專利名稱：用于激活線粒體的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于激活線粒體的組合物。
背景技術(shù)：
線粒體是一種可在絕大多數(shù)真核細胞中發(fā)現(xiàn)的細胞器。線粒體具有自己的DNA，即獨立于細胞核DNA之外的DNA(mtDNA)。線粒體最重要的作用是生成三磷酸腺苷(ATP)，ATP是細胞內(nèi)的能量來源。用線粒體基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的NADH和FADH2、通過TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))、從電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP。因此，產(chǎn)生的ATP是用來激活各種需要能量的生物合成和代謝過程。線粒體還可在基質(zhì)中短暫地儲存鈣離子，鈣離子對于細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導非常重要， 并且當需要時又能將鈣離子釋放到細胞質(zhì)中。此外，已知線粒體在細胞凋亡、細胞增殖和細胞代謝等活動中起著中央調(diào)控作用。線粒體的DNA相對易受到損壞，因為它與細胞核DNA不同，缺乏自身修復(fù)機制，且沒有保護DNA的組蛋白。眾所周知，線粒體DNA的損壞與線粒體疾病的發(fā)病密切相關(guān)。線粒體功能的退化，會導致細胞活動所需能量來源ATP合成的減少，從而引起各種疾病。殼聚糖應(yīng)用于不同領(lǐng)域，包括污水處理的絮凝劑、去除重金屬的吸附劑、保健食品、離子交換劑和醫(yī)療產(chǎn)品。眾所周知，這些功能受殼聚糖的分子量和脫乙?；挠绊懞艽?。近來，據(jù)報道，甲殼素、殼聚糖及其衍生物具有吸附或排泄體內(nèi)積累的壞膽固醇的除膽固醇活性，抑制癌細胞增殖的抗癌活性和吸附使血壓升高的氯離子、降低氯離子的吸收并將其排出體外的降血壓作用。此外，據(jù)了解它們能促進有益的腸道菌的增殖和激活細胞。另外，它們還有各種生理活性，包括控制血糖、改善肝功能以及排泄重金屬和污染物等等。因此，在生物醫(yī)藥行業(yè)人們將其作為有價值的物質(zhì)進行研究。雖然殼寡糖已廣泛應(yīng)用于保健食品和一般食品，但有關(guān)其功能的研究還不夠。公開號為2005-0104910的韓國專利公開了殼寡糖在氧化低密度脂蛋白中(oxLDL)，作為凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體I(LOX-I)基因的抑制物質(zhì)的功能，可有效預(yù)防動脈硬化。公開號為2005-00913M的韓國專利公開了殼寡糖作為PPAR基因表達的抑制物質(zhì)的功能，PPAR 基因作為脂類代謝的關(guān)鍵因素參與膽固醇的平衡調(diào)控和脂肪細胞的分化與合成。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在提供一種通過增加線粒體酶的活性和增加線粒體DNA的數(shù)量來激活線粒體的組合物。技術(shù)方案總體而言，本發(fā)明提供了一種含有殼寡糖作為活性成分來激活線粒體的組合物。有益效果
由于本發(fā)明用于激活線粒體的組合物可提高線粒體酶的活性和增加線粒體DNA 的數(shù)量，所以所述組合物能激活線粒體并增加線粒體的生物合成。因此，所述本發(fā)明組合物可有效用于預(yù)防或治療各種與線粒體活性降低有關(guān)的疾病，如退化性疾病、帕金森綜合癥


圖1展示了經(jīng)本發(fā)明實施例中的組合物處理后，乙?；? (SIRTl)活性的測定結(jié)果；圖2展示了經(jīng)本發(fā)明實施例中的組合物處理后，PPARy輔助活化因子 1 α (PGC1 α )促進劑的活性的測定結(jié)果；圖3展示了經(jīng)本發(fā)明實施例中的、平均分子量為1155的殼寡糖乳酸鹽處理后，線粒體DNA復(fù)制數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明中使用的“殼寡糖”是指殼聚糖水解后獲得的一種低分子量多糖。所述“低分子量”可指小于10000的分子量，特別是9000或更小。本發(fā)明的殼寡糖，是一種低分子量的多糖，分子量可為700-9000。據(jù)報道，殼寡糖比殼聚糖在體內(nèi)更易被吸收，具有增強免疫、抗氧化(Shon Y， J. Chitin andChitosan，2001，6 :107-110)，抑制癌細胞生長(Nam MY, J. Chitin and Chitosan, 1999,4 :184-188)的活性。此外，據(jù)報道殼寡糖具有抑制四氯化碳引起的肝損傷的效果。然而，是否含有一種或多種殼寡糖及其鹽作為活性成分的組合物對線粒體的激活具有直接作用是不知道的。本發(fā)明的發(fā)明人測定了顯示殼寡糖對能量代謝促進的指數(shù)，且確認了一種或多種殼寡糖及其鹽能夠激活線粒體。沒有特別限制制備殼寡糖的方法。例如，通過分離和純化甲殼素來制備殼寡糖，即對蟹殼和蝦殼等進行粉碎、脫鹽、去蛋白和純化可獲得甲殼素，再對甲殼素進行脫乙酰化處理得到殼聚糖，接著再用化學降解或酶降解殼聚糖。特別是可通過酶降解殼聚糖來制備殼寡糖。沒有特別限制用于酶降解殼聚糖生成殼寡糖的酶。例如，纖維素酶可以用于酶降解殼聚糖。具體來說，當使用酶降解殼聚糖制備殼寡糖時，可按下述方法進行。向殼聚糖中加入純凈水后，接著加入2-3%的鹽酸，將混合物在40-60°C下攪拌制備成固體含量為5-10% 的殼聚糖分散液。完全溶解后，將溶液的PH調(diào)節(jié)至4-6，加入已溶解于純凈水的纖維素酶作為殼聚糖降解酶。然后，在40-60°C下水解14-20小時，接著在80°C熱處理30分鐘，進行酶去活、過濾和干燥，即可得到殼寡糖。所述一種或多種殼寡糖及其鹽的分子量為700-9000。在此分子量范圍內(nèi)，所述殼寡糖表現(xiàn)出了的激活線粒體的卓越效果。根據(jù)纖維素酶加入量，所述分子量會有所變化。當纖維素酶的添加量占殼聚糖量的10%時，可獲得分子量為1000，甚至更小的殼寡糖。當纖維素酶的添加量占殼聚糖量的6%時，可獲得分子量為1500-2000的殼寡糖。當纖維素酶的添加量占殼聚糖量的3%時，可獲得分子量為7000-10000的殼寡糖。因此，可通過改變殼聚糖降解酶添加量來制備分子量為700-9000的殼寡糖。用于激活線粒體的所述組合物(如所述一種或多種殼寡糖及其鹽)的活性成分， 例如可提高乙?；? (SIRTl)的活性，提高PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )的活性或增加線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。所述活性成分可以是殼寡糖或其各種鹽。所述鹽沒有被特別限定，但是可以是，例如平均分子量為1巧5的殼寡糖乳酸鹽(LM)。如下面實施例證明的，在各種殼寡糖及其鹽中，用平均分子量為1巧5的殼寡糖乳酸鹽(L24)處理的組，顯著提高了 SIRTl和PGCl α的活性，或增加了線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。SIRTl和PGCl α在線粒體的生物合成中具有十分重要的作用。SIRTl是一種NAD 依賴型脫乙酰酶，具有提高線粒體產(chǎn)量的能力。PGCla是一種90-kDa核蛋白，是一種參與能量代謝的轉(zhuǎn)錄共激活因子調(diào)控基因。PGCla經(jīng)SIRTl激活后，可提高參與ATP合成和線粒體生物合成的基因的表達。在這方面，下述實施例證實一種或多種殼寡糖及其鹽可顯著提高SIRTl和PGCl α的活性。還可通過測定線粒體DNA(mtDNA)的損傷或統(tǒng)計線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量來直接測定線粒體的生物合成程度。如下面實施例證實的，確定了一種或多種殼寡糖及其鹽能顯著提高線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。因為本發(fā)明所述包括殼寡糖作為活性成分的組合物可激活線粒體，所以可用作預(yù)防或治療與線粒體活性降低有關(guān)的各種退化性疾病、腦部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病、肝病、腎病、胰腺病或肌肉疾病的組合物。沒有特別限制所述退化性疾病，但是可以是，例如退化性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。當線粒體活性降低時，由于與炎癥相關(guān)的因子，如軟骨細胞中的環(huán)氧合酶 2(C0X-2)表達的增加，可引起這些疾病。沒有特別限制所述腦部疾病，但是可以是，例如癡呆、帕金森綜合癥、中風、發(fā)育遲緩、神經(jīng)精神疾病、偏頭疼、自閉癥、智障、癲癇或癱瘓。當線粒體活性降低時，由于產(chǎn)生的活性氧造成淀粉樣蛋白產(chǎn)量的增加和積累可引起以上這些疾病，淀粉樣蛋白產(chǎn)量的增加和積累是引起腦部疾病，特別是癡呆癥的主因。沒有特別限制精神系統(tǒng)疾病，但是可以是，例如上瞼下垂、視神經(jīng)萎縮、斜視、視網(wǎng)膜色素變性、失明、聽力喪失、眼肌麻痹、反射減弱、暈厥、神經(jīng)性疼痛或自主神經(jīng)失調(diào)。沒有特別限制心臟病，但是可以是，例如心臟衰竭或心肌癥。當線粒體活性降低時，可引起心臟功能問題的鈣離子超載或氧化應(yīng)激可引起這些疾病。沒有特別限制肝病，但是可以是，例如低血糖或肝功能衰竭。沒有特別限制腎病，但是可以是，例如腎小管性酸中毒。當線粒體活性降低時，由于線粒體呼吸系統(tǒng)損傷而造成的氧化應(yīng)激的提高可引起這些疾病。沒有特別限制胰腺病，但是可以是，例如胰腺外分泌功能不全或甲狀旁腺機能減退。沒有特別限制肌肉疾病，但是可以是，例如腸易激綜合癥、肌痛、肌肉萎縮癥、胃食管反流病、低血壓、抽搐、運動障礙、便秘或腹瀉。當線粒體活性降低時，因ATP減少引起的肌肉運動異常可引起這些疾病。該組合物沒有特別限制，但是可以是，例如保健食品組合物或藥物組合物。
可將保健食品組合物制成各種形式，包括粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊和飲劑。必要時，所述保健食品組合物可包括一種或多種添加劑。所述添加劑可包括果汁(包括濃縮果汁和粉狀果汁)，如葡萄柚汁、蘋果汁、橙汁、檸檬汁、菠蘿汁、香蕉汁和梨汁等；維生素(包括水溶性和脂溶性維生素)，如維生素A棕櫚酸酯、維生素B2、維生素B6、 維生素B12、抗壞血酸鈉、煙酰胺、泛酸鈣、葉酸、維生素H、維生素D3、重酒石酸膽堿、維生素 E和β-胡蘿卜素等；香料，如檸檬香精、橙類香精、草莓香精、葡萄柚香精、香草香精等；氨基酸，核酸及其鹽，如谷氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸納、肌苷酸等； 植物纖維，如聚葡萄糖、果膠、黃原膠、葡甘露聚糖、藻酸等；礦物質(zhì)，如氯化鈉、醋酸鈉、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鎂、碳酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、甘油磷酸鈣、檸檬酸亞鐵鈉、 檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碘化鈉、山梨酸鉀、鋅、錳、銅、碘和鈷等。所述藥物組合物還可包括藥用輔料，如防腐劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、乳化加速劑、控制滲透壓的鹽、緩沖液等以及其他治療上有用的物質(zhì)。所述藥物組合物可制成用于口服或腸外給藥的各種劑型?？诜┬桶ǎ缙瑒?、丸劑、硬或軟膠囊、液體、懸浮液、乳液、糖漿、顆粒劑或類似的形式。這些劑型除活性成分外，還可包括稀釋劑(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和甘氨酸)、潤滑劑(如硅、滑石粉、硬脂酸或硬脂酸鎂或硬脂酸鈣及聚乙二醇)。 所述片劑還可包括黏合劑，如硅酸鋁鎂、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和聚乙烯吡咯烷。根據(jù)不同場合的要求，所述片劑中還可包括藥物添加劑，如崩解劑(例如淀粉、瓊脂、藻酸或其鈉鹽)、吸收劑、著色劑、香料、甜味劑及類似的物質(zhì)。所述片劑可通過普遍采用的混合、制粒和涂層的方法來制備。用于腸外給藥的典型劑型包括注射用的等滲水溶液或懸浮液。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可很容易確定所述活性成分的劑量。所述活性成分的日劑量可根據(jù)各種因素改變，這些因素包括疾病的發(fā)展和階段、患者的年齡和身體狀況、并發(fā)癥存在與否等。一般情況下，具有上述重量組成的所述組合物可一天給藥一次或兩次，劑量為 l-500mg/kg，特別是30-200mg/kg。但是所述給藥劑量不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。雖然沒有特別限定所述活性成分的含量，但其含量可占所述組合物總重的 10-90wt%。片劑或軟膠囊包括的活性成分的含量可為10-60wt%，硬膠囊包括的所述活性成分的含量可為10-90%。
實施例下面將描述實施例和試驗。以下實施例和試驗僅作說明用途，并非為了限制本發(fā)明的范圍。通過體外試驗分析了一種或多種殼寡糖及其鹽對線粒體生物合成的作用。為了研究一種或多種殼寡糖及其鹽是否能提高線粒體的生物合成，用一種或多種殼寡糖及其鹽處理C2C12肌肉細胞，然后測定乙?；? (SIRTl)和PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )促進劑的活性以及線粒體DNA(mtDNA)的復(fù)制數(shù)量?！笢y試實施例11對SIRTl活性的影響用"SIRT1熒光藥物檢測試劑盒”(AK-555，Biomol)測定SIRTl的活性。隨試劑盒一起提供SIRTl人類重組蛋白、SIRTl底物Fluor de Lys-SIRTl和NAD+。在總反應(yīng)體
6積50 μ L中，SIRTl蛋白質(zhì)的使用量為1U，F(xiàn)luor de Lys-SIRTl和NAD+的底物濃度分別為 50 μ M和100 μ Μ。在500ppm的濃度下處理殼寡糖。在用SIRTl蛋白、所述底物和供測物質(zhì)處理后，等待45分鐘，加入Fluor de Lys Developer II/2mM煙酰胺，在37°C的條件下培育細胞30分鐘。在凈體積96孔微孔板(Corning Costar)上，用熒光檢測器Flexstation 3(EX.360nm，Em.460nm，分子儀器)測定其結(jié)果。不使用SIRTl蛋白質(zhì)時作為空白對照。用 ΙΟΟμΜ白藜蘆醇作為陽性對照，用100 μ M煙酰胺作為陰性對照。由表1可知，使用各種殼寡糖及其鹽對SIRTl活性的測定，測定結(jié)果見圖1。由圖1可知，絕大多數(shù)殼寡糖提高了 SIRTl的活性(約是對照組的1. 5-3倍)。表1
權(quán)利要求
1.用于激活線粒體的組合物，包括一種或多種殼寡糖及其鹽作為活性成分。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述一種或多種殼聚糖及其鹽的分子量為700-9000。
3.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述一種或多種殼聚糖及其鹽包括殼寡糖乳酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分提高了乙?；窱(SIRTl)的活性。
5.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分提高了 PPARy輔助活化因子1 α (PGC1 α )的活性。
6.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分增加了線粒體DNA的復(fù)制數(shù)量。
7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療退化性疾病、腦部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病、肝病、腎病、胰腺病或肌肉疾病的組合物。
8.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療退化性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的組合物。
9.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療癡呆、帕金森綜合癥、中風、發(fā)育遲緩、神經(jīng)精神疾病、偏頭疼、自閉癥、智障、癲癇或癱瘓的組合物。
10.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療上瞼下垂、視神經(jīng)萎縮、斜視、視網(wǎng)膜色素變性、失明、聽力喪失、眼肌麻痹、 反射減弱、暈厥、神經(jīng)性疼痛或自主神經(jīng)失調(diào)的組合物。
11.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療心臟衰竭或心肌癥的組合物。
12.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療低血糖或肝功能衰竭的組合物。
13.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療腎小管性酸中毒的組合物。
14.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療胰腺外分泌功能不全或甲狀旁腺機能減退的組合物。
15.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述組合物是一種用于預(yù)防或治療腸易激綜合癥、肌痛、肌肉萎縮癥、胃食管反流病、低血壓、抽搐、運動障礙、 便秘或腹瀉的組合物。
16.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于所述組合物是保健食品組合物或藥物組合物。
17.根據(jù)權(quán)力要求1所述的用于激活線粒體的組合物，其特征在于，所述活性成分的含量占所述組合物總重量的10-90wt%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于激活線粒體的組合物，該組合物含有殼寡糖作為活性成分。所述殼寡糖可增加線粒體酶的活性和線粒體DNA的數(shù)量，這樣它可用于激活線粒體的組合物中的活性成分。
文檔編號A61P25/28GK102292090SQ200980155348
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者孫鐘熙, 宋旻庭, 徐大方, 曺始永, 申宜錫, 金完起 申請人:株式會社愛茉莉太平洋