本發(fā)明屬于干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：牙周炎是侵犯牙齦和牙周組織的慢性炎癥，是一種破壞性疾病，其主要特征為牙周袋的形成、袋壁的炎癥、牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動(dòng)，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因。本病多因?yàn)榫?、牙石、食物嵌塞、不良修?fù)體和咬創(chuàng)傷等引起，癥狀多表現(xiàn)為牙齦發(fā)炎腫脹，同時(shí)使菌斑堆積加重，并由齦上向齦下擴(kuò)延。由于齦下微生態(tài)環(huán)境的特點(diǎn)，齦下菌斑中滋生著大量毒力較大的牙周致病菌，如牙齦類桿菌、中間類桿菌、螺旋體等，使牙齦的炎癥加重并擴(kuò)延，導(dǎo)致牙周袋形成和牙槽骨吸收，造成牙周炎。牙周炎已被醫(yī)學(xué)界定論為繼癌癥、心腦血管疾病之后，威脅人類身體健康的第三大殺手，也是口腔健康的“頭號(hào)殺手”。牙周炎出現(xiàn)的一些前期癥狀，也成為口腔“亞健康”惡化的主要特征。治療牙周炎的主要途徑在于消除炎癥，促進(jìn)被破壞的牙周組織的再生，恢復(fù)牙齒的正常功能。臨床常采用的牙周炎治療方法包括：牙周基礎(chǔ)治療(潔治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣術(shù)及牙周組織再生術(shù)。然而，上述方法均一定程度上給患者帶來(lái)不便和痛苦，而且無(wú)法根治牙周炎，容易復(fù)發(fā)或繼續(xù)加重。因此，臨床上迫切需要找到創(chuàng)傷小、易接受、療效好的新的治療方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，用于輔助治療牙周炎，減輕手術(shù)痛苦，改善患者的生活質(zhì)量。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑，包含：牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人血白蛋白。優(yōu)選的，所述牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞密度為4×106個(gè)/ml～7×106個(gè)/ml。優(yōu)選的，所述人血白蛋白的體積百分比濃度為5％～20％，更優(yōu)選為5％～15％，最優(yōu)選為10％～15％。優(yōu)選的，所述牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞為第四代至第六代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選的，所述干細(xì)胞制劑為注射劑。優(yōu)選的，所述干細(xì)胞制劑的注射劑量為10ml/次。本發(fā)明還提供了一種上述干細(xì)胞制劑的制備方法，將牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人血白蛋白混合均勻，得到所述干細(xì)胞制劑。本發(fā)明還提供了上述干細(xì)胞制劑或上述制備方法得到的干細(xì)胞制劑在制備治療牙周炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的一種干細(xì)胞制劑，包括：牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人血白蛋白，各組分配伍合理、協(xié)同增效，促進(jìn)牙周炎的修復(fù)治療，改善患者的生活質(zhì)量。本發(fā)明采用牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，采集簡(jiǎn)單、容易獲得，而且免疫原性低，無(wú)倫理問(wèn)題，對(duì)于牙周炎患者具有重要意義。本發(fā)明所提供的制備方法，步驟操作簡(jiǎn)單，工藝優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，用于輔助治療牙周炎，減輕手術(shù)痛苦，改善患者的生活質(zhì)量。下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。實(shí)施例1牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)采集牙齒，在清洗后把牙齒置于12孔板中，每顆牙齒只放在一個(gè)孔，用3ml酒精清洗兩次，去除牙周膜及牙垢，然后用3ml含1％雙抗的pbs清洗2次，再用紗布包著牙齒，用老虎鉗把牙齒鉗開，用尖捏把牙腔中的牙髓組織夾出來(lái)，放于ep管中，取完后再用小剪刀把組織塊剪碎。往規(guī)格為15ml的離心管中加入0.9ml體積百分比濃度為0.3-0.5％的i型膠原酶和0.6ml體積百分比濃度為1％的dispase分散酶，混勻后，把牙髓組織轉(zhuǎn)移到此離心管中，轉(zhuǎn)移至恒溫震蕩儀中以37℃、100～150rpm消化30～50min。然后加入2～4mldmem/f12完全培養(yǎng)基終止消化，1500rpm離心5min，去上清，用9mldmem/f12重懸細(xì)胞沉淀，接種到6孔板，每孔接3ml，再在每孔加30μl雙抗和egf，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換一次培養(yǎng)基，等到細(xì)胞匯合度達(dá)到50％以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)時(shí)隔天換培養(yǎng)基，等匯合度達(dá)到90％以上再進(jìn)行下一代傳代培養(yǎng)處理，然后分別收集第三代至第六代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例2取第三代牙髓干細(xì)胞用生理鹽水清洗兩遍，用0.25％胰蛋白酶消化下來(lái)，用dmem/f12完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中1500rpm離心5min；用生理鹽水重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清，如此重復(fù)兩次，然后加入生理鹽水和人血白蛋白，混勻，用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，再用注射器收集濾液，做成10ml注射制劑。其中，該注射制劑中牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞密度為4×106個(gè)/ml，人血白蛋白的體積百分比濃度為5％。實(shí)施例3取第四代牙髓干細(xì)胞用生理鹽水清洗兩遍，用0.25％胰蛋白酶消化下來(lái)，用dmem/f12完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中1500rpm離心5min；用生理鹽水重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清，如此重復(fù)兩次，然后加入生理鹽水和人血白蛋白，混勻，用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，再用注射器收集濾液，做成10ml注射制劑。其中，該注射制劑中牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml，人血白蛋白的體積百分比濃度為10％。實(shí)施例4取第五代牙髓干細(xì)胞用生理鹽水清洗兩遍，用0.25％胰蛋白酶消化下來(lái)，用dmem/f12完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中1500rpm離心5min；用生理鹽水重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，去上清，如此重復(fù)兩次，然后加入生理鹽水和人血白蛋白，混勻，用70μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，再用注射器收集濾液，做成10ml注射制劑。其中，該注射制劑中牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞密度為6×106個(gè)/ml，人血白蛋白的體積百分比濃度為15％。實(shí)施例5隨機(jī)選取50例牙周炎患者，將患者隨機(jī)分為2組，每組25人，其中一組設(shè)為對(duì)照組，另外3組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組采用米諾霉素注射治療，3組實(shí)驗(yàn)組分別采用實(shí)施例2至實(shí)施例4所制備的干細(xì)胞制劑進(jìn)行注射治療，分別注射到患者牙齦處，每隔兩周注射一次，每次注射10ml，然后在第3周、第6周和第9周分別觀察一次治療效果。表1為第3周的觀察結(jié)果，表2為第6周的觀察結(jié)果，表3為第9周的觀察結(jié)果，如表1-3的結(jié)果所示，對(duì)照組和3組實(shí)驗(yàn)組均呈現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)，其中實(shí)驗(yàn)組的痊愈人數(shù)和顯效人數(shù)均高于對(duì)照組，說(shuō)明本發(fā)明所提供的干細(xì)胞制劑能有效改善牙周炎。以下為評(píng)估指標(biāo)：無(wú)效：牙齦病情無(wú)改善還會(huì)經(jīng)常性疼痛；有效：牙齦病情有改善偶爾還會(huì)疼痛；有效不復(fù)發(fā)：牙齦病情有改善不會(huì)疼痛。表1無(wú)效有效有效不復(fù)發(fā)對(duì)照組4192實(shí)施例20187實(shí)施例30169實(shí)施例40196表2表3無(wú)效有效有效不復(fù)發(fā)對(duì)照組01510實(shí)施例20421實(shí)施例30124實(shí)施例40520當(dāng)前第1頁(yè)12