測檢測胃癌易感性相關的snp位點多態(tài)性的方法，包括以下步驟：(1)采集樣品并提取基因組dna；(2)采用上述引物對基因組dna進行pcr擴增，并對擴增產(chǎn)物進行膠回收；(3)對膠回收產(chǎn)物進行濃度測定，計算模板量，然后進行pcr擴增(熒光標記反應)并純化；(4)將步驟(3)中的純化產(chǎn)物在3730型全自動序列分析儀(美國appliedbiosystems公司)上樣，用chromas軟件對snp分型進行分析。進一步地，步驟(2)中pcr擴增體系為：dna模板100-150ng，濃度為5pmol/μl的正向引物3.0μl，濃度為5pmol/μl的反向引物3.0μl，primestarmax25.0μl，用ddh2o補足體積至50μl。進一步地，步驟(2)中pcr擴增反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5min后于4℃保存。進一步地，步驟(3)中pcr擴增體系為：dtcsmastermix2.5μl，濃度為5pmol/μl的反向引物1.0μl，dna模板20ng，用ddh2o補足體積至10μl。進一步地，步驟(3)中pcr擴增反應條件為：94℃預變性30s，94℃變性25s，55℃退火25s，60℃延伸3min，30個循環(huán)，最后60℃延伸20min。本發(fā)明提供的用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物及檢測方法，具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供了用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物，該引物特異性好，準確性好，實現(xiàn)了胃癌易感性相關的snp位點的檢測，提高了檢測效率。(2)本發(fā)明還提供了一種檢測胃癌易感性相關的snp位點多態(tài)性的方法，該方法為直接測序法，本檢測方法簡單，其檢測結(jié)果也具有特異性好，靈敏度高，準確性好等優(yōu)點，可以為胃癌的疾病預防提供指導。附圖說明圖1為不同受檢者血液dna樣品在4種不同引物下的pcr擴增電泳圖；圖2為psca基因的rs2294008位點多態(tài)性檢測結(jié)果圖；圖3為psca基因的rs2976392位點多態(tài)性檢測結(jié)果圖；圖4為plce1基因的rs2274223位點多態(tài)性檢測結(jié)果圖；圖5為plce1基因的rs3781264位點多態(tài)性檢測結(jié)果圖；圖6為psca基因的rs2294008位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖；圖7為psca基因的rs2976392位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖；圖8為plce1基因的rs2274223位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖；圖9為plce1基因的rs3781264位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖。具體實施方式實施例1引物設計針對胃癌易感性相關的snp位點設計了大量的引物，通過引物反應條件的優(yōu)化和比較，篩選出特異性好的四對引物。其中，psca基因rs2294008位點的正向引物為5′-agaaggacaaagggagag-3′(seqidno：1)，反向引物為5′-ctcctcatcagcatctct-3′(seqidno：2)。psca基因rs2976392位點的正向引物為5′-acattgagggtgacaaga-3′(seqidno：3)，反向引物為5′-atggggtgagtgagtaagt-3′(seqidno：4)。plce1基因rs2274223位點的正向引物為5′-gcagaggttgtctttcttt-3′(seqidno：5)，反向引物為5′-gagatgtgcttcaaaagtg-3′(seqidno：6)。plce1基因的rs3781264位點的正向引物為5′-ctttttcccttcatcactc-3′(seqidno：7)，反向引物為5′-agtagtcttgtgggactgag-3′(seqidno：8)。使用胃癌易感性相關的snp位點的引物對待測基因組dna分別進行pcr擴增，pcr擴增體系為：dna模板xμl使其含量為100-150ng，去離子水(19-x)μl，濃度為5pmol/μl的正向引物3.0μl，濃度為5pmol/μl的反向引物3.0μl，primerstarmax25.0μl；擴增反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30個循環(huán)，最后72℃延伸5min后于4℃保存；將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，其中，1、2、3孔為psca基因rs2294008位點的引物擴增出的條帶；4、5、6孔為psca基因rs2976392位點的引物擴增出的條帶；7、8、9孔為plce1基因rs2274223位點的引物擴增出的條帶；10、11、12孔為plce1基因rs3781264位點的引物擴增出的條帶。由圖1可知，目的條帶清晰，無雜帶，且片段大小與設計的大小一致，說明設計的引物特異性好。實施例2胃癌易感性相關的snp位點的檢測(1)提取edta抗凝外周血(肘靜脈血)的dna樣品，提取方法參照血液基因組dna提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)的說明書；(2)對上述dna樣品進行pcr擴增，pcr擴增采用primerstarmaxpremix(2x)(購自北京天根生化科技有限公司)，反應體系如表1所示，引物濃度為5pmol/μl，模板dna的量為100-150ng，加入xμl(根據(jù)提取的dna濃度計算)，pcr擴增反應條件見表2；pcr產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳分離切膠、dna膠回收試劑盒回收dna；電泳參數(shù)為：電壓120v，400ma，時間30min；膠回收方法參照膠回收試劑盒(購自takara)說明書；表1pcr反應體系試劑體積(μl)dnaxddh2o19-xprimerf3.0primerr3.0primerstarmax25.0total50.0表2pcr反應條件(3)將回收后的產(chǎn)物測定其dna濃度后，采用所述引物的反向引物進行pcr擴增(熒光標記反應)，pcr反應體系見表3，模板的量為20ng，根據(jù)純化后dna的濃度計算后加入yμl(根據(jù)提取的dna濃度計算)，pcr擴增條件見表4；然后將濃度為3mol/l，ph值為5.2的醋酸鈉緩沖液、0.1mol/l，ph值為8.0的na2edta緩沖液和glycogen以體積比為2:2:1配制終止液，取5μl終止液加入到pcr產(chǎn)物中，然后用乙醇對產(chǎn)物進行純化，具體純化步驟為：取5μl終止液加入到pcr產(chǎn)物中充分混勻，離心，將液體轉(zhuǎn)移至一支新的1.5mlep管中，然后加入50μl預冷無水乙醇，充分混勻，放入冰箱-20℃冷凍10min后于12000r/min離心5min，棄去上清，再向ep管中加入150μl預冷70％乙醇，放入高速離心機離心，12000r/min離心2min，棄去上清，稍離心，用移液器吸干ep管內(nèi)剩余的液體，打開ep管蓋，室溫晾干至白色沉淀變透明，再向ep管中加入25μlsls(sampleloadingsolution)溶解dna；表3pcr反應體系試劑體積(μl)dtcsmastermix2.5primerr1.0ddh2o6.5-y模板dnay總計10.0表4pcr反應條件(4)將純化產(chǎn)物點樣后裝入abi3730全自動序列分析儀，通過chromas軟件，將所測序列與標準序列進行比對，尋找該snp位點，通過該snp位點處堿基的類型，就可以得到該snp位點的基因型。psca基因rs2294008位點分型結(jié)果見圖2，psca基因rs2976392位點分型結(jié)果見圖3，plce1基因rs2274223位點分型結(jié)果見圖4，plce1基因rs3781264位點分型結(jié)果見圖5。圖2中2-1、2-2和2-3均為psca基因rs2294008位點多態(tài)性檢測的測序結(jié)果圖，基因型依次為gg、aa和ag；其中g(shù)g為rs2294008位點的非易感基因型，而aa和ag為rs2294008位點的易感基因型。圖3中3-1、3-2和3-3均為rs2976392位點多態(tài)性檢測的測序結(jié)果圖，基因型依次為gg、aa和ag；其中g(shù)g為rs2976392位點的非易感基因型，而aa和ag為rs2976392位點的易感基因型。圖4中4-1、4-2和4-3均為rs2274223位點多態(tài)性檢測的測序結(jié)果圖，基因型依次為aa、gg和ag；其中aa為rs2274223位點的非易感基因型，而gg和ag為rs2274223位點的易感基因型。圖5中5-1、5-2和5-3均為rs3781264位點多態(tài)性檢測的測序結(jié)果圖，基因型依次為aa、gg和ag；其中aa為rs3781264位點的非易感基因型，而gg和ag為rs3781264位點的易感基因型。實施例3檢測胃癌易感性相關的snp位點的特異性本檢測方法將特異性定義為測序結(jié)果峰圖無套峰、背景峰、雜峰、飄峰等現(xiàn)象。按照本發(fā)明提供的檢測方法對30個樣品進行檢測，測序峰圖單一，無雙峰、背景峰等現(xiàn)象，30個樣品檢測結(jié)果均相同，說明本發(fā)明提供的檢測方法特異性為100％。實施例4檢測胃癌易感性相關的snp位點的靈敏度和準確度本檢測方法將靈敏度定義為檢測結(jié)果符合率。按照本發(fā)明提供的檢測方法對50個樣品進行檢測，同時采用熒光探針法進行驗證，兩種方法對50個樣品的檢測結(jié)果一致，本檢測方法的準確性達到了100％。psca基因rs2294008位點分型結(jié)果見圖6，psca基因rs2976392位點分型結(jié)果見圖7，plce1基因rs2274223位點分型結(jié)果見圖8，plce1基因rs3781264位點分型結(jié)果見圖9。圖6中6-1、6-2和6-3均為rs2294008位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖，基因型依次為gg、aa和ag；其中g(shù)g為rs2294008位點的非易感基因型，而aa和ag為rs2294008位點的易感基因型。圖7中7-1、7-2、7-3均為rs2976392位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖，基因型依次為gg、aa和ag；其中g(shù)g為rs2976392位點的非易感基因型，而aa和ag為rs2976392位點的易感基因型。圖8中8-1、8-2和8-3均為rs2274223位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖，基因型依次為aa、gg和ag；其中aa為rs2274223位點的非易感基因型，而gg和ag為rs2274223位點的易感基因型。圖9中9-1、9-2和9-3均為rs3781264位點熒光探針法的檢測結(jié)果圖，基因型依次為aa、gg和ag；其中aa為rs3781264位點的非易感基因型，而gg和ag為rs3781264位點的易感基因型。上述結(jié)果圖說明本發(fā)明提供的檢測方法靈敏度和準確度高。實驗例5檢測胃癌易感性相關的snp位點的精密度本檢測方法將精密度定義為對多個樣品分別進行重復檢測后，結(jié)果一致。按照本發(fā)明提供的檢測方法，重復檢測不同人員、不同時間和同一樣品不同孔間的對比實驗，所得結(jié)果均一致，說明該檢測方法精密度為100％。sequencelisting<110>成都中創(chuàng)清科醫(yī)學檢驗所有限公司<120>用于檢測胃癌易感性相關的snp位點的引物及檢測方法<130>2016<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1agaaggacaaagggagag18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2ctcctcatcagcatctct18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3acattgagggtgacaaga18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4atggggtgagtgagtaagt19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<400>5gcagaggttgtctttcttt19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6gagatgtgcttcaaaagtg19<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7ctttttcccttcatcactc19<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agtagtcttgtgggactgag20當前第1頁12