本發(fā)明涉及基因缺失檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測(cè)y染色體微缺失的多重pcr引物組、包括多重pcr引物組的該試劑盒和所述多重pcr引物組及試劑盒作為檢測(cè)y染色體微缺失試劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)的研究報(bào)告，全世界約有15％的育齡夫婦被不孕(育)癥所困擾，其中男性因素約占50％。30％以上男性生不育是由于遺傳學(xué)因素導(dǎo)致，主要為克氏綜合征和y染色體微缺失。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究證實(shí)位于y染色體長(zhǎng)臂上的無(wú)精子因子(azoospermiafactor，azf)區(qū)域的微缺失可以造成生精障礙，導(dǎo)致無(wú)精癥或嚴(yán)重少精子癥。vogt等人將azf區(qū)分為azfa、azfb和azfc三個(gè)亞區(qū)，1998年vogt等人發(fā)現(xiàn)azfb區(qū)和azfc區(qū)之間還存在azfd區(qū)。任何一個(gè)亞區(qū)的微缺失都可能導(dǎo)致生精障礙，而睪丸的病理改變與azf區(qū)微缺失的部位存在明顯的相關(guān)性。目前檢測(cè)y染色體azf區(qū)微缺失已經(jīng)成為男性無(wú)精癥或少精癥患者的常規(guī)檢查。azf區(qū)微缺失是否存在，為遺傳咨詢(xún)提供依據(jù)，也為臨床診斷與后續(xù)治療提供指導(dǎo)。輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是卵細(xì)胞胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmicsperminjection，icsi)技術(shù)給男性不育患者帶來(lái)了希望，然而某些類(lèi)型的y染色體微缺失患者無(wú)法通過(guò)自身睪丸取精進(jìn)行icsi。另外，icsi技術(shù)的局限性是：有可能將攜帶有染色體異常或者基因突變等遺傳缺陷的精子注入到卵細(xì)胞內(nèi)，卵子受精發(fā)育，所攜帶的遺傳缺陷傳遞給下一代。因此，臨床上建議精子濃度＜5×106/ml的男性都要進(jìn)行y染色體微缺失的檢測(cè)。這不僅可以為無(wú)精癥或少精癥患者的遺傳咨詢(xún)提供依據(jù)，也為臨床診斷與后續(xù)治療提供指導(dǎo)，避免不必要的藥物和手術(shù)治療以及遺傳缺陷的傳遞。
因此，建立一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確度高且低成本的分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法對(duì)臨床具有重要意義。
目前y染色體azf區(qū)微缺失的檢測(cè)主要是針對(duì)y染色體特定序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sts)。根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)(eaa)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)(emqn)聯(lián)合發(fā)布的《y染色體微缺失的最佳實(shí)踐操作指南》(2013年)，推薦采用多重pcr檢測(cè)azf區(qū)的6個(gè)sts(azfa：sy84，sy86；azfb：sy127，sy134；azfc：sy254，sy255)。在此基礎(chǔ)上，各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可選擇性地增加sts的數(shù)量進(jìn)行更精確的檢測(cè)。目前檢測(cè)azf區(qū)微缺失的方法包括多重pcr-凝膠電泳法、多重?zé)晒鈖cr法、芯片雜交法、多重連接探針擴(kuò)增(mlpa)等多種方法。最常用的是針對(duì)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sts)，采用多重pcr擴(kuò)增-凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)對(duì)azf各區(qū)的缺失情況做出定性分析。目前該方法已成為檢測(cè)azf微缺失的行業(yè)“金標(biāo)準(zhǔn)”；但是該方法的檢測(cè)敏感性不高，凝膠電泳易造成pcr產(chǎn)物污染導(dǎo)致假陽(yáng)性；每個(gè)樣本需要3-4組pcr反應(yīng)，操作繁瑣，其檢測(cè)通量小，不適用于對(duì)大樣本量的檢測(cè)。多重?zé)晒鈖cr方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但是探針設(shè)計(jì)繁瑣并且需要報(bào)告基團(tuán)修飾，價(jià)格昂貴，不適合臨床推廣使用。目前，根據(jù)上述這兩種檢測(cè)方法，已有多種的y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒面世。芯片雜交技術(shù)也有報(bào)道用于檢測(cè)azf區(qū)微缺失，該方法具有極高的準(zhǔn)確度和靈敏度；但是該方法需要設(shè)計(jì)大量的探針，成本較高，并且其檢測(cè)、分析也較為復(fù)雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。mrc-holland公司的mlpa試劑盒(p360y-chromosome)通過(guò)探針雜交、連接手段分析y染色體特定區(qū)域相對(duì)拷貝數(shù)，該方法覆蓋的范圍廣、能準(zhǔn)確定量分析，但是其結(jié)果分析復(fù)雜，解讀還不完善，目前還只適用于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種檢測(cè)y染色體微缺失的多重pcr引物組、包括多重pcr引物組的該試劑盒和所述多重pcr引物組及試劑盒作為檢測(cè)y染色體微缺失試劑的應(yīng)用。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)多重pcr靈敏度低、非特異性擴(kuò)增等缺點(diǎn)，通過(guò)一套新型的穩(wěn)定的通用引物-多重pcr的反應(yīng)體系結(jié)合熒光標(biāo)記通用引物的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析，確保了檢測(cè)的高靈敏度，有效降低了成本，并且可以實(shí)現(xiàn)大樣本量的高效檢測(cè)。毛細(xì)管的方法具有較高的分辨度和靈敏度，可以檢測(cè)單個(gè)核苷酸的差異，毛細(xì)管電泳圖清晰直觀，易于判讀，減少假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果率，提高了y染色體微卻缺診斷的準(zhǔn)確性。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)y染色體微缺失的多重pcr引物組，該多重pcr引物組包括通用引物和特異性引物，
所述通用引物具有如seqidno：1和seqidno：2所示的堿基序列：
正向dye-universalp-forward(fam-up-f)：5’-ggtgaccaagttcatgctct-3’(seqidno：1)
反向universalp-reverse(up-r)：5’-ggtccaggtcacgagatctt-3’(seqidno：2)
其中，seqidno：1所示堿基序列的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)dye；
所述特異性引物包括具有如seqidno：3～seqidno：22所示堿基序列的引物。具體如表1所示。
所述引物組包括了針對(duì)8個(gè)sts位點(diǎn)(azfa：sy84，sy86；azfb：sy127，sy134；azfc：sy254，sy255；azfd：sy145，sy152)和2個(gè)內(nèi)對(duì)照(sry，zfx/y)的特異性引物序列和一對(duì)通用引物序列。
通用引物中正向引物的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam、hex、vic、tet、joe、rox、texas-red、cy3、cy5或cy5.5。
根據(jù)本發(fā)明，多重pcr引物組中，seqidno：1～seqidno：22的摩爾比優(yōu)選為(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述優(yōu)選比例的各個(gè)引物，能夠獲得更好的檢測(cè)效果。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)y染色體微缺失的試劑盒，該試劑盒包括：
如上所述的多重pcr引物組；
多重pcr反應(yīng)試劑。
其中，所述多重pcr反應(yīng)試劑包括但不限于：mgcl2、甜菜堿、熱啟動(dòng)taq酶、dntps和pcr反應(yīng)緩沖液。
上述pcr反應(yīng)試劑，可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方式進(jìn)行自行配制或通過(guò)普通市售獲得。
根據(jù)本發(fā)明，試劑盒中，所述mgcl2的濃度為50-200mmol/l；所述甜菜堿的濃度為5-20mol/l；所述dntps的濃度為5-20mmol/l。
使用時(shí)，所述mgcl2的終濃度為1.0～5.0mmol/l；所述甜菜堿的終濃度為0.5～2.5mol/l；所述dntps的終濃度為50～1000μmol/l。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，該試劑盒包括：對(duì)照dna標(biāo)本。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述dna標(biāo)本為正常男性對(duì)照標(biāo)本、azfa區(qū)缺失對(duì)照標(biāo)本、azfb區(qū)缺失對(duì)照標(biāo)本和azfc區(qū)缺失對(duì)照標(biāo)本中的至少一種。優(yōu)選地，包括上述全部對(duì)照dna標(biāo)本。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還提供上述的多重pcr引物組或上述的試劑盒作為檢測(cè)y染色體微缺失試劑的應(yīng)用。
應(yīng)用本發(fā)明的多重pcr引物組或試劑盒可用于男性y染色體微缺失通用引物-多重pcr檢測(cè)，檢測(cè)方法包括以下步驟：
1)從待測(cè)人外周血、口腔黏膜上皮細(xì)胞、干血片或者組織切片提取人基因組dna；
2)以步驟1)所得dna為模板，利用所述多重pcr引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
3)多重pcr產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析。
本發(fā)明的8對(duì)引物分別特異性擴(kuò)增azf區(qū)4個(gè)亞區(qū)，2對(duì)內(nèi)對(duì)照引物擴(kuò)增男性特有基因。每條引物的正反向引物的5’端含有一段20bp的共同序列。設(shè)計(jì)的通用引物序列與這一段序列完全一致，并在正向通用引物5’端連接熒光基團(tuán)。本發(fā)明利用一管pcr反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)10對(duì)引物的特異性擴(kuò)增，同時(shí)利用帶熒光的通用引物對(duì)所有特異性擴(kuò)增的目的片段二次擴(kuò)增并帶上熒光，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度呈梯度分布，結(jié)果通過(guò)毛細(xì)管電泳分析，以達(dá)到簡(jiǎn)單、快速、高通量和經(jīng)濟(jì)的目的。
與現(xiàn)有檢測(cè)試劑盒及方法相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
1)檢測(cè)體系里只需要一個(gè)單末端熒光標(biāo)記的引物，不需要多個(gè)taqman等熒光探針，大大降低了成本。
2)單管pcr即可完成所有位點(diǎn)的檢測(cè)，節(jié)省了成本又簡(jiǎn)化了操作，既適用于小樣本的檢測(cè)，也適用于大樣本的通量檢測(cè)。
3)涵蓋了azf4個(gè)亞區(qū)的8個(gè)缺失熱點(diǎn)的檢測(cè)，同時(shí)引入sry和zfx/y基因作為內(nèi)對(duì)照保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4)通過(guò)優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)，本發(fā)明具有穩(wěn)定的、高效的pcr反應(yīng)體系。不僅可以應(yīng)用于外周血樣本，同樣適用于極其微量的樣品，如口腔黏膜脫落細(xì)胞、干血片、組織切片等。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
附圖說(shuō)明
通過(guò)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
圖1示出了不同結(jié)果的特征峰，其中ⅰ行示出了正常男性樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)(8個(gè)sts位點(diǎn)+2個(gè)對(duì)照位點(diǎn))的擴(kuò)增峰；ⅱ行示出了azfa區(qū)缺失[sy84(-)，sy86(-)]樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；ⅲ行示出了azfb區(qū)缺失[sy127(-)，sy134(-)]樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；ⅳ行示出了azfc區(qū)和d區(qū)sy152缺失[sy254(-)，sy255(-)，sy152(-)]樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；ⅴ行示出了azfb+c+d區(qū)缺失[sy127(-)，sy134(-)，sy127(-)，sy134(-)，sy254(-)，sy255(-)，sy145(-)，sy152(-)]樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；f)；ⅵ行示出了azfa+b+c+d區(qū)缺失[sy84(-)，sy86(-)，sy127(-)，sy134(-)，sy127(-)，sy134(-)，sy254(-)，sy255(-)，sy145(-)，sy152(-)]樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰；ⅶ行示出了正常女性樣本經(jīng)多重pcr在10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增峰。
具體實(shí)施方式
下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
實(shí)施例1外周血樣本檢測(cè)azf區(qū)微缺失
1、材料：
1例正常已育男性樣本、1例正常已育女性樣本和5例已經(jīng)確診的azf微缺失型少精或無(wú)精癥男性患者樣本：1例azfa區(qū)缺失樣本(-sy84，-sy86)、1例azfb區(qū)缺失樣本(-sy127，-sy134)、1例azfc區(qū)和d區(qū)sy152缺失樣本(-sy254，-sy255，-sy152)、1例azfb+c+d區(qū)連續(xù)缺失樣本(-sy127，-sy134，-sy254，-sy255)、1例azfa+b+c+d區(qū)連續(xù)缺失樣本(-sy84，-sy86，-sy127，-sy134，-sy254，-sy255)。所有樣本均已通過(guò)eaa/emqn(2013版)的y染色體微缺失檢測(cè)指南推薦的多重pcr-凝膠電泳和實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法驗(yàn)證。
2、基因組dna的提取
使用omega公司“基因組dna抽提試劑盒”從edta抗凝全血中提取人基因組dna。
3、多重pcr擴(kuò)增與檢測(cè)
所有引物在公司合成，其中通用引物的正向引物5’端選用fam修飾，其余引物無(wú)需特殊修飾，所有引物經(jīng)高效液相色譜(hplc)純化。
多重引物組合：每對(duì)正、反向引物按照1：1混合，終濃度10μmol/l，然后將各組引物sy84：sy86：sy127：sy134：sy254：sy255：sy145：sy152：sry：zfx/y：fam-up-f：up-r按照3：2：2：2：1：1：2：2：2：3：3：4的比例配置成多重pcr引物組合存儲(chǔ)液。
pcr實(shí)驗(yàn)選擇kapabiosystems公司的kapahifipcr試劑盒(kk2501)。為了減少人為誤差，簡(jiǎn)化操作流程，本實(shí)施例中首先將pcr擴(kuò)增試劑配置成mix(包括緩沖溶液、dntps、h2o、引物組、hifihotstartdna聚合酶)，分裝至每個(gè)反應(yīng)管；最后加入不同樣本dna(各反應(yīng)組分如表2所示)。
表2.多重pcr反應(yīng)體系
pcr反應(yīng)在abipcr儀器上進(jìn)行，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)：
第一階段：95℃3min；
第二階段：95℃15sec，62℃30sec，72℃45sec，10個(gè)循環(huán)；
第三階段：95℃15sec，58℃30sec，72℃45sec，15個(gè)循環(huán)。
第四階段：72℃15min。
4、毛細(xì)管電泳分析
多重pcr產(chǎn)物采用abiappliedbiosytems公司的3130xl分析儀。取1μl多重pcr產(chǎn)物與8.5μl甲酰胺、0.5ul分子量?jī)?nèi)標(biāo)liz500size混合，95℃加熱3min，-20℃快速降溫并放置3min，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)gene-mapper軟件分析。檢測(cè)位點(diǎn)與相應(yīng)的電泳坐標(biāo)位置如下：zfx/y(527±1)、sry(509±1)、sy254(425±1)、sy84(371±1)、sy86(361±1)、sy134(347±1)、sy127(317±1)、sy145(192±1)、sy152(175±1)、sy255(168±1)。
陽(yáng)性對(duì)照：以正常男性基因組dna作為模板的多重pcr，在上述10個(gè)坐標(biāo)位置均有明確的擴(kuò)增峰。
內(nèi)對(duì)照：以待測(cè)男性基因組dna作為模板的反應(yīng)管內(nèi)，sry(509±1)、zfx/y(527±1)位置均有明確的擴(kuò)增峰。
5、結(jié)果分析
(1)毛細(xì)管電泳結(jié)果的橫坐標(biāo)顯示為擴(kuò)增片段的大小，縱坐標(biāo)顯示為擴(kuò)增片段的熒光強(qiáng)度，間接反應(yīng)片段擴(kuò)增的量。每一個(gè)單一擴(kuò)增峰代表一個(gè)擴(kuò)增片段，沒(méi)有擴(kuò)增峰則表示該片段沒(méi)有擴(kuò)增，該sts位點(diǎn)為缺失。其中，在100bp左右的位置有時(shí)會(huì)出現(xiàn)低矮的擴(kuò)增峰，屬于非特異擴(kuò)增的峰，不干擾結(jié)果的判讀，也不影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，不需考慮。
(2)陽(yáng)性對(duì)照組在8個(gè)sts位點(diǎn)(sy84，sy86，sy127，sy134，sy254，sy255，sy145，sy152)和2個(gè)內(nèi)對(duì)照(sry，zfx/y)具有單一、清楚的擴(kuò)增峰(如圖1的ⅰ行所示)；azf區(qū)完全缺失樣本在這8個(gè)sts位點(diǎn)均無(wú)擴(kuò)增，在2個(gè)內(nèi)對(duì)照(sry，zfx/y)具有擴(kuò)增峰(如圖1的ⅵ行所示)；正常女性對(duì)照在這8個(gè)sts位點(diǎn)和sry位點(diǎn)均無(wú)擴(kuò)增峰(如圖1的ⅶ行所示)，只有zfx/y位點(diǎn)具有擴(kuò)增峰；空白對(duì)照在所有位點(diǎn)均無(wú)擴(kuò)增峰。
(3)azf區(qū)微缺失判定：當(dāng)2個(gè)內(nèi)對(duì)照位置有明確的峰值，只有(-sy84，-sy86)位置不存在擴(kuò)增峰，其余sts擴(kuò)增峰存在，則表明azfa區(qū)缺失(如圖1的ⅱ行所示)；只有(-sy127，-sy134)位置不存在擴(kuò)增峰，則表明azfb區(qū)缺失(如圖1的ⅲ行所示)；只有(-sy254，-sy255)位置不存在擴(kuò)增峰，則表明azfc區(qū)缺失(如圖1的ⅳ行所示)；只有(-sy145，-sy152)位置不存在擴(kuò)增峰，則表明azfd區(qū)缺失；當(dāng)連續(xù)多個(gè)sts為點(diǎn)不存在擴(kuò)增峰，則表明azf亞區(qū)同時(shí)缺失(如圖1的ⅴ行和ⅵ行所示)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的多重pcr引物和試劑盒用于檢測(cè)y染色體微缺失的方法可靠、靈敏度高，成本低，并且可以實(shí)現(xiàn)大樣本量的高效檢測(cè)。
以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說(shuō)明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說(shuō)明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)許多修改和變更都是顯而易見(jiàn)的。
sequencelisting
<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院
<120>檢測(cè)y染色體微缺失的多重pcr引物組、試劑盒和應(yīng)用
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