本發(fā)明涉及一種參與紫草素生物合成的aepgt-6蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：藥用植物活性成分通常是植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中次生代謝產(chǎn)生的一類(lèi)小分子有機(jī)化合物。活性成分生物合成途徑的解析是藥用植物次生代謝產(chǎn)物研究的核心內(nèi)容。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)，這些基因的克隆將為詮釋藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來(lái)廣闊的應(yīng)用空間。新疆紫草arnebiaeuchroma(royle)johns是傳統(tǒng)中藥材紫草arnebiaeradix的重要來(lái)源，已被列為野生藥材動(dòng)植物資源三類(lèi)保護(hù)品種。新疆紫草的有效化學(xué)成分主要分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是脂溶性的萘醌類(lèi)化合物，紫草素類(lèi)化合物；另一類(lèi)是水溶性成分，主要是多糖類(lèi)和酚酸類(lèi)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)紫草素類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗hiv活性、調(diào)節(jié)免疫、抗生育、抗血栓、鎮(zhèn)靜、促進(jìn)傷口愈合等多種臨床作用，在醫(yī)藥行業(yè)應(yīng)用廣泛。此外，紫草素更是重要的天然染料被國(guó)際上稱(chēng)為“天然紅色素之王”，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。紫草素為萘醌類(lèi)化合物，在植物體內(nèi)通過(guò)苯丙氨酸(phenylalaninepathway，pp)-甲羥戊酸(mevalonatepathway，mva)/去氧木酮糖磷酸(2-c-methyl-d-erythritol4-phosphate，mep)途徑復(fù)合途徑合成，由一分子對(duì)-羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoicacid，phba)和一分子焦磷酸香葉酯(geranylpyrophosphate，gpp)結(jié)合，形成紫草素的基本骨架——香葉烯基對(duì)羥基苯甲酸(3-geranyl-4-hydroxybenzoicacid，gba)，gba為再經(jīng)過(guò)一系列的脫羧、加氧、脫氫生成紫草素。對(duì)-羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶(4-hydroxybenzoategeranyltransferase，pgt)將兩個(gè)途徑聯(lián)系起來(lái)，屬于紫草素生物合成過(guò)程的特有酶促反應(yīng)，能夠催化gpp和phba結(jié)合產(chǎn)生gba。對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶(pgt)是紫草細(xì)胞中紫草素衍生物生物合成的一個(gè)關(guān)鍵而重要的代謝酶，它將甲羥戊酸代謝途徑形成的gpp的香葉烯基轉(zhuǎn)移到來(lái)自苯丙素類(lèi)代謝途徑的phba上形成香葉烯基對(duì)羥基苯甲酸(gba)，最終反應(yīng)生成紫草素及其衍生物。pgt位于紫草細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，增加或減少它的活性直接影響到紫草素的產(chǎn)生，故在紫草素形成的過(guò)程中起著重要的作用。在紫草培養(yǎng)細(xì)胞中，pgt基因的表達(dá)模式與其酶活性變化和紫草素及其衍生物的形成具有高度的一致性，可見(jiàn)pgt基因的表達(dá)水平對(duì)調(diào)控紫草素及其衍生物形成的重要性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種參與紫草素生物合成的aepgt-6蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，獲自新疆紫草，命名為aepgt-6蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a1)中的蛋白質(zhì)便于純化和檢測(cè)，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(a2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。本發(fā)明還保護(hù)編碼aepgt-6蛋白的基因(aepgt-6基因)。所述aepgt-6基因?yàn)槿缦?b1)-(b3)中任一所述的dna分子：(b1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)在嚴(yán)格條件下與(b1)限定的dna序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的dna分子；(b3)與(b1)或(b2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。本發(fā)明還保護(hù)aepgt-6蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)和/或(c2)：(c1)作為對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶；(c2)催化對(duì)羥基苯甲酸和焦磷酸香葉酯反應(yīng)產(chǎn)生香葉烯基-對(duì)羥基苯甲酸。本發(fā)明還保護(hù)一種重組菌(重組菌甲)，是將aepgt-6基因?qū)胨拗骶械玫降?；所述宿主菌不能生產(chǎn)焦磷酸香葉酯。本發(fā)明還保護(hù)一種重組菌(重組菌乙)，是將aepgt-6基因?qū)胨拗骶械玫降?；所述宿主菌可以生產(chǎn)焦磷酸香葉酯。所述可以生產(chǎn)焦磷酸香葉酯的宿主菌具體可為釀酒酵母k197g。所述aepgt-6基因可通過(guò)含有aepgt-6基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌得到重組菌?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有aepgt-6基因的重組表達(dá)載體。使用aepgt-6基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；此外，使用aepgt-6基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。所述重組表達(dá)載體具體可為將pesc-his質(zhì)粒bamhi和apai酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列2自5’端第1-924位核苷酸所示的dna分子得到的重組表達(dá)載體。本發(fā)明還保護(hù)一種對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)以上任一所述重組菌，從重組菌中得到對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶。所述培養(yǎng)以上任一所述重組菌包括如下步驟：(a1)將重組菌接種至sd-his-ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌液；(a2)將步驟(a1)培養(yǎng)后的菌液離心收集沉淀；(a3)使用含2％(質(zhì)量百分比)半乳糖的sd-his-ura培養(yǎng)基重懸步驟(a2)得到的菌體，繼續(xù)培養(yǎng)。步驟(a1)中，所述培養(yǎng)具體可為30℃、200r.min-1培養(yǎng)。步驟(a1)中，所述菌液od600nm＝0.6。步驟(a2)中，所述離心具體可為3000g離心。步驟(a3)中，所述培養(yǎng)具體可為30℃、200r.min-1培養(yǎng)。步驟(a3)中，所述培養(yǎng)時(shí)間具體可為48h。所述培養(yǎng)以上任一所述重組菌還包括完成步驟(a3)后，收集培養(yǎng)體系，離心收集菌體沉淀。所述離心具體可為3000g離心。所述從重組菌中得到對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶的方法具體可為從所述菌體沉淀中提取酵母微粒體蛋白，得到對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶。所述提取酵母微粒體蛋白具體可采用玻璃珠法。本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述重組菌在制備對(duì)羥基苯甲酸香葉烯基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)香葉烯基對(duì)羥基苯甲酸的制備方法，為方法甲或方法乙。所述方法甲包括如下步驟：培養(yǎng)所述重組菌甲，同時(shí)加入對(duì)羥基苯甲酸和焦磷酸香葉酯，從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到香葉烯基對(duì)羥基苯甲酸。所述方法乙包括如下步驟：培養(yǎng)以上任一所述重組菌乙，同時(shí)加入對(duì)羥基苯甲酸，從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到香葉烯基-對(duì)羥基苯甲酸。方法甲或方法乙中，所述培養(yǎng)具體可為將可以生產(chǎn)焦磷酸香葉酯的重組菌接種至含2％(質(zhì)量百分比)半乳糖的sd-his-ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)體系初始o(jì)d600nm＝0.5。所述培養(yǎng)具體可為30℃、200r.min-1培養(yǎng)。所述培養(yǎng)時(shí)間可為36h-72h。所述培養(yǎng)時(shí)間具體可為36h。所述培養(yǎng)時(shí)間具體可為72h。所述培養(yǎng)時(shí)間具體可為48h。方法甲或方法乙中，對(duì)羥基苯甲酸的使用濃度為0.05mm-1mm。對(duì)羥基苯甲酸的使用濃度具體可為0.05mm。對(duì)羥基苯甲酸的使用濃度具體可為0.1mm。對(duì)羥基苯甲酸的使用濃度具體可為0.5mm。對(duì)羥基苯甲酸的使用濃度具體可為1mm。方法甲或方法乙中，所述從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到香葉烯基-對(duì)羥基苯甲酸具體可通過(guò)hplc分離純化實(shí)現(xiàn)。所述從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到香葉烯基對(duì)羥基苯甲酸具體包括如下步驟：(b1)將培養(yǎng)產(chǎn)物采用乙酸乙酯超聲提取，收集上清液(有機(jī)相)；(b2)將步驟(b1)提取的上清液(有機(jī)相)用氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴ズ笥眉状既芙猓瑢⑷芤寒a(chǎn)物過(guò)濾后通過(guò)hplc分離純化。步驟(b1)中，所述培養(yǎng)產(chǎn)物與乙酸乙酯的體積配比為1∶1。步驟(b2)中，所述過(guò)濾為0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。所述hplc分離純化的參數(shù)如下：色譜柱為watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；流動(dòng)相由溶液a和b組成；溶液a為乙腈；溶液b為0.1％(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；流速：0.5ml/min；洗脫程序?yàn)椋?min：10％溶液a；4min：35％溶液a；4.3min：60％溶液a；8min；72％溶液a：8.5min，98％溶液a；10.5min：98％溶液a；11min：10％溶液a；13min：10％溶液a；收集保留時(shí)間為5.79min出現(xiàn)的色譜峰對(duì)應(yīng)的洗脫液；柱溫40℃；pda檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描。本發(fā)明還保護(hù)試劑盒甲，所述試劑盒甲包括所述重組菌甲、對(duì)羥基苯甲酸和焦磷酸香葉酯。本發(fā)明還保護(hù)試劑盒乙，所述試劑盒乙包括以上任一所述重組菌乙和對(duì)羥基苯甲酸。所述組合物甲或組合物乙還包括sd-his-ura培養(yǎng)基。所述組合物甲或組合物乙的用途為生產(chǎn)香葉烯基-對(duì)羥基苯甲酸。以上任一所述sd-his-ura培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在sd-his-ura培養(yǎng)基中的濃度為：無(wú)氨基酵母氮源0.67g/100ml、葡萄糖2g/100ml、硫酸亞鐵銨0.4g/100ml、瓊脂2g/100ml、腺嘌呤20mg/100ml、l-纈氨酸150mg/100ml、l-異亮氨酸30mg/100ml、l-精氨酸20mg/100ml、l-亮氨酸100mg/100ml、l-賴(lài)氨酸30mg/100ml、l-甲硫氨酸20mg/100ml、l-苯丙氨酸50mg/100ml、l-蘇氨酸200mg/100ml、l-色氨酸20mg/100ml、l-酪氨酸30mg/100ml、l-天冬氨酸10mg/100ml、l-絲氨酸40mg/100ml、l-谷氨酸10mg/100ml。本發(fā)明提供的aepgt-6蛋白與紫草素類(lèi)化合物合成代謝密切相關(guān)，能催化對(duì)羥基苯甲酸(phba)和焦磷酸香葉酯(gpp)結(jié)合形成gba。本發(fā)明對(duì)于調(diào)節(jié)生產(chǎn)植物萘醌類(lèi)化合物和通過(guò)生物技術(shù)提高新疆紫草中萘醌類(lèi)活性成分紫草素類(lèi)的含量具有重要的理論和實(shí)際意義。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例2中液相色譜檢測(cè)結(jié)果。圖2為實(shí)施例2中核磁共振氫譜(hnmr)圖。圖3為實(shí)施例2中核磁共振碳譜(cnmr)圖。圖4為實(shí)施例2中hmbc圖。圖5為實(shí)施例2中高分辨質(zhì)譜圖。圖6為實(shí)施例2中新產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式。圖7為phba和gpp反應(yīng)生成gba的反應(yīng)過(guò)程。圖8為實(shí)施例3中g(shù)ba產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。pesc-his質(zhì)粒：安捷倫科技(中國(guó))有限公司，貨號(hào)：217451。釀酒酵母k197g：參考文獻(xiàn)：fischermj，meyers，claudelp，etal.metabolicengineeringofmonoterpenesynthesisinyeast.[j].biotechnologyandbioengineering，2011，108(8)：1883-92.；釀酒酵母k197g在文獻(xiàn)中的名稱(chēng)為“k197g”，公眾可以從中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所獲得。sd-his-ura培養(yǎng)基：北京泛基諾科技有限公司，貨號(hào)：ygm003a-13。sd-his-ura培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在sd-his-ura培養(yǎng)基中的濃度為：無(wú)氨基酵母氮源0.67g/100ml、葡萄糖2g/100ml、硫酸亞鐵銨0.4g/100ml、瓊脂2g/100ml、腺嘌呤20mg/100ml、l-纈氨酸150mg/100ml、l-異亮氨酸30mg/100ml、l-精氨酸20mg/100ml、l-亮氨酸100mg/100ml、l-賴(lài)氨酸30mg/100ml、l-甲硫氨酸20mg/100ml、l-苯丙氨酸50mg/100ml、l-蘇氨酸200mg/100ml、l-色氨酸20mg/100ml、l-酪氨酸30mg/100ml、l-天冬氨酸10mg/100ml、l-絲氨酸40mg/100ml、l-谷氨酸10mg/100ml。無(wú)氨基酵母氮源：sigma公司，貨號(hào)：y0626。phba：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)：131109。phba的分子式為c7h6o3，cas號(hào)為：99-96-7，結(jié)構(gòu)式如下：gpp：美國(guó)sigma-aldrich公司，貨號(hào)：76532-10mg。gpp的分子式為c10h20o7p2，cas號(hào)為：21141-43-5，結(jié)構(gòu)式如下：實(shí)施例1、aepgt-6蛋白及其編碼基因的獲得通過(guò)對(duì)新疆紫草進(jìn)行大量序列分析、表達(dá)量分析與功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)dna編碼序列，如序列表的序列2所示，其編碼的蛋白質(zhì)如序列表的序列1所示。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為aepgt-6蛋白，由307個(gè)氨基酸殘基組成。將編碼aepgt-6蛋白的基因命名為aepgt-6基因，其開(kāi)放閱讀框如序列表的序列2自5’末端第1-924位核苷酸所示。實(shí)施例2、aepgt-6蛋白功能分析一、重組菌株的構(gòu)建1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pesc-aepgt-6。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pesc-aepgt-6進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：以pesc-his質(zhì)粒為出發(fā)載體，將pesc-his質(zhì)粒bamhi和apai酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為序列表的序列2自5’端第1-924位核苷酸所示的dna分子。2、將步驟1制備的重組質(zhì)粒pesc-aepgt-6轉(zhuǎn)化釀酒酵母k197g，得到重組菌株k197g-aepgt-6；將pesc-his質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母工程菌株k197g，得到重組菌株k197g-pesc-his(轉(zhuǎn)空載體菌株)。二、體外酶促實(shí)驗(yàn)待測(cè)菌株為：步驟一得到的重組菌株k197g-aepgt-6或重組菌株k197g-pesc-his(轉(zhuǎn)空載體菌株)。1、將待測(cè)菌株的單菌落接種于5mlsd-his-ura培養(yǎng)基中，30℃、200r.min-1培養(yǎng)24h；然后取1ml菌液接種至50mlsd-his-ura培養(yǎng)基中，30℃、200r.min-1培養(yǎng)至菌液od600nm＝0.6，3000g離心培養(yǎng)體系，棄上清，用去離子水洗滌菌體沉淀后，使用50ml含2％(質(zhì)量百分比)半乳糖的sd-his-ura培養(yǎng)基重懸菌體，30℃、200r.min-1培養(yǎng)48h，3000g離心培養(yǎng)體系，棄上清，收集菌體。2、取步驟1得到的菌體，采用玻璃珠法提取酵母微粒體蛋白，依次按照如下步驟操作得到酵母微粒體蛋白溶液：(1)采用5mltek緩沖液(0.1mkcl+te緩沖液)重懸步驟1收集的菌體，室溫放置5min，離心收集菌體。(2)用500μl冰浴的tesb緩沖液(0.6m山梨醇+te緩沖液)重懸菌體，得到菌懸液。(3)向菌懸液中小心加入玻璃珠，使其剛好接觸菌懸液表面，4℃渦旋震蕩30min破碎菌體，加入1ml的tesb緩沖液，回收上清。(4)重復(fù)(3)中的tesb清洗3次，合并上清。將回收的上清4℃，12000rpm離心15min，收集上清。(5)向上清中加入2倍體積的沉淀緩沖液(tesb緩沖液+0.225mnacl+0.15g/mlpeg4000)，冰浴15min，4℃，12000rpm離心15min，棄上清收集沉淀。(6)采用400μlteg緩沖液(te緩沖液+20％甘油)溶解沉淀。3、將步驟2得到的酵母微粒體蛋白溶液進(jìn)行蛋白定量，蛋白濃度為20mg/ml。4、取步驟3定量后的酵母微粒體蛋白溶液，進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)體系為：微粒體蛋白溶液(蛋白含量為500μg)，tris-hcl(ph7.8)50mm，phba200nmol，gpp100nmol，mgcl210μmol，補(bǔ)充蒸餾水至250μl。反應(yīng)條件為：30℃、150rpm反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后加入1μl甲酸終止反應(yīng)。5、采用高效液相色譜檢測(cè)步驟4得到的反應(yīng)產(chǎn)物，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入250μl乙酸乙酯，渦旋1min，室溫下10000g離心2min，小心的吸取上清(有機(jī)相)，n2吹干，加入250μl甲醇溶解，0.22微孔濾膜過(guò)濾，用于檢測(cè)；hplc檢測(cè)采用watersacquity-uplc-pda系統(tǒng)。檢測(cè)參數(shù)如下：色譜柱：watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；洗脫液：洗脫液由a液(50％)和b液(50％)組成，a液為乙腈，b液為0.1％(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液。流速：0.5ml/min；柱溫40℃；pda檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果如圖1所示。圖1中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為紫外吸光度。圖1結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)空載體菌株相比，重組菌株k197g-aepgt-6的體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)了新產(chǎn)物。收集新產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的洗脫峰，通過(guò)核磁和質(zhì)譜進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)物表征。核磁共振氫譜(hnmr)圖見(jiàn)圖2。核磁共振碳譜(cnmr)圖見(jiàn)圖3。hmbc圖見(jiàn)圖4，高分辨質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。核磁1h-nmr，13c-nmr表征結(jié)果分析見(jiàn)表2。表2核磁1h-nmr，13c-nmr表征結(jié)果分析分析結(jié)果表明：phba和gpp在aepgt-6的催化下，生成了分子量為274.16(m/z)的新產(chǎn)物，認(rèn)為該產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖6)為gba，phba和gpp反應(yīng)生成gba的反應(yīng)過(guò)程見(jiàn)圖7。將gba產(chǎn)物經(jīng)高效液相進(jìn)行純度檢測(cè)，純度在98％以上。實(shí)施例3、重組菌k197g-aepgt-6發(fā)酵生產(chǎn)gba及其產(chǎn)量分析1、將實(shí)施例2制備的重組菌株k197g-aepgt-6接種于10ml含有不同濃度phba(0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm)的含2％(質(zhì)量百分比)半乳糖的sd-his-ura培養(yǎng)基中(初始菌液od600nm＝0.5)，30℃、200r.min-1培養(yǎng)不同時(shí)間(36h、72h)，得到菌液。2、取5ml步驟1得到的菌液，加入5ml乙酸乙酯，超聲提取2h，離心收集上清有機(jī)相，保留下層菌液。3、取步驟2的下層菌液中再次加入等體積乙酸乙酯，超聲提取2h，離心收集上清有機(jī)相。4、合并步驟2和步驟3得到的上清有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴?，得到混合物?、用1.5ml甲醇溶解步驟4得到的混合物，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，用于uplc含量檢測(cè)。hplc檢測(cè)采用watersacquity-uplc-pda系統(tǒng)。檢測(cè)參數(shù)如下：色譜柱：watersc181.8μm2.1×100mmt3hhs；洗脫液由溶液a和溶液b組成：溶液a為乙腈，溶液b為0.1％(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液。流速：0.5ml/min；采用梯度洗脫的方式：0min：10％溶液a；4min：35％溶液a；4.3min：60％溶液a；8min；72％溶液a：8.5min，98％溶液a；10.5min：98％溶液a；11min：10％溶液a；13min：10％溶液a。柱溫40℃；pda檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描。采用實(shí)施例2純化后的gba產(chǎn)物(純度在98％以上)作為標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為5.79min，收集在相同時(shí)間出峰的gba產(chǎn)物。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算gba的產(chǎn)量。結(jié)果如圖8所示。圖8中，1-5為培養(yǎng)36h的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，6-10為72h的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。1-5依次為培養(yǎng)基中的phba濃度為0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，6-10依次為培養(yǎng)基中的phba濃度為0mm、0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，gba的產(chǎn)量隨phba的濃度增加而增加，在含有1mmphba的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)72h，gba的產(chǎn)量可以達(dá)到71.69mg/l培養(yǎng)體系。實(shí)施例4、同源重組菌株對(duì)照實(shí)驗(yàn)1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pesc-aepgt。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pesc-aepgt進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：以pesc-his質(zhì)粒為出發(fā)載體，將pesc-his質(zhì)粒bamhi和apai酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列4自5’端第1-921位核苷酸所示的dna分子。所述序列4編碼序列3所示的蛋白質(zhì)(序列3所示的蛋白質(zhì)為aepgt-6蛋白的同源蛋白)。2、將步驟1制備的重組質(zhì)粒pesc-aepgt轉(zhuǎn)化釀酒酵母k197g，得到重組菌株k197g-aepgt。3、取實(shí)施例2構(gòu)建的重組菌株k197g-aepgt-6和步驟2制備的重組菌株k197g-aepgt，進(jìn)行如下操作：(1)將重組菌株接種于10ml含有1mmphba的含2％(質(zhì)量百分比)半乳糖的sd-his-ura培養(yǎng)基中(初始菌液od600nm＝0.5)，30℃、200r.min-1培養(yǎng)48h，得到菌液。(2)取5ml步驟(1)得到的菌液，加入5ml乙酸乙酯，超聲提取2h，離心收集上清有機(jī)相。(3)取步驟(2)得到的上清有機(jī)相，加入等體積乙酸乙酯，超聲提取2h，離心收集上清有機(jī)相。(4)取步驟(3)得到的上清有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴ィ玫交旌衔铩?5)用1.5ml甲醇溶解步驟4得到的混合物，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，用于uplc含量檢測(cè)。hplc檢測(cè)參數(shù)和方法與實(shí)施例3步驟5相同。采用實(shí)施例2純化后的gba產(chǎn)物(純度在98％以上)作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算gba的產(chǎn)量。經(jīng)過(guò)計(jì)算，重組菌株k197g-aepgt-6的發(fā)酵產(chǎn)物gba產(chǎn)量為70.96mg/l，重組菌株k197g-aepgt的發(fā)酵產(chǎn)物gba產(chǎn)量為20.86mg/l。<110>中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所<120>一種參與紫草生物合成的aepgt-6蛋白及其編碼基因與應(yīng)用<160>4<210>1<211>307<212>prt<213>紫草（arnebiaeuchroma）<400>1metthrtyrlysglnserleulyslysglnasnlysargprosertrp151015ileaspthrasnleuproilethrpheglnprotyralahisleuala202530argleuasplysproileglysertrpleuleualatrpproalaphe354045trpservalalaleualaalaaspaspleuglyserleuprolysmet505560leualailepheglytrptrpalailetrpileargglyalaglycys65707580thrileasnasptyrpheaspargasppheasplyslysvalgluarg859095thrlysserargproleualaserglyalaleuserproalaglngly100105110leutrptrpleualaileglnleuphemetglyleuglyvalleutyr115120125glnleuasnmetleuthrleuvalleualaileleuhisvalproleu130135140valphealatyrproleumetlysargilethrtyrtrpproglnala145150155160pheleuglyvalmetilesertrpglyalaleuleuglyproalaala165170175leugluglythrileaspprolysilealacysproleutyrvalser180185190serphephetrpthrleuvaltyraspthriletyralahisglnasp195200205lysgluaspaspalalysalaglyilelysserthrthrleuargphe210215220glyaspleuthrlysvaltrpvalglyglypheglyvalalacysthr225230235240leualaleuleuleuglyglyphevalileasnileglyleuprotyr245250255tyrvalvalleuthrvalalathrcysglnleualatrpglnileval260265270thrvalaspleuserserprometaspcysglyarglysphevalser275280285asnglntrptyrglyalaileilepheseralaileleuvalglylys290295300leuileser305<210>2<211>924<212>dna<213>紫草（arnebiaeuchroma）<400>2atgacttacaaacaatcactaaagaaacagaataagagaccatcttggatagacacaaat60ctgccaataacatttcagccttatgcacatcttgcaaggttagataagcctataggtagt120tggttgctagcttggccagctttctggtccgtcgcattagcagcggacgatcttggaagc180ctgcctaaaatgttggcaatattcggatggtgggcaatttggattcgtggtgcaggatgt240actatcaatgattattttgatagagattttgataagaaggttgaacgtacaaagtctagg300ccacttgctagtggcgctttgtccccggctcaaggtctttggtggcttgccattcaattg360ttcatgggtctaggtgttctttaccaattgaatatgttgactcttgtattagctattctt420catgtacctttggtgtttgcttatcccctcatgaaaaggatcacatattggcctcaagct480tttctcggagtgatgattagttggggagctttattgggaccggccgctcttgaaggaacc540attgatcccaaaattgcttgtccactttatgtttctagtttcttttggacgcttgtttat600gatacaatatatgcacatcaagataaagaagatgatgccaaggctggaattaaatcaaca660actttgaggtttggagatttaaccaaagtatgggttggaggttttggagtggcatgcacc720cttgctttgcttcttggtgggtttgttatcaatattggattaccttactatgtagttttg780actgttgcaacttgtcaattagcatggcaaattgttacagttgacctatcttcaccgatg840gattgtggtagaaaatttgtttctaaccaatggtatggtgctattatctttagcgccatc900ctagtaggaaaattgatttcttaa924<210>3<211>306<212>prt<213>紫草（arnebiaeuchroma）<400>3metthrserlysglnalaglnglnlyslysglylysglnprosertrp151015ilegluleutyrleuprolysgluvalargprotyralahisleuala202530argleuasplysproileglysertrpleuleualatrpproalaphe354045trpservalalaleuvalalaasppheglyserleuprolysmetleu505560alailepheglytrptrpalavaltrpileargglyalaglycysthr65707580ileasnasptyrpheaspargasppheasplyslysvalgluargthr859095lysserargproleualaserglyalavalserproserglnglyleu1001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