本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)是引起人類獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)的病原體，自1981年美國首次診斷出艾滋病以來，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速傳播，截至2015年11月，我國累計報告艾滋病病毒(hiv)感染者和aids病人580409例。

hiv基因組由兩條相同的正鏈rna組成，每條rna長約9.2-9.8kb，包括如下9個基因：(1)gag基因(編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成p17，p24、p7、p6等核蛋白，使rna不受外界核酸酶破壞)；(2)pol基因(編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶h，均為病毒增殖所必需)；(3)env基因(編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，并切割形成gp120和gp41)；(4)tat基因(編碼蛋白可與ltr結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mrna的翻譯)；(5)rev基因(產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白)；(6)nef基因(編碼蛋白p27對hiv基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用)；(7)vif基因(可以介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的天然抗病毒蛋白apobec3g的降解，影響游離hiv感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播)；(8)vpu基因(為hiv-1所特有，可以介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的天然抗病毒蛋白tetherin的降解，為hiv的有效復(fù)制所必需)；(9)vpr基因(編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，具有致凋亡和細(xì)胞周期改變功能，在病毒體內(nèi)繁殖周期中起一定作用)。

1996年高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合治療(haart)的出現(xiàn)和應(yīng)用成為艾滋病(aids)抗病毒治療史上具有里程碑意義的重大事件。臨床觀察表明，抗病毒治療對減輕病情、提高病人生活質(zhì)量、延長生命具有很好的作用。目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑、整合酶抑制劑和ccr5受體拮抗劑六類。

非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括奈韋拉平(nevirapine,nvp)、依非韋倫(efavirdine,efv)、地拉韋定(delavirdine)依曲偉林(etravirine)、英特萊(intelence)、利匹韋林(ripivirine)等。目前，我國常用的非核苷類抑制劑主要是nvp和efv。nvp一般作為藥代動力學(xué)增強(qiáng)劑，與其他藥物配伍，提高血藥濃度，減少單一突變對藥物活性的影響。

非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑nvp適合兒童，成人等，是一線抗病毒治療的主要藥物，但是不能單獨(dú)使用。目前全國接受抗病毒治療的人數(shù)有471140人，其中接近1/3的治療人群使用nvp。

我國從2003年開始在全國范圍內(nèi)逐步實施免費(fèi)的艾滋病抗病毒治療，現(xiàn)免費(fèi)提供的抗艾滋病藥物有七種，包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑三類。nvp是其中免費(fèi)提供的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。我國2012年發(fā)布的第三版《國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊》對于成人和青少年的艾滋病患者推薦的治療方案包括奈拉偉平。

由于合成工藝比較困難，以及藥物的結(jié)構(gòu)等問題。中國對非核苷類抑制劑的仿制相對落后，我國面臨必須填補(bǔ)非核苷類抑制劑生產(chǎn)空白的現(xiàn)狀，為hiv感染者提供更多的抗病毒治療選擇。根據(jù)新藥研發(fā)的有關(guān)規(guī)定，新型抗hiv藥物上市前必須評價其耐藥性，即使用非核苷類抑制劑耐藥的hiv毒株檢測其抗病毒效果，再進(jìn)行臨床觀察。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建的毒株具有良好的耐藥性和傳代穩(wěn)定性，可應(yīng)用于抗hiv藥物的篩選。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株，基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶是蛋白質(zhì)序列為seqidno:4所示的蛋白質(zhì)；基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因是dna序列為seqidno:3所示的dna分子。

一種上所述對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株的制備方法，將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子、第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再將該dna分子插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)得到重組質(zhì)粒；最后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)制得。

上述將第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第542位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述將第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第563位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述哺乳動物細(xì)胞為293t細(xì)胞。

上述哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法是在將哺乳動物細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18-48h。

上述野生型hiv病毒為野生型的hiv-1b亞型病毒。

上述野生型的hiv-1b亞型病毒具體為野生型的hiv-189.6病毒。

上述的對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株在篩選抗hiv病毒的藥物中的應(yīng)用。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

本發(fā)明提供一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用，是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子、第188位氨基酸殘基的密碼子由酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子得到的重組病毒。本發(fā)明構(gòu)建的毒株對奈拉偉平(nvp)具有良好的耐藥性，該毒株對奈拉偉平(nvp)的半數(shù)抑制濃度(ic50)＞2048μm，具有傳代穩(wěn)定性，可以體外模擬病人由于使用此逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑所產(chǎn)生的耐藥性，可應(yīng)用于抗艾滋病藥物的篩選，對于抗hiv藥物的篩選具有重大價值，進(jìn)而對艾滋病的治療具有深遠(yuǎn)影響。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna人工序列。

圖2為本發(fā)明的耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)人工序列。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株，其基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶是蛋白質(zhì)序列為seqidno:4所示的蛋白質(zhì)；基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因是dna序列為seqidno:3所示的dna分子。

一種上所述對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株的制備方法，如圖1和2所示，將野生型的hiv-189.6病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶自n末端第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸(y)的密碼子突變?yōu)榘腚装彼?c)的密碼子、第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸(y)的密碼子突變?yōu)榘腚装彼?c)的密碼子得到dna序列如seqidno:3所示的dna分子；再將該dna分子插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)得到重組質(zhì)粒；最后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入離體的293t細(xì)胞，并將293t細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)18-48h。野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)序列為seqidno:2所示的蛋白質(zhì)，野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶的dna序列為seqidno:1所示的dna分子。

上述將第181位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第542位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述將第188位氨基酸殘基的密碼子從酪氨酸的密碼子突變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子的方法是將野生型hiv病毒的基因組中編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因的開放閱讀框自5’末端第563位核苷酸的堿基a突變?yōu)間。

上述的對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株在篩選抗hiv病毒的藥物中應(yīng)用。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。如無特殊說明，實施例中所用的pbs緩沖液均為ph7.2，0.01m的pbs緩沖液。

mt-4細(xì)胞(人t淋巴細(xì)胞系)：參考文獻(xiàn)：haradas,koyanagiy,yamamoton.infectionofhtlv-iii/lavinhtlv-i-carryingcellsmt-2andmt-4andapplicationinaplaqueassay.science1985；229:563-566。

奈拉偉平(nvp)：由雅培公司所生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，藥物名稱是“奈韋拉平片”，每片的藥物含量為“200mg”。

實施例1

hiv耐藥株的構(gòu)建

1、用dmem培養(yǎng)基(含100μg/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)重懸293t細(xì)胞，得到4×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。

2、將細(xì)胞懸液加入6孔培養(yǎng)板，每孔2ml，37℃培養(yǎng)24小時，然后棄除上清，用pbs緩沖液洗滌兩次。

3、借助lipofectamine2000(按說明書操作)，將重組質(zhì)粒丁轉(zhuǎn)染步驟2的細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染4微克重組質(zhì)粒)，37℃培養(yǎng)36小時，收集培養(yǎng)上清。

4、將步驟3得到的培養(yǎng)上清進(jìn)行p24抗原測定(p24試劑盒：vironostika＠hiv-1antigenmicroelisasystem,生產(chǎn)商：biomerieux,產(chǎn)地：法國)，結(jié)果為陽性，該培養(yǎng)上清即為即為hiv耐藥株病毒液，分裝后-80℃保存。

實施例2

突變病毒株的病毒感染力鑒定

將實施例1得到hiv耐藥株病毒液和實施例1的步驟3得到的hiv野生株病毒液分別進(jìn)行如下鑒定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液。

2、吸取25μl待測病毒液于第1列孔中，混勻，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀釋11次，每個稀釋度設(shè)置4個復(fù)孔，設(shè)置最后一列不加入病毒液的孔作為對照孔。

3、每孔中加入100μlmt-4細(xì)胞液(mt-4細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液懸浮mt-4細(xì)胞得到的，100μlmt-4細(xì)胞液中含有10000個細(xì)胞)。37℃培養(yǎng)3天，取培養(yǎng)上清。

4、取熒光檢測96孔板(品牌：greiner；生產(chǎn)商：greinerbio-one；產(chǎn)地：德國；產(chǎn)品目錄號：655086)，每孔加入100μl步驟3得到的培養(yǎng)上清和100μltzm-bl細(xì)胞液(tzm-bl細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的dmem培養(yǎng)液懸浮tzm-bl細(xì)胞得到的，100μltzm-bl細(xì)胞液中含有10000個細(xì)胞)，37℃培養(yǎng)1天，使用熒光素酶檢測試劑盒(英文名：luciferaseassaysystem；品牌：promega；生產(chǎn)商：promegacorporation；產(chǎn)地：美國；產(chǎn)品目錄號：e1501)檢測病毒感染情況。

tcid50(tissuecultureinfectivedose,半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)指引起50％細(xì)胞發(fā)生感染(cytopathiceffect,cpe)的病毒量。

hiv耐藥株病毒液的病毒感染力為238932tcid50/ml。

hiv野生株病毒液的病毒感染力為297986tcid50/ml。

hiv耐藥株的病毒感染力較hiv野生株更強(qiáng)。

實施例3

突變病毒株的耐藥性鑒定

將實施例1的步驟2得到hiv耐藥株病毒液和實施例1的步驟3得到的hiv野生株病毒液分別進(jìn)行如下鑒定：

1、在96孔板中每孔加入100μl含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液。

2、使用rpmi1640培養(yǎng)液稀釋nvp，使nvp的濃度為10μm。

3、吸取25μl藥物溶液于第1列孔中，混勻，然后吸取25μl混合液置于下一列孔中，依次稀釋11次，每個稀釋度設(shè)置4個復(fù)孔，設(shè)置最后一列不加入藥物的孔作為對照孔。

4、取新的96孔板(用于細(xì)胞培養(yǎng))，每孔中加入100μlmt-4細(xì)胞液(mt-4細(xì)胞液是用含體積百分比為10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)液懸浮mt-4細(xì)胞得到的，100μlmt-4細(xì)胞液中含有10000個細(xì)胞)。

5、用pbs緩沖液調(diào)整待測病毒液的濃度，得到病毒量為4000tcid50/ml的病毒稀釋液。

6、在步驟4的細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入50μl步驟5的病毒稀釋液，然后分別每孔加入50μl步驟3配置的依次稀釋的藥物，37℃培養(yǎng)3天，取培養(yǎng)上清。

7、同實施例2的步驟4。

8、計算50％細(xì)胞出現(xiàn)cpe時的藥物濃度，即ic50值。

hiv耐藥株病毒液的ic50值為0.06127μm。

hiv野生株病毒液的ic50值為0.002899μm。

耐藥倍數(shù)＝hiv耐藥株病毒液的ic50值/hiv野生株病毒液的ic50值＝21.13。

sequencelisting.txt

<110>廣西醫(yī)科大學(xué)

<120>一種對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥的hiv-1毒株及其制備方法和應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>1191

<213>野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna序列

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<210>2

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<213>野生毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)序列

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<213>耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶dna人工序列

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<213>耐藥毒株的逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)人工序列

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