本發(fā)明涉及一株雜交瘤細胞株ab1及其產(chǎn)生的2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體，屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2,4,5-三氯苯氧乙酸，也稱2,4,5-涕或2,4,5-t，可用作植物的生長調(diào)節(jié)劑、除草劑。純品為白色無臭晶體，難溶于水，對人體有一定危害。根據(jù)不同植物施用適當(dāng)計量，可以防止植物落花落果，但用量不當(dāng)會使植物受到嚴(yán)重傷害。2,4,5-三氯苯氧乙酸具有一定的毒性，對小鼠的ld50是389mg/kg，而大鼠是500mg/kg。
目前關(guān)于2,4,5-t的檢測方法還未有報道。而酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，且檢測時對樣本的純度要求不高，操作簡便，可實現(xiàn)對大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。建立高效的免疫學(xué)檢測方法，篩選高特異性的單克隆單體是重要前提。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對2,4,5-三氯苯氧乙酸具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立2,4,5-三氯苯氧乙酸的免疫學(xué)檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案，一株2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體雜交瘤細胞株ab1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號為cgmccno.13083。
2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體，它由所述保藏編號為cgmccno.13083的2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體雜交瘤細胞株ab1分泌產(chǎn)生。
所述2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測中2,4,5-三氯苯氧乙酸殘留的分析檢測。
本發(fā)明提供的2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體雜交瘤細胞株ab1的制備基本步驟為：
（1）半抗原：
mol.wt:253.93
2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-t）原藥中含活潑基團（-cooh），即將其作為半抗原。
（2）完全抗原的制備：稱取2.5mg2,4,5-t（2,4,5-t與牛血清白蛋白bsa摩爾比為60︰1），3mgn-羥基琥珀酰亞胺（nhs），溶解于300μl無水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室溫攪拌反應(yīng)10min；再稱取3mgn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺（dcc），用100μl無水dmf充分溶解后，加入到2,4,5-t溶液中，室溫攪拌反應(yīng)6-8h（稱為a液）。取10mgbsa，用2ml0.01m磷酸鹽緩沖溶液（pbs,ph=7.0）溶解（稱為b液），再逐滴將a液緩慢加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜；然后用0.01mpbs溶液透析，除去未反應(yīng)的小分子半抗原，得到完全抗原2,4,5-t-dcc-bsa，并通過紫外吸收掃描方法進行鑒定，計算得偶聯(lián)率為25；
（3）小鼠的免疫：選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進行免疫。將2,4,5-t-dcc-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，對balb/c小鼠進行頸背部皮下多點注射免疫（沖刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐劑，劑量為100μg/只；多次加強免疫用不完全弗氏佐劑且劑量減半即為50μg/只；沖刺免疫不用佐劑，直接用生理鹽水稀釋后腹腔注射，劑量再減半即為25μg/只。首次免疫與第二次加強免疫之間間隔一個月，多次加強免疫之間間隔21天，沖刺免疫與最后一次加強免疫之間間隔17-21天。通過間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）觀測小鼠免疫效果即檢測小鼠血清的效價和抑制；
（4）細胞融合與細胞株的建立：通過聚乙二醇（peg4000）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞進行融合，采用選擇性培養(yǎng)基（hat培養(yǎng)基）篩選出雜交瘤細胞，并用ht培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。融合一周后利用ic-elisa法檢測陽性細胞孔，并進一步利用ic-elisa法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對抑制較好的陽性細胞孔進行亞克隆，一周后再次檢測、挑孔、亞克隆。按上述方法進行三次亞克隆后獲得2,4,5-t的高分泌特異抗體的單克隆雜交瘤細胞株ab1；
（5）雜交瘤細胞株ab1性質(zhì)的鑒定：通過ic-elisa測定靈敏度和特異性。
2,4,5-t-dcc-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化完全，通過頸背部皮下多點注射免疫balb/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐劑，多次加強免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐劑，最后一次沖刺免疫用2,4,5-t-dcc-bsa完全抗原（25μg/只，不含佐劑）進行小鼠腹腔注射。取特異性高，ic50低的小鼠脾細胞，通過peg方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過ic-elisa法篩選細胞和三次亞克隆，得到一株高分泌特異抗體的雜交瘤細胞株ab1。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的細胞株ab1分泌的單克隆抗體，對2,4,5-三氯苯氧乙酸具有較好的特異性和檢測靈敏度（ic50值為4.4ng/ml），可實現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品中2,4,5-三氯苯氧乙酸殘留量的分析檢測，為食品中2,4,5-三氯苯氧乙酸殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應(yīng)用價值。
生物材料樣品保藏：一株2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體雜交瘤細胞株ab1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，保藏編號為cgmccno.13083。
附圖說明
圖1是ab1單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施方式
本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明通過將2,4,5-三氯苯氧乙酸完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過ic-elisa篩選細胞上清，最終得到了對2,4,5-三氯苯氧乙酸有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
實施例1雜交瘤細胞株ab1的制備
（1）半抗原：2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-t）原藥中含活潑基團（-cooh），即可作為半抗原。
（2）完全抗原的合成：稱取2.5mg2,4,5-t（2,4,5-t與牛血清白蛋白（bsa）摩爾比為60︰1），3mgn-羥基琥珀酰亞胺（nhs），溶解于300μl無水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室溫攪拌反應(yīng)10min；再稱取3mgn,n'-二環(huán)己基碳二亞胺（dcc），用100μl無水dmf充分溶解后，加入到2,4,5-t溶液中，室溫攪拌反應(yīng)6-8h（稱為a液）。取10mgbsa，用2ml0.01m磷酸鹽緩沖溶液（pbs,ph=7.0）溶解（稱為b液），再逐滴將a液緩慢加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜；然后用0.01mpbs溶液透析，除去未反應(yīng)的小分子半抗原，得到完全抗原2,4,5-t-dcc-bsa，并通過紫外吸收掃描方法進行鑒定。
（3）小鼠的免疫：選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進行免疫。取2,4,5--dcc-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過頸背部皮下多點注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑，沖刺免疫不用佐劑。首次免疫與第二次加強免疫之間間隔一個月，多次加強免疫之間間隔21天。第三次免疫后7天小鼠斷尾采血，采用ic-elisa法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在第五次免疫后17-21天沖沖刺免疫，腹腔注射，要求沖免劑量減半且不含任何佐劑。
（4）細胞融合：在沖刺免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為4000）方法進行細胞融合，具體步驟如下：
a、小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，無菌操作取出小鼠的脾臟，用注射器膠頭適度研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，收集，離心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌脾細胞三次，最后一次離心后，將脾細胞稀釋到一定體積，計數(shù)，備用；
b、收集sp2/0細胞：融合前7-10天，將sp2/0瘤細胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培養(yǎng)基在5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細胞數(shù)量達到（1-4）×107，保證融合前sp2/0瘤細胞處于對數(shù)生長期。融合時，收集瘤細胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；
c、融合過程7min：第1min，將1ml的peg4000由慢到快滴加到細胞中；第2min，靜置。第3min和第4min，在1min內(nèi)滴加1mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第5min和第6min，在1min內(nèi)滴加2mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。然后37℃溫浴5min。離心（800rpm，10min），棄上清，細胞輕輕敲散，并向其內(nèi)加入含20%胎牛血清、2%50×hat的rpmi-1640選擇性培養(yǎng)基（hat培養(yǎng)基），按照200μl/孔加到96孔細胞板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（5）細胞篩選與細胞株建立：在細胞融合后的第3天用hat培養(yǎng)基對融合細胞進行半換液；第5天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液（ht培養(yǎng)基）進行全換液；第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用ic-elisa法篩選出陽性細胞孔，第二步選用2,4,5-三氯苯氧乙酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用ic-elisa法對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對2,4,5-三氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，7天后用同樣的方法進行檢測。按上述方法進行三次亞克隆，最終獲得2,4,5-三氯苯氧乙酸單克隆抗體細胞株ab1。
（6）單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×1062,4,5-三氯苯氧乙酸雜交瘤細胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-飽和硫酸銨法進行抗體純化。在偏酸條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀；再用等量飽和度的硫酸銨溶液沉淀igg型的單克隆抗體，離心，棄上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體置于-20℃保存。
6.1包被：將包被原2,4,5-t-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從1μg/ml開始3倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h；
6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
6.3封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
6.4加樣：將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；
6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
6.6終止和測定：每孔加入50μl終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔的od450值。
用ic-elisa測定單克隆抗體2,4,5-三氯苯氧乙酸的ic50為4.4ng/ml，說明對2,4,5-三氯苯氧乙酸有很好的靈敏度，可用于2,4,5-三氯苯氧乙酸免疫分析檢測。
溶液的配置：
碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐溫20的pbs；
tmb顯色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比5︰1混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。