專利名稱：一種雙鏈聚乙二醇－胰島素復合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是涉及糖尿病用胰島素復合物，另外還提供其制
備方法。
二背景技術：
糖尿病是一種常見的多發(fā)性代謝疾病，國內外的發(fā)病率均呈上升趨勢。據(jù)不完全 統(tǒng)計，我國現(xiàn)有糖尿病患者3000萬人以上，糖尿病的發(fā)病率高達3. 2% 。雖然許多疾病都能 導致人死亡，但糖尿病是弓I起人死亡的第三位的主要原因。 發(fā)現(xiàn)胰島素以前，許多不幸患上1型糖尿病的患者是非常悲慘的，絕大多數(shù)患者 在早期就死于酮癥酸中毒。1921年胰島素被發(fā)現(xiàn)以后，糖尿病的治療有了突破性的進展。 近80多年來，胰島素的發(fā)展從早期的動物胰島素到人胰島素，直到現(xiàn)在的胰島素類似物拯 救了無數(shù)糖尿病患者的生命。尤其是胰島素類似物的發(fā)現(xiàn)和使用，堪稱胰島素治療史上的 一場新的革命。 動物胰島素在胰島素治療中歷時最久，發(fā)揮過重要的作用，做出了巨大的貢獻。然 而由于物種的不同，動物胰島素在發(fā)揮降血糖的生理作用的同時，也出現(xiàn)了一些不良反應， 如免疫原性反應。另外，動物胰島素的作用也弱于人胰島素。正是由于上述問題的存在，動 物胰島素需要向更安全可靠的人胰島素轉換。隨著科技的進步，基因重組DNA技術以及相 關提純滅菌技術不斷發(fā)展完善，最終獲得了高純度的、量上能夠滿足臨床需要的大量人胰 島素。由于基因重組技術生物合成的人胰島素結構與人體內胰島素的結構完全相同，因而 解決了免疫原性問題，使胰島素的不良反應降到了最低。人胰島素制劑包括常規(guī)胰島素，魚 精蛋白胰島素(NPH)，預混胰島素(30R、50R等)等。目前，國內市場上有許多種人胰島素， 為臨床糖尿病治療制訂合理的方案提供多種選擇。 雖然人胰島素的發(fā)展使得大量糖尿病患者可以得到及時合理的胰島素治療，然而 這并沒有解決胰島素治療中的所有問題。在常規(guī)治療中，胰島素需要注射到皮下才能發(fā)揮 作用。常規(guī)胰島素皮下注射后，由于吸收緩慢，血漿胰島素的濃度在45 120分鐘才達到 峰值，因此需要餐前30分鐘注射，以便模擬正常進餐后胰島素的分泌模式。然而有研究顯 示，超過3/4的患者不能保證在餐前30分鐘注射胰島素，而是選擇了餐前立刻注射，這就導 致了餐后高血糖以及后延的高胰島素血癥，從而使病人在下餐前有可能發(fā)生低血糖。魚精 蛋白胰島素注射后4 10小時達峰值，作用持續(xù)10 16小時，因此具有峰值但作用時間 不能覆蓋24小時，不能模擬生理的基礎胰島素分泌模式。上述問題的存在，使得胰島素的 治療不能達到最佳的效果，時常會出現(xiàn)低血糖和血糖控制欠佳的情況。
為了解決人胰島素制劑不能很好模擬生理性胰島素分泌模式問題，具有更佳藥代 動力學和藥效學的人胰島素類似物(insulinanalogue)應運而生，這帶來了胰島素制劑學 和臨床治療學的一次革命。20世90年代初，禮來和諾和諾德公司通過對胰島素結構的深入 研究，發(fā)現(xiàn)胰島素B鏈B28、B29位氨基酸是胰島素容易聚合形成六聚體的關鍵部位，通過改 變這些部位的氨基酸可以使胰島素的藥效和藥代學發(fā)生改變。禮來公司flqLispiO(優(yōu)泌樂)通過將B28位的脯氨酸和B29位的賴氨酸位置互換形成了新的類似物，而諾和諾德公 司的Aspart(諾和銳)是將B28位的脯氨酸替換為門冬氨酸。通過改變胰島素結構，從而 改變作用時間的新制劑稱為速效胰島素類似物，注射后能較快解聚，因而起效快持續(xù)作用 時間短。能在10 20分鐘迅速起效，30 60分鐘達峰作用持續(xù)時間2 4小時。從而 能任餐前即刻注射，較好地模擬正常人餐后胰島素的分泌模式與餐前30分鐘注射常規(guī)入 胰島素相比，控制餐后血糖效果更好。而且由于其作用持續(xù)時間的縮短.不易與下餐前或 者夜間胰島素作用發(fā)生疊加，因而顯著減少了低血糖的發(fā)生率。同時注射時間的靈活性也 大大改善了患者的依從性。同時長效胰島素類似物的出現(xiàn)使模擬生理的基礎胰島素分泌成 為可能。長效胰島素類似物的作用時間可達24小時，并且作用平穩(wěn)，沒有明顯的作用高峰， 從而很好地模擬了生理性基礎胰島素分泌，是基礎胰島素治療的理想選擇大量臨床研窮證 實與魚精蛋白胰島素相比，此類制劑能夠減少夜間低血糖的發(fā)生率并能更好地控制空腹 血糖的波動。禮來公司研制的優(yōu)泌樂75/25中的超短效比例為25%，中效比例為75% :諾 和諾德公司的預混胰島素類似物諾和銳30由30%的門冬胰島素和70%的精蛋白結合的結 晶門冬胰島素組成，同時提供了基礎和餐時胰島素成分，也同樣具備門冬胰島素模擬餐時 胰島素分泌的優(yōu)點。臨床研究已證實.與人胰島素相比，諾和銳30能更好地降低餐后血 糖，及夜間低血糖發(fā)生率低，而且在餐前立即注射，無需等待，更加靈活方便，是胰島素治療 簡單有效的選擇。正是由于胰島素類似物的上述特點使得臨床糖尿病的治療更加有效，低 血糖事件顯著減少，使得達到更接近生理正常范圍的血糖目標值成為可能。
長效胰島素類似物的臨床研究進展 傳統(tǒng)中/長效胰島素制劑包括低精蛋白鋅胰島素(NPH)、慢胰島素鋅混懸液
(Lente insulin)、特慢胰島素鋅混懸液(Uhralenteinsulin)等，其研制目的是使糖尿病患
者一天只注射一次胰島素。然而現(xiàn)有中/長效胰島素對代謝控制的作用卻遠比不上一天多
次注射正規(guī)胰島素(RI)。為更好控制血糖，80年代后期通過重組DNA技術合成了長效胰島
素類似物，開創(chuàng)了糖尿病治療的新紀元。 現(xiàn)有中/長效胰島素制劑的缺陷表現(xiàn)在 (1)持續(xù)時間小于24h?，F(xiàn)有制劑都不能產(chǎn)生穩(wěn)定的基礎胰島素水平以配合體內 的血糖變化。無論Ultralente還是NPH，都需每天注射1_2次以維持24h的基礎血漿胰島 素水平。由于RI作用時間為6-8h，睡前注射RI補償了睡前注射一次NPH時，夜間對基礎胰 島素的需求。但隨著短效胰島素類似物的運用WH作用時間短的弱點就明顯暴露出。
(2)作用峰值明顯，夜間低血糖危險性高。皮下注射后5-7h達峰，如10:00pm注 射NPH，凌晨3:00-5:OOam達到最大降糖作用，而這時機體對胰島素需要量卻很低，因此夜 間低血糖發(fā)生率相當高，約占所有1型糖尿病低血糖事件的50% ;減少夜間WH用量，雖可 改善夜間低血糖，但到5:00-8:00am時，胰島素敏感度下降，又使胰島素相對缺乏加重，產(chǎn) 生清晨高血糖現(xiàn)象。
(3)吸收不穩(wěn)定。 皮下注射胰島素后個體內及個體間的代謝作用差異相當大，中/長效胰島素制劑 吸收量的波動范圍更可達20% 50%，一個重要原因是長效胰島素混懸液在注射前必須完
全混勻，否則，安瓿中胰島素混懸液不均一會使注射劑量產(chǎn)生差異；另一個原因是胰島素晶 體作為一種混懸物，可能會陷入組織微孔而擴散不到毛細血管，所以胰島素溶液在注射部位分布越均勻，進入毛細血管的機會也越多。顯然，胰島素吸收的波動性與其制劑的理化特
征密切相關，并常常導致夜間低血糖的發(fā)生。由此推測透明溶液形式的長效胰島素在注射
部位的變異性會較低。 長效胰島素類似物的研究進展 理想的長效胰島素制劑應具有以下特點 (1)與胰島素受體選擇性結合，發(fā)揮胰島素在細胞代謝中的多種效應。
(2)應當是一種溶液，注射部位的變異性小，皮下注射后吸收緩慢恒定無明顯作用
峰值，低血糖風險低，血糖控制良好，適宜每日注射一次。
(3)不會誘導嚴重的免疫應答 (4)不引起細胞潛在的突變和腫瘤形成。 對于糖尿病的病人來說，有效的治療方法涉及兩種外源胰島素的應用，飲食使用的速效胰島素和長效的基礎胰島素。
目前胰島素衍生物的長效機理基本上分為三種 第一種是改造胰島素的一級結構的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚體晶態(tài)，利用這種不溶態(tài)在體內的緩慢釋放，來達到長效作用； 第二種是用化學修飾的方法在胰島素的某一個氨基酸殘基的側鏈上共價結合一條脂肪鏈，通過連接的脂肪鏈在體內與白蛋白的作用增加循環(huán)半壽期來達到長效；
第三種就是通過化學方法在胰島素的某些氨基酸殘基的官能團上連接一條或數(shù)條高分子物質，以增加胰島素的循環(huán)半壽期而達到長效的目的。 采取上述第 一 種長效機理的胰島素制劑的代表是Ultralente， Lente，和
半-Lente。但現(xiàn)已表明這些長效制劑的不溶性會引起劑量反應的不一致，以及在所述時間
作用方面不可預測的問題，導致了血糖控制的不穩(wěn)定，從而容易產(chǎn)生危及生命的低血糖癥
狀，因此仍需要可溶的長效基礎胰島素以得到成功的強胰島素替代療法。 用聚乙二醇PEG對蛋白質進行修飾的先驅性工作(pegylation)最早是上世紀
七十年代末在Rutgers大學Frank Davis教授的實驗室中進行的。PEG擁有一系列獨特的
性質。包括無毒性，無免疫原性和抗原性；很低的質量決定的腎臟排除；較高的柔軟性和在
水中和一些有機溶劑中很高的溶解度。相應地，PEG-蛋白質擁有減小了的毒性、免疫原性
和抗原性，減小了的腎臟排除速率和蛋白酶水解速率，增加了的溶解性和穩(wěn)定性。還可見到
許多有價值的藥物動力學參數(shù)的改進。 在生物醫(yī)學，生物技術以及制藥界工作的人都熟悉這樣一種情況藥用多肽的藥物性能和生物性質的改善是與這種多肽與PEG的共價結合密切相關的。例如，PEG與藥物的結合能夠屏蔽多肽的抗原表位，這樣就減弱了網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的清除作用和被體內免疫系統(tǒng)的識別，同時也降低了蛋白水解酶的降解作用。PEG conjugation還增加了多肽的表觀大小，從而減少了腎臟的濾過同時也改變了多肽的生物分布。影響上述性質的重要因素是1)結合到多肽上的PEG鏈的數(shù)目，2)結合到多肽上的PEG鏈的分子量和結構，3) PEG在多肽上的軛合位點，4)將PEG結合到多肽上所用的化學方法。 胰島素的聚乙二醇(PEG)化就受到了上述四個因素的影響。首先目前使用的PEG結合到多肽上的方法主要是親電的試劑，即把PEG的一端的羥基通過化學方法改造成親電的官能團(如活性酯、酰氯等)，以利于與蛋白質側鏈上的親核基團(氨基、巰基等)反應。絕大多數(shù)蛋白質不含游離巰基巰基，而都含有游離的氨基，因此PEG的修飾主要是修飾蛋白質中的氨基。胰島素中有三個游離的氨基，A鏈的N末端，B鏈的N末端，以及B29的賴氨酸的e-氨基。通過對胰島素的PEG修飾人們認識到，不管多大分子量的PEG鏈、以什么化學方法修飾在胰島素A鏈的N末端，都會導致胰島素的活性降低甚至完全失去活性，原因是A鏈的N末端離胰島素的活性中心很近，修飾的PEG鏈會阻礙胰島素與其受體的結合；而且用活性很強的修飾劑無法對這三個氨基進行選擇，從而導致多種不同修飾產(chǎn)物的混合物，這對一個治療藥物來說是不能容忍的缺陷。 那么剩下的就只能是從PEG在多肽上的軛合位點以及將PEG結合到多肽上所用的化學方法上尋找突破。有人通過使用化學方法保護A鏈的N末端，而修飾B鏈的N末端及B29的賴氨酸的e -氨基，這樣雖然能夠保留胰島素的大部分活性，但單一位點修飾產(chǎn)物的分離則造成了很大困難，也給工業(yè)化生產(chǎn)增加了成本；還有人通過改變試劑的活性造成一定程度上的選擇性修飾，例如采用PEG的醛基衍生物在低pH下能夠選擇性地修飾N末端氨基，這樣還是要保護A鏈的N末端；總之目前的修飾方法不能完全避免上述四個因素的影響，不能得到令人滿意的修飾結果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，另外還提供其制備方法。制備方法的特點是在PEG與胰島素分子的連接上采用酶促合成，使得胰島素與所要修飾的化學基團的連接是位點專一的和高效的。 本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術方案是一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物，其化學結構通式為D-X-R2，式中R為CH30-(CH2CH20) nCH2CH2NH， n = 50-500 ;X為L_谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。 所述X為L-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基。 所述R與X的羧基之間為酰胺鍵連接；X的氨基與D的C末端B29賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。 所述R的前體是氨基聚乙二醇CH30- (CH2CH20) nCH2CH2NH2 ，其分子量范圍是2KD-20KD。
本發(fā)明一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備方法具體合成步驟如下
第一步氨基聚乙二醇的制備 將一定量的通式為CH30-(CH2CH20)nCH2CH2OH的單甲氧基聚乙二醇(n = 50-500)加入到甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與單甲氧基聚乙二醇等摩爾量的吡啶，回流反應并滴加2倍聚乙二醇摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后再于80°C -IO(TC反應2-6小時，冷卻過濾除去結晶物，然后減壓蒸餾除去甲苯，得到的產(chǎn)物為CH30-(CH2CH20)nCH^H^l，將該物質放入反應釜中，以少量無水甲醇溶解，然后加入液態(tài)氨，密閉下6(TC反應12-24小時開釜后減壓除去過量的氨和甲醇，得到通式為CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二醇，備用。
第二步X-R2的制備 取 一 定量的氨基用Boc保護了的氨基酸衍生物，其化學通式為
7Boc-(HN)-X-(C00H)2，溶于二氯甲烷CH2Cl2與二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6體積比混合溶液中，加入2倍于氨基用Fmoc保護了的氨基酸衍生物摩爾量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保護了的氨基酸衍生物摩爾量的碳二亞胺(DCC) ， O-l(TC攪拌反應12-24小時，然后過濾除去副產(chǎn)物DCU，得到的溶液中加入過量的三氟乙酸，攪拌反應脫掉Boc保護基，得到X-R2，備用。此時X的兩個羧基與兩條氨基聚乙二醇形成酰胺連接，形成雙鏈的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基為游離狀態(tài)。 第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 在pH8.3的碳酸氫銨溶液中加入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用2小時，然后加酸終止反應，反應液用S印hadexG50分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys，備用。
第四步雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備 首先將一定量的備用的脫掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D用0. 5_2N的醋酸溶液溶解，得溶液l ;然后將備用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6體積比的DMF/EtOH混合溶液中，原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后將溶液1和2合并并調節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反應12-24小時，即可得到本發(fā)明的終產(chǎn)物雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物。 所述第一步氨基聚乙二醇的制備中滴加吡啶完畢后反應時間為4小時。 所述第一步氨基聚乙二醇的制備中加入液態(tài)氨反應時間為18小時。 所述第二步RNH-X的制備的中制備RNH-X的反應溫度為4°C ，反應時間為18小時。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復合物的制備中用于溶解脫B30氨基酸殘
基的胰島素中間體的醋酸溶液濃度為1N。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復合物的制備中原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 60。 所述第四步單修飾的聚乙二醇-胰島素復合物的制備中溶液l和2合并并調節(jié)pH值為6.8。 本發(fā)明在PEG修飾領域中采用了全新的理念改修飾氨基為修飾羧基，聚乙二醇鏈被連接到胰島素的B30氨基酸殘基的兩個羧基上，該連接為酰氨鍵，高產(chǎn)，穩(wěn)定。本發(fā)明合成的一種在長效方面有重大應用前景的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，這種復合物的本質是化學修飾胰島素。這種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物具有潛在的長效功能。
本發(fā)明制備方法使用了全新的修飾方法在關鍵的偶聯(lián)反應中使用酶促反應，借助酶催化的高效性和專一性把PEG鏈高產(chǎn)率的結合在胰島素的B鏈C末端。具體的說，在本發(fā)明中使用了有機相下酶促合成的方法將除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體與預先合成的雙鏈聚乙二醇氨基酸衍生物以高產(chǎn)率連接，形成一個雙鏈聚乙二醇與胰島素B30氨基酸羧基相連的聚乙二醇-胰島素復合物，該有機相酶促反應的產(chǎn)率在本發(fā)明中達到90%以上，最高達到99%。
四

圖1是PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰島素的電泳行為對照圖。 采用聚丙烯酰胺自然連續(xù)電泳，凝膠濃度為10X，凝膠內pH8.9電極緩沖液pH為8. 3，考瑪斯亮藍染色。涌道1為胰島素原樣，涌道3是修飾的雙鏈胰島素_胰島素復合物。所得產(chǎn)品經(jīng)測結果如圖1所示，由圖1可以看出，PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰島素的電泳行為有明顯差異，這是因為在凝膠中，帶電粒子靠電荷的差異由負極向正極移動，移動方向如圖；PEG鏈修飾了胰島素的B鏈C末端的羧基后，飾的胰島素比未修飾的胰島素少了一個負電荷，因此其泳動速度比未修飾胰島素慢，在電泳膠片上顯示了不同的兩個區(qū)帶，如圖中泳道1和泳道3所示。 圖2是實施例1中步驟2的產(chǎn)物NH2-Glu_(PEG5000)2的質譜圖，顯示其分子量范圍是6， 000-10， 000。 圖3是上述的NH2-Glu_(PEG5000)2與胰島素中間體D形成的復合物D-Glu- (PEG5000) 2的質譜圖，其分子量范圍在12， 000-16， 000 ，說明胰島素與其結合是1 : 1的，酶促合成的方式?jīng)Q定了 NH2-Glu-(PEG5000)2連接在D的B29位Lys的羧基端。
圖4是實施例1、2、3的終產(chǎn)物結構圖。
五具體實施例方式
通式為D-X-R2的雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進下的詳細說明，但不限于具體實施例。
實施例1 :D-Glu-(PEG5000)2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L-谷氨酸殘基，R為聚乙二醇5000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備 步驟1 :分子量為5000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(4毫摩爾)相對分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為5000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步驟2 :NH2-Glu_ (PEG5000) 2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為5000的PEG_NH210克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.68克(2毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG5000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG5000) 2的制備
(1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解1. 2克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG5000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調節(jié)p朋.8，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應24小時。 (4)反應完成后，將體系用HAc調節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結果證實，得到了D-Glu-(PEG5000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見

。 所得產(chǎn)品經(jīng)測結果如圖1所示，由圖1可以看出，PEG鏈修飾胰島素與未修飾人胰
島素的電泳行為有明顯差異，這是因為在凝膠中，帶電粒子靠電荷的差異由負極向正極移
動，移動方向如圖；PEG鏈修飾了胰島素的B鏈C末端的羧基后，飾的胰島素比未修飾的胰
島素少了一個負電荷，因此其泳動速度比未修飾胰島素慢，在電泳膠片上顯示了不同的兩
個區(qū)帶，如圖中泳道1和泳道2所示。 實施例2 :D-Glu- (PEG2000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L-谷氨酸殘基，R為聚乙二醇2000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備 步驟1 :分子量為2000的氨基聚乙二醇的制備 取10克(5毫摩爾)相對分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到9. 5克產(chǎn)物，此為分子量為2000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Glu_ (PEG2000) 2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為2000的PEG_NH2 4克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 34克(l毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG2000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG2000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫
10升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解0. 5克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG2000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調節(jié)pH7.0，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，30 °C反應24小時。 (4)反應完成后，將體系用HAc調節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結果證實，得到了D-Glu-(PEG2000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見

。
實施例3 :D-Glu- (PEG10000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L_谷氨酸殘基，R為聚乙二醇10000的雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備 步驟1 :分子量為10000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(2毫摩爾)相對分子量為10000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為10000的PEG-Cl。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，60°C反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為10000的氨基聚乙二醇PEG-MV步驟2 :NH2-Glu-(PEG10000)2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為10000的PEG_NH210克(1毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 17克(0. 5毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Glu (Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG10000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Glu- (PEG10000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解2. 4克步驟2中制備的NH2-Glu-(PEG10000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調節(jié)p朋.5，再加入與胰島素中間體D 1 : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應24小時。 (4)反應完成后，將體系用HAc調節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。
(5)將凍干物分別進行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結果證實，得到了D-Glu-(PEG10000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見

。
實施例4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇5000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備 步驟1 :分子量為5000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(4毫摩爾)相對分子量為5000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為5000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步驟2 :NH2-Asp- (PEG5000) 2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為5000的PEG-NH210克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.64克(2毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG5000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解1. 2克步驟2中制備的NH2-Asp-(PEG5000)2，此為溶液2。(3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調節(jié)p朋.8，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應24小時。 (4)反應完成后，將體系用HAc調節(jié)pH3. O，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結果證實，得到了D-Asp-(PEG5000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見

。
實施例5 :D-Asp- (PEG2000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇2000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備
12
步驟1 :分子量為2000的氨基聚乙二醇的制備 取10克(5毫摩爾)相對分子量為2000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到9. 5克產(chǎn)物，此為分子量為2000的PEG-Cl 。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Asp- (PEG2000) 2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為2000的PEG-NH2 4克(2毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 32克(l毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG2000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備 取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
實施例6 :D-Asp- (PEG10000) 2的制備 D為脫B30人胰島素中間體，X為L-天冬氨酸殘基，R為聚乙二醇10000的雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備 步驟1 :分子量為10000的氨基聚乙二醇的制備 取20克(2毫摩爾)相對分子量為10000的單甲氧基聚乙二醇，加入裝有300毫升甲苯的500毫升圓底燒瓶中，加熱并蒸出IOO毫升甲苯以帶出醇中的水分。余下的溶液加入等摩爾的吡啶回流，并滴加2倍摩爾量的氯化亞砜(S0C12)，滴加完畢后將溫度降到90°C繼續(xù)反應4小時，冷卻，過濾除去結晶物，然后減壓蒸去甲苯，殘余物用乙醚沉淀，抽濾真空干燥得到19克產(chǎn)物，此為分子量為10000的PEG-C1。將此產(chǎn)物溶于少量無水甲醇加入到可密閉并可承受一定壓力的反應釜中，加入液態(tài)氨密閉，6(TC反應24小時，打開反應釜，反應液旋轉蒸發(fā)除去氨和甲醇，得到平均分子量為10000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步驟2 :NH2-Asp- (PEG10000) 2的制備 取步驟1中制備的相對分子量為10000的PEG_NH210克(1毫摩爾)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 15克(0. 5毫摩爾)市售的氨基保護的Boc-Asp (Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩爾)，4t:下攪拌反應24小時，過濾除去DCU沉淀，然后加入適量的三氟乙酸脫掉Boc保護基，溶液加入乙醚沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG10000)2。 步驟3 :除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備取100毫克人胰島素(通化東寶公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氫銨溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保溫2小時，然后加入冰醋酸終止反應，將得到的溶液經(jīng)過S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分離除去酶蛋白，收集110 160毫升組分凍干，得到除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體D，收率為97%。
步驟4 :D-Asp- (PEG10000) 2的制備 (1)取步驟3中制備的除去B30氨基酸殘基的胰島素中間體20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/Et0H(1 : 1)混合液溶解2. 4克步驟2中制備的NH2-Asp-(PEG10000)2，此為溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)調節(jié)p朋.5，再加入與胰島素中間體Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反應24小時。 (4)反應完成后，將體系用HAc調節(jié)pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分離除去胰蛋白酶，得到的修飾組分凍干。 (5)將凍干物分別進行凝膠電泳分析、反相高效液相色譜分析，結果證實，得到了D-Asp-(PEG10000)2，產(chǎn)率在95X以上。具體見

。
權利要求
雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，其特征是其化學結構通式為D-X-R2，式中R為CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X為L-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，其特征是X為L-谷氨 酸殘基。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，其特征是X為L-天冬氨酸殘基。
4. 根據(jù)權利要求l所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，其特征是R的前體是氨基聚乙二醇(^30-(<:112(:1120)11(:112(:112朋2，其分子量范圍是2KD-10KD。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物，其特征是R與X的羧基 之間為酰胺鍵連接；X的氨基與D的C末端B29賴氨酸的羧基之間是酰胺鍵連接。
6. —種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備方法，其具體合成步驟如下 第一步氨基聚乙二醇的制備將一定量的通式為CH30-(CH2CH20)nCH2CH20H的單甲氧基聚乙二醇(n = 50-250)加入到 甲苯中，加熱共沸除去水分，余下的溶液加入與單甲氧基聚乙二醇等摩爾量的吡啶，回流反 應并滴加2倍聚乙二醇摩爾量的氯化亞砜(S0Cl》，滴加完畢后再于8(TC-10(TC反應2-6小 時，冷卻過濾除去結晶物，然后減壓蒸餾除去甲苯，得到的產(chǎn)物為CH30-(CH2CH20)nCH2CH2Cl， 將該物質放入反應釜中，以少量無水甲醇溶解，然后加入液態(tài)氨，密閉下6(TC反應12-24小 時開釜后減壓除去過量的氨和甲醇，得到通式為CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二 醇，備用。第二步X-R2的制備取一定量的氨基用Boc保護了的氨基酸衍生物，其化學通式為Boc-X-(C00H)2，溶于二 氯甲烷CH^^與二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6體積比混合溶液中，加入2倍于氨基 用Fmoc保護了的氨基酸衍生物摩爾量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保護了的氨基酸衍 生物摩爾量的碳二亞胺(DCC) ， O-l(TC攪拌反應12-24小時，然后過濾除去副產(chǎn)物DCU，得到 的溶液中加入過量的三氟乙酸，攪拌反應脫掉Boc保護基，得到X-R2，備用。此時X的兩個 羧基與兩條氨基聚乙二醇形成酰胺連接，形成雙鏈的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基為游 離狀態(tài)；第三步去掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體的制備在pH8. 3的碳酸氫銨溶液中加 入天然的豬胰島素或人胰島素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用 2小時，然后加酸終止反應，反應液用S印hadexG50分離，凍干，得到脫掉B30氨基酸的胰島 素中間體，其B鏈N末端為B29-Lys，備用；第四步雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備首先將一定量的備用的脫掉B30氨基酸殘基的胰島素中間體D用0. 5-2N的醋酸溶液 溶解，得溶液1 ;然后將備用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6體積比的DMF/EtOH混合溶液中，原 料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后將溶液1和2合并并調 節(jié)pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反應12-24小時，即可得到本發(fā) 明的終產(chǎn)物雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備方法，其特征是 第一步氨基聚乙二醇的制備中滴加吡啶完畢后反應時間為4小時；根據(jù)權利要求6所述的一種單修飾的聚乙二醇-胰島素復合物的制備方法，其特征是第一步氨基聚乙二醇的制 備中加入液態(tài)氨反應時間為18小時。
8. 根據(jù)權利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備方法，其特征是第二步X-R2的制備的中制備X-R2的反應溫度為4°C，反應時間為18小時。
9. 根據(jù)權利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備方法，其特征 是第四步雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物的制備中原料胰島素中間體與X-R2的摩爾比為 1 ! 40。
10. 根據(jù)權利要求6所述的一種雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備方法，其特征是 第四步雙鏈聚乙二醇_胰島素復合物的制備中溶液1和2合并并調節(jié)pH值為6. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，D-X-R2，式中R為CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X為L-谷氨酸殘基或者L-天冬氨酸殘基；D為天然豬胰島素脫去B30位的丙氨酸殘基或人胰島素脫去B30蘇氨酸殘基得到的產(chǎn)物。本發(fā)明在PEG修飾中改修飾氨基為修飾羧基，兩條聚乙二醇鏈被連接到胰島素的B30氨基酸殘基的兩個羧基上，該連接為酰氨鍵，高產(chǎn)，穩(wěn)定。本發(fā)明合成的一種在長效方面有重大應用前景的一種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物，這種復合物的本質是化學修飾胰島素。這種雙鏈聚乙二醇-胰島素復合物具有潛在的長效功能。
文檔編號A61K38/28GK101721712SQ20081016798
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權日2008年10月21日
發(fā)明者何明磊 申請人:何明磊