本發(fā)明涉及豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體細(xì)胞株及其在應(yīng)用，屬于獸用生物制品領(lǐng)域，。

背景技術(shù)：

豬瘟(classicalswinefever，csf)是由黃病毒科(flaviviridae)瘟病毒屬(pestivirus)的重要成員豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一種高度接觸性傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)規(guī)定的必需報(bào)告的疫病之一，在我國屬一類動(dòng)物傳染病。csfv為有囊膜的單股正鏈rna病毒，病毒粒子直徑為25-50nm。與csfv同屬的還有牛病毒性腹瀉病病毒(bovineviraldiarrheavirus,bvdv)和羊邊界病病毒(borderdiseasevirus,bdv),這三種病毒結(jié)構(gòu)相似，血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，并且有相似的宿主范圍。豬(包括家豬和野豬)是唯一的易感宿主。csf根據(jù)病程的不同可分為急性、亞急性、慢性和非典型性豬瘟。近些年來，世界范圍內(nèi)csf流行發(fā)生了明顯變化：從以前的大規(guī)模暴發(fā)流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈貐^(qū)性、周期性、散發(fā)形式。一些原本宣布消滅csf的國家又相繼出現(xiàn)復(fù)發(fā)，我國的csf發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。同時(shí)，多種病原混合感染也成為目前十分嚴(yán)重的現(xiàn)象，給臨床診斷和防治工作帶來了很大的困難。

csfv的囊膜糖蛋白e2(gp55)是研究得較為清楚的一種結(jié)構(gòu)蛋白。其位于病毒囊膜表面。在csfv編碼的蛋白中，e2是最不保守的一種蛋白，但又是csfv的主要保護(hù)性抗原蛋白，主要參與病毒的感染過程并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。其空間構(gòu)型由三個(gè)疏水區(qū)和三個(gè)n端的鏈內(nèi)二硫鍵構(gòu)成。e2蛋白由orf編碼的690(arg)至1060(leu)之間的370個(gè)氨基酸殘基組成，在靠近e2蛋白n端上游有一段信號(hào)肽序列。利用針對(duì)e2蛋白的各種單抗，wensvoort通過實(shí)驗(yàn)已證實(shí)csfve2具有4個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)域，分別為a、b、c和d，其中a、b、c含有中和性抗原表位。后經(jīng)vanrijn等人的研究，將這4個(gè)區(qū)域的位置確定下來。按照vanrijn等預(yù)測(cè)的e2抗原結(jié)構(gòu)模型，這些抗原結(jié)構(gòu)域位于e2蛋白近n端的1/2部分，且處于兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的抗原結(jié)構(gòu)單位，一個(gè)由結(jié)構(gòu)域b和c組成，另一個(gè)則由高度保守的a構(gòu)成，a又可分為a1、a2、a3三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，a結(jié)構(gòu)域中含有一疏水區(qū)，此疏水區(qū)在瘟病毒屬中高度保守。a1和a2都很保守，只有a1能產(chǎn)生中和性抗體；a3與d既不產(chǎn)生中和性抗體，也不保守。csfv上述抗原結(jié)構(gòu)單位(b/c或a)所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)都足以保護(hù)豬免受強(qiáng)毒攻擊，由于e2蛋白是csfv的免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，所以人們一直嘗試著把e2囊膜糖蛋白作為研制針對(duì)csfv新型疫苗的首選靶蛋白。2000年lin等報(bào)道了csfve2抗原表位tavspttlr，該表位位于e2氨基酸序列的829～837位，具有中和活性，在csfv內(nèi)高度保守，為csfv特異的抗原表位，而其他瘟病毒沒有這一表位；此外，e2還具有一個(gè)所有瘟病毒都有的保守性抗原表位yyep，位于e2羧基端得995～998位氨基酸。通過對(duì)e2蛋白單克隆抗體的進(jìn)一步篩選，繼而進(jìn)一步獲得e2蛋白抗原表位信息，不僅有助于分析e2蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)csfv的新型診斷技術(shù)研發(fā)和豬瘟病毒的基礎(chǔ)研究也具有積極意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一株分泌豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

本發(fā)明目的之二是提供一株由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體可與csfv-e2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)；

本發(fā)明的目的之三在于提供含有該株單克隆抗體的抗體檢測(cè)試劑盒；

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1.一株抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株，其特征在于所述細(xì)胞株命名為抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞csfv-1c8株，該細(xì)胞株已于2016年12月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心cgmccno.13387。

2.本發(fā)明所述的一株抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株，其特征在于所述細(xì)胞株能穩(wěn)定地分泌豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體。

3.本發(fā)明所述的一株抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于該cgmccno.13387細(xì)胞株分泌的抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體在檢測(cè)豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

4.本發(fā)明所述的一株抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于該試劑盒主要含有包被了豬瘟病毒e2蛋白的抗原包被板和由抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞cgmccno.13387株產(chǎn)生的被標(biāo)記辣根過氧化物酶的豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體。

5.本發(fā)明所述的一株抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于該試劑盒為豬瘟病毒e2檢測(cè)豬瘟抗體的競(jìng)爭(zhēng)elisa試劑盒。

具體實(shí)施方式

1.豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備

(1)動(dòng)物免疫取6周齡的balb/c雌性小鼠5只，將真核表達(dá)純化的豬瘟病毒e2蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化后，按100μg/只的劑量在小鼠背部多點(diǎn)注射；14天后，采用e2蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合乳化后，按上述方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；14天后，重復(fù)免疫1次。14天后，眼眶采血，分離血清，用間接elisa方法測(cè)定免疫小鼠抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)最高的小鼠，腹腔注射100μge2蛋白。3天后，取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

(2)細(xì)胞融合細(xì)胞融合前1天。制備飼養(yǎng)細(xì)胞。按常規(guī)方法制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。融合當(dāng)天，斷頸處死免疫小鼠，無菌摘取脾臟，分別用150目和200目的銅網(wǎng)進(jìn)行研磨和過濾，與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sp2/0細(xì)胞按照10:1的比例進(jìn)行混合，離心棄上清，在1min內(nèi)向細(xì)胞混合物中緩慢加入1ml50％peg，隨后分步加入10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行終止。離心后，用含1％hat和15％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

(3)雜交瘤細(xì)胞的篩選和亞克隆將豬瘟病毒thiveral株病毒用無血清培養(yǎng)基稀釋至200tcid50/0.1ml，接種長(zhǎng)滿單層的96孔pk15細(xì)胞板中，37℃5％co2培養(yǎng)72h后，棄培養(yǎng)液，固定，用于融合細(xì)胞的篩選。將融合細(xì)胞上清加入到固定后的pk15細(xì)胞板中，37℃反應(yīng)1h，pbs漂洗3次，加入工作濃度的fitc標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃反應(yīng)1h。pbs漂洗3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。將出現(xiàn)特異性胞漿染色的陽性孔中對(duì)應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，重復(fù)上述篩選方法，亞克隆3～4輪，最終獲得一株穩(wěn)定分泌csfve2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株命名為抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞csfv-1c8株，該細(xì)胞株已于2016年12月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心cgmccno.13387，將其分泌的抗體命名為豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體1c8，本發(fā)明又簡(jiǎn)稱1c8抗體。

(4)單克隆抗體腹水的制備取經(jīng)產(chǎn)的balb/c小鼠，腹腔注射無菌的液體石蠟，0.5ml/只，1周后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞csfv-1c8，1～2×10⁵個(gè)/ml，0.5ml/只，待小鼠腹腔膨大，出現(xiàn)明顯波動(dòng)感時(shí)，用注射器抽取腹水。將抽取的腹水離心10000r/min離心10min，分離上清保存于-20℃。

(5)單克隆抗體的純化將收集的單克隆抗體腹水10000r/min離心10min，取上清，每毫升腹水中加入40μl10％硫酸葡聚糖溶液和1mlcacl2溶液。室溫混合15min后，10000r/min離心10min，取上清。用葡聚糖g-50層析柱進(jìn)行脫鹽處理，將收集的蛋白按照hitrapproteinghp親和層析柱說明書進(jìn)行純化，收集目的蛋白峰。純化后的1c8單抗見圖5。

本發(fā)明所述的豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體具有良好的特異性，與牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒、偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒均無交叉反應(yīng)。

本發(fā)明利用多肽掃描技術(shù)對(duì)csfv-1c8所識(shí)別的e2蛋白表位進(jìn)行了鑒定，最終將其表位確定為：fdfdgpdgl，該表位位于e2氨基酸的898～906位。同時(shí)，序列比對(duì)結(jié)果顯示，這個(gè)多肽表位為csfv特有表位，同屬的bvdv和bdv無此表位。

本發(fā)明還提供包含所述的豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體的檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所述豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體在制備檢測(cè)豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用純化的豬瘟病毒e2蛋白包被于抗原包被板，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)elisa原理檢測(cè)豬瘟病毒抗體。

本發(fā)明所述的免疫檢測(cè)試劑盒包含包被了豬瘟病毒e2蛋白的抗原包被板，標(biāo)記了辣根過氧化物酶的豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體，底物液和終止液。

本發(fā)明還提供一種豬瘟病毒競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)豬瘟病毒抗體中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1：1c8單抗與csfve2蛋白反應(yīng)的western-blot鑒定結(jié)果。m：蛋白marker；1、2、3為豬瘟病毒e2蛋白與1c8單抗反應(yīng)條帶。

圖2：1c8單抗與csfve2蛋白和bvdve2蛋白的反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

圖3：1c8單抗的表位鑒定結(jié)果

圖4：不同濃度包被抗原和1c8單抗的n/p值

圖5：純化后的1c8單克隆抗體

圖6：最適反應(yīng)時(shí)間的確定

圖7：豬瘟病毒競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)方法臨界值的roc曲線分析

圖8：已知背景血清的檢測(cè)結(jié)果

本發(fā)明涉及的生物材料資源信息

豬偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，菌種保藏編號(hào):cvccav1211株,p139)，豬細(xì)小病病毒(porcineparvovirus,菌種保藏編號(hào):cvccav30株,p144)，牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus,菌種保藏編號(hào):cvccav67株p144)和csfvthiveral株(classicalswinefevervirus,菌種保藏編號(hào):cvccav65株p145)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保藏、提供；sp2/0細(xì)胞、pk-15細(xì)胞(cvcccl24株,p162)均由本實(shí)驗(yàn)室保存,(請(qǐng)見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p139,p144,p145,p162)

本發(fā)明的積極意義

本發(fā)明涉及一種抗豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體細(xì)胞株及其應(yīng)用。本發(fā)明篩選得到了一株穩(wěn)定分泌抗豬瘟病毒e2蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體csfv-1c8與csfv的e2蛋白能夠發(fā)生特異性反應(yīng)，而與牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒e2蛋白不發(fā)生反應(yīng)；該單克隆抗體能特異的識(shí)別豬瘟病毒e2蛋白，且其識(shí)別的表位為：fdfdgpdgl；本發(fā)明的單克隆抗體及該單克隆抗體所識(shí)別的豬瘟病毒e2蛋白表位可制成檢測(cè)csfv的試劑，為建立豬瘟病毒抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明建立的一種檢測(cè)豬瘟抗體的競(jìng)爭(zhēng)elisa試劑盒具有特異、敏感和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適合豬瘟抗體的大規(guī)模篩查。

實(shí)施例

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。

本發(fā)明所使用的主要實(shí)驗(yàn)材料和來源：

1.蛋白、細(xì)胞和病毒

真核表達(dá)并純化的csfve2蛋白、bvdve2蛋白、sp2/0細(xì)胞、pk-15細(xì)胞和csfvthiveral株均由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；豬偽狂犬病病毒(菌種保藏編號(hào)：cvccav1211)，豬細(xì)小病病毒(菌種保藏編號(hào):cvccav30)，牛病毒性腹瀉病毒(菌種保藏編號(hào):cvccav67)及相應(yīng)病毒的特異性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保藏、提供。

2.主要試劑

胎牛血清：購自sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色試劑盒購自康為試劑生物科技有限公司；fitc標(biāo)記羊抗鼠igg抗體、fitc標(biāo)記兔抗豬二抗、hrp標(biāo)記兔抗鼠igg抗體、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶購自sigma公司；蛋白marker購自fermentas公司；50％peg、50×hat、50×ht購自sigma公司；dmem、mem培養(yǎng)基購自gibcol公司；piercerapidelisamousemabisotypingkit購自thermo公司；vectorvip顯色劑，購自美國vetorlabs公司；hitrapproteinghp層析柱，購自gehealthcare公司；bsa，購自calbiochem公司。

3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡和經(jīng)產(chǎn)balb/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1

——豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的制備

1.動(dòng)物免疫

取6周齡的balb/c雌性小鼠5只，將真核表達(dá)純化的豬瘟病毒e2蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化后，按100μg/只的劑量在小鼠背部多點(diǎn)注射；14天后，采用e2蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合乳化后，按上述方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；14天后，重復(fù)免疫1次。14天后，眼眶采血，分離血清，用間接elisa方法測(cè)定免疫小鼠抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)最高的小鼠，腹腔注射100μge2蛋白。3天后，取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.細(xì)胞融合

細(xì)胞融合前1天。制備飼養(yǎng)細(xì)胞。按常規(guī)方法制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

融合當(dāng)天，斷頸處死免疫小鼠，無菌摘取脾臟，分別用150目和200目的銅網(wǎng)進(jìn)行研磨和過濾，與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sp2/0細(xì)胞按照10:1的比例進(jìn)行混合，離心棄上清，在1min內(nèi)向細(xì)胞混合物中緩慢加入1ml50％peg，隨后分步加入10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行終止。離心后，用含1％hat和15％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

3.雜交瘤細(xì)胞的篩選和亞克隆

將豬瘟病毒thiveral用無血清培養(yǎng)基稀釋至200tcid50/0.1ml，接種長(zhǎng)滿單層的96孔pk15細(xì)胞板中，37℃5％co2培養(yǎng)72h后，棄培養(yǎng)液，固定，用于融合細(xì)胞的篩選。將融合細(xì)胞上清加入到固定后的pk15細(xì)胞板中，37℃反應(yīng)1h，pbs漂洗3次，加入工作濃度的fitc標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃反應(yīng)1h。pbs漂洗3次后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。將出現(xiàn)特異性胞漿染色的陽性孔中對(duì)應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，重復(fù)上述篩選方法，亞克隆3～4輪，最終獲得一株穩(wěn)定分泌csfve2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株命名為抗豬瘟病毒e2蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞csfv-1c8株，該細(xì)胞株已于2016年12月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心cgmccno.13387，將其分泌的抗體命名為豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體1c8，本發(fā)明又簡(jiǎn)稱1c8抗體。

4.單克隆抗體腹水的制備

取經(jīng)產(chǎn)的balb/c小鼠，腹腔注射無菌的液體石蠟，0.5ml/只，1周后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞csfv-1c8，1～2×10⁵個(gè)/ml，0.5ml/只，待小鼠腹腔膨大，出現(xiàn)明顯波動(dòng)感時(shí)，用注射器抽取腹水。將抽取的腹水離心10000r/min離心10min，分離上清保存于-20℃。

實(shí)施例2

——單克隆抗體的鑒定

1.單克隆抗體亞型鑒定

根據(jù)piercerapidelisamousemabisotypingkit說明書對(duì)實(shí)施例1中所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定。

結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體1c8的重鏈為igg1，輕鏈為kappa鏈。

2.westernblot鑒定

將e2蛋白進(jìn)行sds-page電泳，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5％脫脂奶粉封閉后，加入單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1h，用pbst漂洗3次，加入工作濃度的hrp標(biāo)記兔抗鼠igg，37℃孵育1h，用pbst漂洗3次。按照vectorvip說明書進(jìn)行顯色。

如圖1所示，1c8單抗與csfve2蛋白能夠發(fā)生特異性結(jié)合，在45kd處出現(xiàn)特異性條帶。

3.特異性鑒定

將csfv、prv、pcv-2、ppv和bvdv分別接種敏感細(xì)胞。37℃5％co2培養(yǎng)72小時(shí)后，對(duì)接毒細(xì)胞進(jìn)行固定。將接毒后的細(xì)胞分為兩組，第一組向接毒細(xì)胞中加入1c8細(xì)胞上清，第二組加入相應(yīng)病毒的特異性的抗體。37℃作用1h，pbs漂洗細(xì)胞3次，加入工作濃度的fitc標(biāo)記二抗，37℃作用1h，pbs漂洗細(xì)胞3次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。從結(jié)果可以看出，第二組接毒細(xì)胞中均出現(xiàn)了特異性的熒光，說明病毒在敏感細(xì)胞上正常生長(zhǎng)。而第一組細(xì)胞中僅有豬瘟病毒thiveral株出現(xiàn)了特異性熒光。從結(jié)果說明，該株單抗與豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒和牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒不發(fā)生反應(yīng)。

為了進(jìn)一步排除1c8單抗與bvdve2蛋白的交叉反應(yīng)，將純化的csfve2蛋白和bvdve2蛋白同時(shí)包被elisa反應(yīng)板，與1c8單抗進(jìn)行間接elisa反應(yīng)，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，1c8單抗僅與csfve2蛋白發(fā)生反應(yīng)，與bvdve2蛋白無交叉反應(yīng)。

4,表位鑒定

采用多肽掃描技術(shù)，對(duì)1c8單抗所對(duì)應(yīng)的表位進(jìn)行鑒定。構(gòu)建e2重組病毒的親本毒株為豬瘟兔化弱毒疫苗株。因此，e2基因的氨基酸序列為序列1所示：

按照上述氨基酸序列合成15個(gè)氨基酸的多肽，重置14個(gè)氨基酸，共合成313條多肽序列，制備多肽芯片。用1c8單抗與芯片上的多肽分別反應(yīng)，分析每條多肽與單抗的反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，確定單克隆抗體表位。

如圖3所示，有5個(gè)表位與1c8單抗出現(xiàn)了5個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，其中一個(gè)為強(qiáng)反應(yīng)位點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)的序列為fdfdgpdgl；另外4個(gè)為弱反應(yīng)位點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)的序列分別為：llfdgtnpst，dgtnpsteemgdd，gddfrsgl和cvttivene。因此，確定1c8單抗所針對(duì)的e2蛋白表位為fdfdgpdgl。

5.單克隆抗體的純化

將收集的單克隆抗體腹水10000r/min離心10min，取上清，每毫升腹水中加入40μl10％硫酸葡聚糖溶液和1mlcacl2溶液。室溫混合15min后，10000r/min離心10min，取上清。用葡聚糖g-50層析柱進(jìn)行脫鹽處理，將收集的蛋白按照hitrapproteinghp親和層析柱說明書進(jìn)行純化，收集目的蛋白峰。純化后的1c8單抗見圖5。

實(shí)例3.

——豬瘟病毒競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)試劑盒的制備

1.單克隆抗體的標(biāo)記

稱取2mg辣根過氧化物酶粉末溶于0.5ml蒸餾水中，加入0.5ml新鮮配制的0.06mnaio4溶液，4℃避光30min。加入160mm乙二醇0.5ml，室溫放置30min。向上述溶液中加入親和層析純化的單抗2mg，混勻。將上述溶液裝入透析袋內(nèi)，置于2000ml0.05m碳酸鹽緩沖液中透析過夜。次日，將標(biāo)記物移至15ml離心管中，加入0.2ml新鮮配制的5mg/mlnabh4溶液，混勻。將溶液用葡聚糖g-50層析，收集蛋白峰，去除未結(jié)合的辣根過氧化物酶。

2.抗原最適包被濃度和hrp標(biāo)記1c8單抗最適工作濃度的確定

分別將csfve2蛋白稀釋至1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml和0.05μg/ml包被酶標(biāo)板，每個(gè)濃度包被1行。分別在酶標(biāo)板的1、3、5、7、9列加入豬瘟抗體陽性血清，2、4、6、8、10列加入豬瘟抗體陰性血清，50μl/孔。將hrp標(biāo)記1c8單抗分別按照1:1000、1:2000、1:4000、1:6000和1:8000稀釋。每個(gè)稀釋度的單抗依次加2列。37℃反應(yīng)1h，pbst洗板3次，加入tmb顯色液顯色10min，終止，讀od450nm吸光值。如表1所示。計(jì)算n/p值，選擇比值最高的抗原和單抗?jié)舛鹊慕M合作為最佳稀釋倍數(shù)。如圖4所示。結(jié)果表明，csfve2蛋白的最適包被濃度為0.1μg/ml，hrp標(biāo)記單抗的最佳稀釋倍數(shù)為1:6000。

表1抗原最適包被濃度和hrp標(biāo)記1c8單抗最適工作濃度的確定

3.最適反應(yīng)時(shí)間的確定

將csfve2蛋白以0.1μg/ml的濃度包被反應(yīng)板，封閉后，在相應(yīng)孔中分別加入50μl陽性對(duì)照血清和50μl陰性對(duì)照血清，再在所有反應(yīng)孔中加入50μl1:6000稀釋的hrp標(biāo)記單抗，37℃分別反應(yīng)0.5h、1h、1.5h和2h，比較不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)效果。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)1h后，抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，od值基本維持恒定，因此，確定37℃1h為最適反應(yīng)條件。圖6。

4.臨界值的確定

本試劑盒采用抑制率作為結(jié)果判定參數(shù)。

抑制率＝(陰性對(duì)照od450nm-樣本od450nm)/陰性對(duì)照od450nm×100％

從田間采集298份豬瘟抗體陰性豬血清和350份豬瘟抗體陽性豬血清，用建立的競(jìng)爭(zhēng)elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每份血清的抑制率。采用spss軟件進(jìn)行分析，以1-特異性為縱坐標(biāo)，敏感性為橫坐標(biāo)，繪制roc曲線，如圖7，roc曲線相關(guān)參數(shù)見表2。從表2中可以看出，曲線的下面積為0.996765，證明本診斷方法的準(zhǔn)確率極高，該競(jìng)爭(zhēng)elisa試劑盒具有很高的診斷價(jià)值。

在roc曲線的基礎(chǔ)上計(jì)算youden指數(shù)(youden指數(shù)＝y(tǒng)ouden指數(shù)＝敏感性-(1-特異性))，選擇youden指數(shù)最大值所對(duì)應(yīng)的抑制率作為臨界值，最終確定臨界值為37％。見表3。在此臨界值下，本方法所對(duì)應(yīng)的敏感性為92.9％，特異性為98％。

表2roc曲線相關(guān)參數(shù)

表3臨界值所對(duì)應(yīng)的敏感性、特異性及youden指數(shù)(部分)

5.基于豬瘟病毒競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)方法檢測(cè)豬血清

取8份豬瘟抗體免疫血清(包含強(qiáng)陽性2份，中陽性3份，弱陽性3份)，非免疫豬瘟抗體血清8份，共計(jì)16份血清樣本，采用建立的豬瘟病毒競(jìng)爭(zhēng)elisa抗體檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，主要操作方法如下：

將csfve2蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋至0.1μg/ml，加入到96孔酶標(biāo)板中，100μl/孔，2～8℃放置16h，用pbst洗板1次；用含3％bsa的pbs緩沖液封閉，300μl/孔，2～8℃放置24h，用pbst洗板3次。將待檢的16份豬血清與陰、陽性對(duì)照血清加入到相應(yīng)孔中，50μl/孔，再向所有孔中加入1:6000稀釋的hrp-1c8單抗，50μl/孔，37℃反應(yīng)1h。pbst洗板3次。每孔加入tmb底物顯色液，100μl/孔，顯色10min，加入1mol/lhcl溶液終止反應(yīng)，測(cè)定od450nm吸光值。結(jié)果見圖8。

結(jié)果顯示，免疫血清和非免疫血清od450nm吸光值能夠明顯區(qū)分。免疫血清的吸光值均在37％以上，其中，強(qiáng)陽性血清吸光值均大于70％，中陽性血清在50％～70％之間，弱陽性血清在37％～45％之間；非免疫血清的吸光值均小于30％。所得結(jié)果與預(yù)期一致，證明本試劑盒用于檢測(cè)豬瘟免疫抗體有效且實(shí)用。

序列表

　　<110>中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

　　<120>一種抗豬瘟病毒e2蛋白單克隆抗體細(xì)胞株及其應(yīng)用

　　<130>

　　<160>1

　　<170>patentinversion3.5

　　<210>1

　　<211>328

　　<212>prt

　　<213>人工序列

　　<223>對(duì)人工序列的描述：豬瘟病毒e2基因的氨基酸序列

　　<400>1

　　argleualacyslysgluasptyrargtyralaileserserthrasp

51015

　　gluileglyleuleuglyalaglyglyleuthrthrthrtrplysglu

202530

　　tyrasnhisaspleuglnleuasnaspglythrvallysalasercys

　　　　　　　354045

　　valalaglyserphelysvalthralaleuasnvalvalserargarg

　　505560

　　tyrleualaserleuhislyslysalaleuprothrservalthrphe

　　65707580

　　gluleuleupheaspglythrasnproserthrgluglumetglyasp

　　859095

　　asppheargserglyleucyspropheaspthrserprovalvallys

　　100105110

　　glylystyrasnthrthrleuleuasnglyseralaphetyrleuval

　　115120125

　　cysproileglytrpthrglyvalileglucysthralavalserpro

　　130135140

　　thrthrleuargthrgluvalvallysthrpheargargasplyspro

　　145150155160

　　pheprohisargmetaspcysvalthrthrilevalgluasngluasp

　　165170175

　　leuphetyrcyslysleuglyglyasntrpthrcysvallysglyglu

　　180185190

　　provalvaltyrthrglyglyvalvallysglncysargtrpcysgly

　　195200205

　　pheasppheaspglyproaspglyleuprohistyrproileglylys

　　210215220

　　cysileleualaasngluthrglytyrargilevalaspserthrasp

　　225230235240

　　cysasnargaspglyvalvalileserthrgluglyserhisglucys

　　245250255

　　leuileglyasnthrthrvallysvalhisalaseraspgluargleu

　　　　　　　　　260265270

　　glyprometprocysargprolysgluilevalserseralaglypro

　　275280285

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　　290295300

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325

2