專(zhuān)利名稱(chēng)：一種維護(hù)線(xiàn)粒體功能的營(yíng)養(yǎng)組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種維護(hù)線(xiàn)粒體功能的營(yíng)養(yǎng)組合物，及其制備方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及發(fā)明人對(duì)呼吸鏈和線(xiàn)粒體研究的一項(xiàng)突破性進(jìn)展，即發(fā)現(xiàn)了呼 吸鏈電子漏旁路，并提出了線(xiàn)粒體自由基代謝的概念。根據(jù)這一概念可以確定
呼吸鏈和ATP酶偶聯(lián)在一起就是一部坐落在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"，一 個(gè)細(xì)胞內(nèi)有很多的線(xiàn)粒體，每個(gè)線(xiàn)粒體內(nèi)又有很多這樣的"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"，如此 巨大的"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"群成為維持和推動(dòng)細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)力。如果多數(shù)"分 子發(fā)動(dòng)機(jī)"被損傷，細(xì)胞將失去必要的能量供給，其結(jié)果將是耗能最大的神經(jīng) 和肌肉組織發(fā)生病變并引起衰老、衰竭、和死亡。過(guò)去對(duì)"呼吸鏈"的研究主 要是在探討"呼吸鏈"傳遞電子的功能，"呼吸鏈"傳遞電子是把食物中固化的 太陽(yáng)能釋放出來(lái)用于制造ATP的過(guò)程。本發(fā)明人在對(duì)"呼吸鏈"的一項(xiàng)研究中， 突破性地發(fā)現(xiàn)了 "呼吸鏈"在傳遞電子制造ATP的同時(shí)也通過(guò)漏電旁路制造O 和H202，這些02 和11202是氧毒性分子具有潛在危害性。過(guò)多的Of和H202 會(huì)引起"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"自身的氧化損傷，這種自身的氧化損傷正是細(xì)胞衰老的 內(nèi)在原因。
圖1引自發(fā)明人發(fā)表的科學(xué)論文(Xu Jian-xing 2004 Ann. N. Y. Acad. Sci. 1011:57-60),該圖根據(jù)呼吸鏈電子漏旁路原理和線(xiàn)粒體自由基代謝的概念描述 了 "分子發(fā)動(dòng)機(jī)"的工作原理。圖的下半部分表示呼吸鏈傳遞電子與ATP酶偶 聯(lián)制造ATP的過(guò)程，相當(dāng)于"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"做"有用功"；圖的上半部分表示呼 吸鏈漏電子進(jìn)行自由基代謝的過(guò)程，相當(dāng)于"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"做"無(wú)用功"。根據(jù) 熱力學(xué)原理，任何熱機(jī)做"無(wú)用功"都是導(dǎo)致機(jī)器磨損老化的內(nèi)在原因。
基于這一原理本發(fā)明從維護(hù)保養(yǎng)"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"的角度提出一種營(yíng)養(yǎng)組合 物，能夠有效抑制上述的氧化損傷，維護(hù)線(xiàn)粒體的功能，改善細(xì)胞的能量供給， 延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能、延緩細(xì)胞衰老的 組合物。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
提供一種維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能的組合物，其中含有輔酶Q,o、硒元素和自由 基清除劑；所述自由基清除劑可以是各種用于減少自由基損傷的化合物、中藥提取物或它們的組合；所述組分的重量比為輔酶Qu):硒元素自由基清除劑 =0.5~2 :0,001 : 1~3。
所述自由基清除劑選自維生素E、維生素C、硫辛酸、丹參素或(3-胡蘿卜素 中的一種或兩種以上的混合物。
所述硒元素可以來(lái)自無(wú)機(jī)硒微量元素或有機(jī)硒制品，如納米硒、亞硒酸鈉、 依布硒啉等富硒制品。
本發(fā)明還提供所述組合物在制備維護(hù)線(xiàn)粒體功能的藥物或保健品中的應(yīng)用。
所述應(yīng)用是以所述組合物為藥效成分，結(jié)合制藥生產(chǎn)上可接受的常規(guī)輔料， 按照常規(guī)方法制備成藥物片劑，膠丸，或膠囊；或以所述組合物為活性成分， 按照常規(guī)方法制備成保健品片劑，膠丸，或膠囊。
所述藥物或保健品可以用于延緩衰老和預(yù)防老年退行性疾病的發(fā)生，也可 用于改善神經(jīng)肌肉病理癥狀，以及用于心血管疾病的治療。
"呼吸鏈"傳遞電子是制造ATP的過(guò)程，受損傷的"呼吸鏈"則因傳遞電 子不通暢而導(dǎo)致漏電增多，其結(jié)果是02-'和11202這些有害活潑氧副產(chǎn)物的增加 和ATP合成效率的下降，這正是本發(fā)明提出保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能的出發(fā)點(diǎn)。本發(fā)明 設(shè)計(jì)的輔酶Q1Q、硒和自由基清除劑的組合物是在全面分析呼吸鏈電子漏特性和 線(xiàn)粒體自由基代謝原理的基礎(chǔ)上提出的一種維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能的綜合措施。
輔酶Qn)是"呼吸鏈"的一種成份，它在"呼吸鏈"的中段行使轉(zhuǎn)移電子的 功能，輔酶Qio從兩個(gè)脫氫酶(FMN)和(FPS)接受電子轉(zhuǎn)移給細(xì)胞色素鏈，電 子再經(jīng)細(xì)胞色素鏈的(Cytbd) (Cytc) (Cytaa3)順序傳遞最終把02還原成H20 完成生物氧化過(guò)程。資料表明衰老和心肌缺血患者都有輔酶Qh)含量偏低的表 現(xiàn)，缺少輔酶Qu)導(dǎo)致"呼吸鏈"傳遞電子的效率下降，類(lèi)似汽車(chē)油門(mén)堵塞變小 的效果。添加輔酶Qu)可以增強(qiáng)"呼吸鏈"傳遞電子的活性，是改善細(xì)胞能量供 給功能的一種措施。然而呼吸鏈電子漏旁路的發(fā)現(xiàn)揭示出輔酶Qu)也是呼吸鏈漏 電產(chǎn)生Of和H202的一個(gè)部位，這一發(fā)現(xiàn)也揭示出O 和H202的產(chǎn)生正是輔 酶Qn)藥物副作用的原因。本發(fā)明人基于這一分析提出了輔酶()1()與清除0 和
H202的化合物聯(lián)合使用的措施，既達(dá)到發(fā)揮輔酶Qu)增強(qiáng)"呼吸鏈"傳遞電子
的活性的效果，又可以避免單獨(dú)使用輔酶Qu)引起的副作用。
硒的使用涉及到線(xiàn)粒體內(nèi)基質(zhì)中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，硒是該酶的必須 元素，缺硒使谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性降低，其結(jié)果會(huì)使線(xiàn)粒體基質(zhì)中的遺傳 質(zhì)mDNA受到未被及時(shí)清除的02''和H202的氧化損傷，這種氧化損傷不僅引 起衰老，而且mDNA的缺陷導(dǎo)致一系列的母系遺傳疾病，這些病大多是以神經(jīng) 肌肉病變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)內(nèi)科疑難癥，目前尚無(wú)治療手段。
4因此，本發(fā)明提出的輔酶Qn)、硒和自由基清除劑的組合物能夠有效地維護(hù)
保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能，它能提高"呼吸鏈"傳遞電子的活性，保護(hù)線(xiàn)粒體DNA免受 損傷。
線(xiàn)粒體功能的完好是健康長(zhǎng)壽的基礎(chǔ)，線(xiàn)粒體受損主要引起神經(jīng)和肌肉病 變?yōu)樘卣鞯牟“Y，這些病癥也是衰老和老年退行性疾病的主要特征，保護(hù)線(xiàn)粒 體免受或少受損傷就是延緩衰老預(yù)防老年退行性疾病的分子基礎(chǔ)。因此本發(fā)明 的組合物對(duì)老年退行性疾病的預(yù)防和治療均有顯著效果，以下以帕金森氏病為 例來(lái)證明本發(fā)明組合物的效果。
帕金森氏病是一種常見(jiàn)的老年退行性疾病，MPP+是一種神精毒劑，MPP+ 中毒導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡是誘發(fā)帕金森氏癥的病因。通過(guò)下面的實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù) 本發(fā)明實(shí)施例1制備的輔酶QK)、硒和維生素E的組合物(M)能有效的降低神 經(jīng)毒劑MPP+對(duì)神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的毒性，使MPP+4秀導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡 率減少，使旨 +-導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞生存能力下降的程度降低，這種保護(hù)作 用是通過(guò)維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體的功能實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)在組合物(M)有效的保護(hù)MPP+-誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體膜電位坍塌，和有效的降低MPP+-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的 生成。
1. 實(shí)驗(yàn)方法 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)
在含10%熱失活小牛血清和每毫升100單位青鏈霉素的DMEM(購(gòu)自Gibco
BRL)培養(yǎng)基中接種SH-SY5Y細(xì)胞，在攝氏37度，5%(202和95%空氣的細(xì)胞
培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。 MPP+毒性實(shí)驗(yàn)
在培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)于上述培養(yǎng)基中加入500nM的MPP+處理引起毒
性效應(yīng)。
組合物M對(duì)抗MPP+毒性的實(shí)驗(yàn)
在培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)于上述培養(yǎng)基中加入500|iM的MPP+結(jié)合不同濃 度的組合物M處理，觀察組合物M降低MPP+毒性的效果，其中組合物M的濃 度分別為0、 1、 10、 50、 100pg/ml。
實(shí)驗(yàn)觀察皆用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)ioooo次做統(tǒng)計(jì)計(jì)算。
2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)1:組合物M降低MPP+4秀導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率(圖2)
培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞經(jīng)V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(購(gòu)自BioseaBCL)，和 Propidium Iodide (PI)細(xì)胞壞死指示劑避光處理15分鐘后，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)10000次。圖2(A)為正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞；圖2(B)為神經(jīng)毒劑MPP+(500iaM) 處理24小時(shí)致使部分SH-SY5Y細(xì)胞凋亡；圖2 (C)為在MPP+(500^iM)處理 SH-SY5Y細(xì)胞基礎(chǔ)上加入不同濃度組合物M保護(hù)，可見(jiàn)隨M濃度的增加細(xì)胞 凋亡率下降。
實(shí)驗(yàn)2:組合物^1對(duì)]^ +-導(dǎo)致的811-3￥5￥細(xì)胞生存能力降低的保護(hù)作用(圖 3)
細(xì)胞生存能力(cellviability)是用細(xì)胞對(duì)染料(trypanblue)的排斥能力測(cè) 定的，收集培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)緩沖鹽水清洗后用0.4%的染料溶液染色，在顯微鏡下 計(jì)數(shù)?？瞻字硎緦?duì)照組，即沒(méi)有用MPP+處理的正常SH-SY5Y細(xì)胞為100% ， 斜線(xiàn)填充柱表示用500pMMPP+和不同劑量組合物M處理的SH-SY5Y細(xì)胞。從 圖3中看出MPP+處理24小時(shí)致SH-SY5Y細(xì)胞生存能力下降為對(duì)照的65%(左 l組)，組合物M的加入(左2-5組)對(duì)抗了MPP+的毒性使細(xì)胞生存能力隨M 濃度增加而從70%增至90%。
實(shí)驗(yàn)3:組合物M降低MPP+-導(dǎo)致的線(xiàn)粒體膜電位坍塌(圖4)
線(xiàn)粒體跨膜電位是用rhodamine123標(biāo)記的。SH-SY5Y細(xì)胞在不同MPP+濃 度下培養(yǎng)6小時(shí)，收集細(xì)胞經(jīng)消化和清洗后懸于500pL (1><106細(xì)胞/毫升)轉(zhuǎn)移 至5毫升培養(yǎng)管中，加rhodamine123至lpM于37t!保溫半小時(shí)后用流式細(xì)胞 儀計(jì)數(shù)10000次計(jì)算作圖。圖4 (A)中的峰左移程度表示線(xiàn)粒體膜電位坍塌程 度增高；圖4 (B)中可見(jiàn)隨組合物M濃度的增高線(xiàn)粒體膜電位坍塌程度下降。
實(shí)驗(yàn)4:組合物M降低MPP+-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的積累(圖5)
細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基是用熒光劑DCFH-DA檢測(cè)的，活性氧自由基把 DCFH-DA氧化成熒光強(qiáng)度較高的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度(激發(fā)光485nm， 發(fā)射光538nm)可以判斷活性氧自由基的濃度。由圖5可見(jiàn)，MPP+處理SH-SY5Y 細(xì)胞24小時(shí)后，用DCF熒光檢測(cè)活性氧自由基濃度，隨MPP+濃度增加活性氧 自由基增高(左側(cè)MPP+從100增至500|iM)，組合物M的存在使活性氧自由基 生成的程度隨組合物M濃度增高而減少(右側(cè)500pM MPP+處理下組合物M從 1增至10(Vg/ml時(shí)自由基生成量逐漸減少)。


圖h呼吸鏈電子漏旁路和線(xiàn)粒體自由基代謝概念的示意圖。 圖中間的橢圓形代表呼吸鏈的組成成份，(CoQ)代表輔酶Q^， (FMN)和 (FPS)代表復(fù)合物I和II兩個(gè)脫氫酶，(Cytbc,) (Cytc) (Cytaa3)代表細(xì)胞色素 鏈，粗箭頭表示呼吸鏈傳遞電子的方向。下面的橢圓形(F。FiATP^)代表"ATP 酶"，它與呼吸鏈電子傳遞偶聯(lián)制造ATP。上半部分是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的呼吸鏈電子漏旁路，它們是產(chǎn)生Of和11202的自由基代謝過(guò)程。全圖下半部分代表線(xiàn)粒 體作為"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"通過(guò)呼吸鏈電子傳遞做"有用功"的過(guò)程，全圖上半部 分代表"分子發(fā)動(dòng)機(jī)"通過(guò)呼吸鏈漏電子做"無(wú)用功"的過(guò)程。
圖2:組合物M降低MPP+4秀導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率。 圖中(A)是正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞；(B)是500pM，？+-誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡；(C)是不同濃度的組合物M對(duì)MPP+4秀導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞
凋亡的保護(hù)作用。
圖3:組合物M對(duì)]^ +-導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞生存能力降低的保護(hù)作用。 圖中空白柱表示正常培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞的生存能力設(shè)定為100%，填充斜 線(xiàn)柱表示]^ +-單獨(dú)或與不同濃度組合物M共同處理SH-SY5Y細(xì)胞的生存能 力，可見(jiàn)隨組合物M濃度增高使MPP+-處理后SH-SY5Y細(xì)胞生存能力的丟失 逐漸減少。
圖4:組合物財(cái)降低]/ ^+-導(dǎo)致的線(xiàn)粒體膜電位坍塌。
圖中(A)是不同濃度旨 +-處理后SH-SY5Y細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位坍塌情況； (B)是不同濃度的組合物M對(duì)500^lMMPP+-導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電 位坍塌的保護(hù)作用。
圖5:組合物M降低1/0^+-誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的積累。
左側(cè)表示不同濃度的MPP+4秀導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的增加，右側(cè)表示不 同濃度組合物M降低500)iM MPP+4秀導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基積累的 保護(hù)性作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
配方輔酶Qu)lg、納米硒lmg 將上述原料在常溫常壓下混合后 膠囊。
實(shí)施例2
配方輔酶Qu)0.5g、提供lmg硒元素的亞硒酸鈉、維生素C0.5g。 將上述原料在常溫常壓下混合后，按照常規(guī)方法制成片劑2000粒片劑，膠 丸或膠囊。
實(shí)施例3
配方輔酶Qn)2g、提供lmg硒元素的依布硒啉、(3-胡蘿卜素0,25g、硫辛 酸0.75g。
、維生素Elg。
，按照常規(guī)方法制成2000粒片劑，膠丸或、、將上述原料在常溫常壓下混合后，按照常規(guī)方法制成2000粒片劑，膠丸或
實(shí)施例4
配方輔酶Qn)lg、納米硒lmg、 P-胡蘿卜素0.25g、硫辛酸0.25g、維生素 跳5g。
將上述原料在常溫常壓下混合后，結(jié)合制藥可接受的輔料，按照常規(guī)方法 制成2000粒片劑，膠丸或膠囊。
實(shí)施例5
配方輔酶Q^2g、納米硒lmg、 P-胡蘿卜素L25g、丹參素0.25g、維生素 C 1.25g。
將上述原料在常溫常壓下混合后，結(jié)合制藥可接受的輔料，按照常規(guī)方法 制成2000粒粒片劑，膠丸或膠囊。
權(quán)利要求
1.一種維護(hù)線(xiàn)粒體功能的組合物，其特征在于由輔酶Q10、硒元素和自由基清除劑組成；所述組分的重量比為輔酶Q10∶硒元素∶自由基清除劑＝0.5～2∶0.001∶1～3；所述自由基清除劑是各種用于減少自由基損傷的化合物、中藥提取物或它們的組合。
2. 權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于所述自由基清除劑選自維生素E、 維生素C、硫辛酸、p-胡蘿卜素或丹參素中的一種或兩種以上的混合物。
3. 權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于所述硒元素來(lái)自納米硒、亞硒酸 鈉或依布硒啉。
4. 權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于它由以下重量份的組分組成輔酶Qiol、納米硒0.001和維生素E 1。
5. 權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于它由以下重量份的組分組成輔酶Qu)l、納米硒0.001、硫辛酸0.25、維生素E1、維生素C1。
6. 權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，它由以下重量份的組分組成輔 酶Qu)l、納米硒0.001、 P-胡蘿卜素0.25、丹參素0.25、
7. 權(quán)利要求1所述的組合物在制備維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能的藥物或保健品中的 應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物或保健品為延緩衰老、預(yù)防老年退行性疾病或心腦血管疾病的藥物或保健品。
9. 權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于以所述組合物為藥效成分或活性成分，結(jié)合制藥生產(chǎn)上可接受的常規(guī)輔料，按照常規(guī)方法制備成片劑、膠丸或膠
全文摘要
本發(fā)明提供一種維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能的營(yíng)養(yǎng)組合物，它是輔酶Q₁₀、硒元素和自由基清除劑的組合；所述組分的重量比為輔酶Q₁₀∶硒元素∶自由基清除劑＝0.5～2∶0.001∶1～3；所述自由基清除劑可以是各種用于減少自由基損傷的化合物、中藥提取物或它們的組合。本發(fā)明提供的組合物在維護(hù)保養(yǎng)線(xiàn)粒體功能上與任何單一組分相比具有互補(bǔ)增強(qiáng)的效果，能提高“呼吸鏈”傳遞電子制造ATP的活性，保護(hù)線(xiàn)粒體DNA免受損傷。以該組合物為核心成分制成的藥物或保健品可用于延緩衰老、預(yù)防老年退行性疾病的發(fā)生、以及用于心腦血管疾病的治療。
文檔編號(hào)A61K31/122GK101579355SQ200910085018
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者徐建興 申請(qǐng)人:徐建興