本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(aatd)是一種世界范圍的遺傳疾病，為單基因突變導(dǎo)致的常染色體共顯性遺傳，主要表現(xiàn)為肺氣腫、肝硬化、肝癌，少數(shù)體現(xiàn)為皮膚疾病脂膜炎等。aatd患者的治療需要依賴周期性靜脈注射人α1-抗胰蛋白酶制劑。

目前，臨床使用的人α1-抗胰蛋白酶制劑主要由人血漿純化獲得，這限制了其大批量生產(chǎn)，導(dǎo)致了人α1-抗胰蛋白酶制劑供不應(yīng)求，價格昂貴，僅有部分患者有條件使用。除此之外，由于診斷技術(shù)的限制，多數(shù)的aatd患者至今未得到有效診斷，所以隨著診斷技術(shù)的進步，人α1-抗胰蛋白酶制劑的需求勢必將進一步增加。然而，人血漿資源供應(yīng)有限，制約著血漿純化來源的人α1-抗胰蛋白酶制劑的供應(yīng)，亟需開發(fā)重組人α1-抗胰蛋白酶制品。目前，世界上尚無藥用的重組人α1-抗胰蛋白酶制品產(chǎn)生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組體細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)獲得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列在所述aavs1位點的左、右同源臂之間；在表達(dá)質(zhì)粒中篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)分別插入一個loxp序列，且這兩個loxp序列的方向一致，得到改造的表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)改造的表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組質(zhì)粒和靶向aavs1位點的crispr/cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的體細(xì)胞，篩選獲得定點整合的體細(xì)胞；

(3)以表達(dá)cre酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟(2)獲得的定點整合的體細(xì)胞，通過cre/loxp系統(tǒng)切除篩選標(biāo)記，篩選獲得切除了篩選標(biāo)記且穩(wěn)定表達(dá)重組α1-抗胰蛋白酶的體細(xì)胞株。

本發(fā)明的細(xì)胞株是通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合同源重組實現(xiàn)的。其中crispr/cas9的靶序列在人的基因組aavs1位點，靶序列為ggggccactagggacaggat。當(dāng)crispr/cas9質(zhì)粒和改造后的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染體細(xì)胞后，crispr/cas9系統(tǒng)在靶位點處剪切dna，形成雙鏈缺口。在存在含有同源臂的目的基因載體的情況下，雙鏈缺口以其為模板，進行同源重組修復(fù)，實現(xiàn)目的基因在靶點處的定點插入。

在本發(fā)明中，人基因組的aavs1位點位于人19號染色體的ppp1r12c基因的內(nèi)含子中；所述人α1-抗胰蛋白酶具有如seqidno:1所示的氨基酸序列，人α1-抗胰蛋白酶的基因具有如seqidno:2所示的核苷酸序列。

步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒，可以通過克隆技術(shù)進行構(gòu)建，也可以直接采用商業(yè)化的產(chǎn)品質(zhì)粒。優(yōu)選地，步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標(biāo)記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達(dá)質(zhì)粒為genome-taler^tm貨號為dc-don-sh01的aavs1供體克隆載體。

優(yōu)選地，所述loxp序列如seqidno:4所示。

aavs1位點在所有的人細(xì)胞中存在，所以所有類型的人細(xì)胞都可以通過該方法進行基因編輯，只是蛋白表達(dá)量可能有所不同。優(yōu)選地，選擇已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的人的體細(xì)胞作為受體細(xì)胞，更便于工業(yè)生產(chǎn)，最優(yōu)選地，所述人的體細(xì)胞為hek293細(xì)胞或per.c6細(xì)胞。尤其是hek293細(xì)胞，其表達(dá)目的蛋白的量特別好，另外，該細(xì)胞株表達(dá)的人α1-抗胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能更類似于天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利于人α1-抗胰蛋白酶制劑的推廣和應(yīng)用。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株的制備方法中，步驟(1)中的所述篩選標(biāo)記基因由熒光報告基因和抗藥性基因組成。在本發(fā)明的一些實施方式中所述篩選標(biāo)記基因中的熒光報告基因為gfp基因，抗藥性基因為抗嘌呤霉素基因。

在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株的制備方法中，步驟(1)中所述人α1-抗胰蛋白酶基因、篩選標(biāo)記基因、aavs1位點的左、右同源臂、loxp的排列方式具體為：aavs1位點的左同源臂、表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因、loxp、gfp基因、抗嘌呤霉素基因、loxp、aavs1位點的右同源臂依次排列；且這兩個loxp的插入方向相同。

在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中步驟(1)的具體步驟為：取genome-crisp^tmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產(chǎn)品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒中含有aavs1靶點兩側(cè)各800bp左右的同源臂；且兩同源臂之間包含帶有調(diào)控元件的人α1-抗胰蛋白酶基因(即表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因)、t2a連接的gfp基因和抗嘌呤霉素基因(即表達(dá)篩選標(biāo)記的基因)；對該質(zhì)粒進行如下改造：在上述質(zhì)粒的表達(dá)篩選標(biāo)記的基因兩側(cè)分別插入一個同向的loxp序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株的制備方法中，步驟(2)中靶向aavs1位點的crispr/cas9的載體的靶點序列如seqidno:3所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所用的靶向aavs1位點的crispr/cas9的載體為質(zhì)粒，更具體為genecopoeia公司的genome-crisp^tm質(zhì)粒。

在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟(3)中獲得所述篩選標(biāo)記陽性的細(xì)胞株所用的篩選方法具體為：先經(jīng)過嘌呤霉素篩選48小時，后經(jīng)過綠色熒光gfp篩選單細(xì)胞克隆，最后經(jīng)過接口pcr驗證基因定點整合在hek293細(xì)胞的19號染色體的aavs1位點，即得。

在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟三中獲得所述篩選標(biāo)記陰性的細(xì)胞株所用的篩選方法具體為：取所述篩選標(biāo)記陽性的細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染表達(dá)cre酶的質(zhì)粒，通過篩選gfp陰性細(xì)胞克隆，并經(jīng)過pcr驗證基因組中含有表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因并且不含gfp和抗嘌呤霉素基因，即獲得不含篩選標(biāo)記、穩(wěn)定表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株。

本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株的制備是通過crispr/cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合同源重組實現(xiàn)的。其中，crispr/cas9的靶序列在人的基因組aavs1位點，當(dāng)crispr/cas9質(zhì)粒和含所述表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因、表達(dá)篩選標(biāo)記的基因和所述aavs1位點的左、右同源臂的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞后，crispr/cas9系統(tǒng)在靶位點處剪切dna，形成雙鏈缺口；在存在含有同源臂的所述表達(dá)載體的情況下，雙鏈缺口以其為模板，進行同源重組修復(fù)，實現(xiàn)目的基因在靶點處的定點插入。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過嘌呤霉素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)過有限稀釋進行g(shù)fp陽性細(xì)胞單克隆篩選。篩選獲得的細(xì)胞單克隆經(jīng)過pcr檢驗，確定在靶位點處是否發(fā)生了基因重組，從而排除隨機整合克隆。之后通過表達(dá)cre酶的質(zhì)粒對篩選得到的細(xì)胞株進行再次轉(zhuǎn)染，篩選切除了篩選標(biāo)記的細(xì)胞單克隆，即獲得不含篩選標(biāo)記、穩(wěn)定表達(dá)α1-抗胰蛋白酶的細(xì)胞株。

如上所述構(gòu)建方法制備得到的重組人的體細(xì)胞在分泌表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶中的應(yīng)用。通過本發(fā)明的構(gòu)建方法制備的重組體細(xì)胞株中，人α1-抗胰蛋白酶基因定點插入到人19號染色體的aavs1位點，該細(xì)胞株能夠表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶，可用于制備重組人α1-抗胰蛋白酶。

更優(yōu)選地，一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組體細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)在genome-taler^tm貨號為dc-don-sh01的aavs1供體克隆載體的篩選標(biāo)記基因的兩側(cè)分別插入一個loxp序列，且這兩個loxp序列的方向一致，得到改造的表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組質(zhì)粒，loxp序列如seqidno:4所示；

(2)將步驟(1)改造的重組質(zhì)粒和靶向aavs1位點的crispr/cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的體細(xì)胞，篩選獲得定點整合的體細(xì)胞，靶向aavs1位點的crispr/cas9質(zhì)粒為genecopoeia公司的genome-crisp^tm質(zhì)粒；

(3)以表達(dá)cre酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟(2)獲得的定點整合的體細(xì)胞，通過cre/loxp系統(tǒng)切除篩選標(biāo)記，篩選獲得切除了篩選標(biāo)記且穩(wěn)定表達(dá)重組α1-抗胰蛋白酶的體細(xì)胞株。

優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞株分泌表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的方法為，培養(yǎng)所述重組細(xì)胞株至細(xì)胞密度為75％～95％，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20h～28h，收集上清液，即得。

在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供人α1-抗胰蛋白酶的方法，具體包括：將本發(fā)明提供的重組細(xì)胞株hek293置于適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)環(huán)境中，使所述細(xì)胞長至90％，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細(xì)胞上清，即得。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明通過crispr/cas9輔助的同源重組技術(shù)實現(xiàn)的人α1-抗胰蛋白酶基因在人的體細(xì)胞的基因組aavs1位點的定點重組，同時去除了篩選標(biāo)記，獲得切除了篩選標(biāo)記且穩(wěn)定表達(dá)重組α1-抗胰蛋白酶的體細(xì)胞。此方法可以使重組人α1-抗胰蛋白酶組成型表達(dá)，避免了基因表達(dá)衰減、沉默等現(xiàn)象。以人的體細(xì)胞，尤其是hek293細(xì)胞為宿主，表達(dá)的重組α1-抗胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能更類似于天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利于人α1-抗胰蛋白酶制劑的推廣和應(yīng)用。

附圖說明

圖1為帶有靶點同源臂的表達(dá)質(zhì)粒載體改造前后示意圖，其中圖1-a為改造前質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，圖1-b為改造后的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。

圖2為改造后載體酶切驗證圖。

圖3為crispr/cas9切靶點形成雙鏈缺口后，同源重組修復(fù)介導(dǎo)的基因插入原理示意圖。

圖4為接口pcr檢測示意圖；其中，5’接口pcr產(chǎn)物長度為1.1kb；3’接口pcr產(chǎn)物長度為1.2kb。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細(xì)闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

人α1-抗胰蛋白酶基因全長1257bp，編碼418個氨基酸，所述人α1-抗胰蛋白酶具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；其基因具有如seqidno:2所示的核苷酸序列。

實施例1

一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組hek293細(xì)胞株，具體構(gòu)建方法如下。

一、載體改造：含有aavs1靶位點左右同源臂、篩選標(biāo)記基因、人α1-抗胰蛋白酶基因的質(zhì)粒有很多商業(yè)化的品種，本實施例使用genome-crisp^tmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產(chǎn)品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒。該表達(dá)質(zhì)粒上帶有aavs1靶點兩側(cè)的同源臂，左同源臂長度782bp，為緊鄰靶點左側(cè)的序列。右同源臂長度819bp，為緊鄰靶點右側(cè)的序列，同時質(zhì)粒上還帶有表達(dá)篩選標(biāo)記的基因，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖1-a所示。

通過酶切連接技術(shù)，在表達(dá)載體的表達(dá)篩選標(biāo)記的基因的兩側(cè)分別插入一個loxp序列，且保證兩個loxp序列方向一致，改造后的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖1-b所示。具體步驟如下：

1.將產(chǎn)品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒用bglii和asisi雙酶切，回收約10k的片段作為線性載體。

2.設(shè)計退火雜交引物loxp1-f/r。序列如下：

loxp1-f:gatctataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgcggccgcaaggatctgcgat

loxp1-r:cgcagatccttgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttata

兩條引物雜交后與步驟1的線性化載體連接、轉(zhuǎn)化，然后菌液pcr篩選。篩選引物為loxp1-seqf/loxp1-r，擴增出來176bp為陽性克隆，并送測(其中，測序引物loxp1-seqf:catcgcattgtctgagtagg)，得到構(gòu)建好的中間質(zhì)粒，標(biāo)記為ha-aat-loxp1，至此，引入5’loxp序列。

3.以構(gòu)建好的中間質(zhì)粒ha-aat-loxp1為載體，用sacii-hpai酶切。用loxp2-f/r為引物擴增原始載體ha-aat為片段，大小為571bp。引物序列如下：

loxp2-f：gtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagc

loxp2-r：

ataagctgcaataaacaagttaacataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattgatacaaaggcattaaagc

將這個片段與經(jīng)sacii和hpai酶切后的ha-aat-loxp1線性化載體按照5:1摩爾比連接、轉(zhuǎn)化后進行菌液pcr篩選。所用篩選引物為：loxp2-seqf1/seqr1：

loxp2-seqf1:tcgccgccgcgttcgccgac

loxp2-seqr1:catttgagtcaattccagac

選擇陽性克隆，并測序(其中，測序引物loxp2-seqr1:catttgagtcaattccagac)，得到構(gòu)建好的質(zhì)粒，至此引入3’loxp序列，得到最終構(gòu)建載體ha-aat-loxp2，即改造后的含表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因、表達(dá)篩選標(biāo)記的基因和aavs1位點的左、右同源臂的表達(dá)質(zhì)粒，ha-aat-loxp2質(zhì)粒的左右同源臂之間的序列如seqidno：5所示。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：所述靶向aavs1位點的crispr/cas9質(zhì)粒為genome-crisp^tmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產(chǎn)品hcp-aavs1-cg02，靶點序列g(shù)gggccactagggacaggat。

將hek293細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)(相應(yīng)的條件為：含gibico胎牛血清10％的dmem培養(yǎng)基，37℃，5％的co2，培養(yǎng)24小時左右)，待細(xì)胞生長至80％左右，進行轉(zhuǎn)染。按照下述步驟操作：

1、crispr/cas9質(zhì)粒和改造后的含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達(dá)質(zhì)粒共2微克以1:1的摩爾比混勻后，與250微升opti-mem無血清培養(yǎng)基混勻，并靜置5分鐘。同時，取10微升lipo2000轉(zhuǎn)染試劑與等量的250微升opti-mem無血清培養(yǎng)基混勻，靜置5分鐘。

2、5分鐘后，將這兩個混合液充分混勻，靜置20分鐘。

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染前用pbs清洗一次，將上述混合液均勻滴加到待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面。

4、6小時后，加500微升含40％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

5、轉(zhuǎn)染后24小時，進行傳代培養(yǎng)。

6、培養(yǎng)基中加入2μg/ml的嘌呤霉素篩選48h，獲得嘌呤霉素陽性的細(xì)胞株。

7、有限稀釋法進行g(shù)fp陽性細(xì)胞單克隆篩選。

crispr/cas9質(zhì)粒進入細(xì)胞，編碼的cas9核酸酶在引導(dǎo)rna的指引下，結(jié)合在靶點序列上，并特異切割染色體靶點位置形成雙鏈斷裂缺口。dna雙鏈斷裂缺口引發(fā)細(xì)胞的dna修復(fù)程序。在存在含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達(dá)質(zhì)粒的情況下，同源臂與染色體上的同源序列通過堿基互補配對形成雜合鏈，并以含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達(dá)質(zhì)粒為模板，對缺口進行修復(fù)，從而將人α1-抗胰蛋白酶基因整合到缺口位置。

圖2示crispr/cas9切靶點形成雙鏈缺口后，同源重組修復(fù)介導(dǎo)的基因插入原理示意圖。

三、按常規(guī)操作對所得細(xì)胞株分別進行接口pcr和westernblot鑒定。

接口pcr鑒定：靶向aavs1的crispr/cas9結(jié)合同源重組介導(dǎo)表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的基因在人19號染色體的aavs1位點定點整合，故分別用5’末端接口pcr引物(f：ccggaactctgccctctaac；r：cccgtgagtcaaaccgctat)和3’末端接口pcr引物(f：agctcatctggtctcccttcc；r：tcctgggataccccgaagag)進行擴增，以確定基因的整合。具體方法為：提取細(xì)胞dna為模板，稀釋至200ng/μl。maxdnapolymerase(takara)5μl，模板1μl，2微摩爾的引物各1μl，加水補足10μl體系。采用兩步法pcr擴增：98℃預(yù)變性20s，55℃退火15s，72℃延伸20s，30個循環(huán)。

westernblot鑒定：將重組細(xì)胞株培養(yǎng)于75cm²細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞長至80％，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，進行sds-page電泳。用abcam的兔抗人α1-抗胰蛋白酶多抗作為一抗，羊抗兔igg作為二抗進行westernblot檢測。

選擇篩選結(jié)果為陽性的細(xì)胞克隆，即接口pcr兩端均為陽性，且westernblot檢測顯示有條帶的細(xì)胞克隆。圖3示接口pcr檢測示意圖；其中，5’接口pcr產(chǎn)物長度為1.1kb；3’接口pcr產(chǎn)物長度為1.2kb。

四、對上述的細(xì)胞克隆進行二次轉(zhuǎn)染：將篩選結(jié)果為陽性的細(xì)胞克隆接種于六孔板中(相應(yīng)的條件可以為：含gibico胎牛血清10％的dmem培養(yǎng)基，37℃，5％的co2，培養(yǎng)24h左右)，待細(xì)胞生長至80％左右，進行轉(zhuǎn)染。可根據(jù)下述步驟操作：

1、將cre酶質(zhì)粒2μg，與250μl的opti-mem無血清培養(yǎng)基混勻，并靜置5min。同時，取10μl的lipo2000轉(zhuǎn)染試劑與等量的250μl的opti-mem無血清培養(yǎng)基混勻，靜置5min。

2、5分鐘后，將二混合液充分混勻，靜置20分鐘。

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染前用pbs清洗一次，將上述混合液均勻滴加到細(xì)胞表面。

4、6小時后，加500微升含40％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

5、轉(zhuǎn)染后24小時，進行傳代培養(yǎng)。

6、有限稀釋法進行單克隆篩選，獲得gfp陰性細(xì)胞單克隆。

7、提取gfp陰性細(xì)胞單克隆基因組dna，pcr檢測，篩選無gfp(引物gfp-f：ggctacggcttctaccacttcg；gfp-r：gtgttgctgtgcagctcctcc；產(chǎn)物443bp)、無嘌呤霉素(引物puro-f:atgaccgagtacaagcccacgg；puro-r:cgggtcgactctagaggatcc；產(chǎn)物600bp)基因條帶的細(xì)胞克隆，即獲得不含篩選標(biāo)記、穩(wěn)定表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株。

五、酶活性檢測：將重組細(xì)胞株培養(yǎng)于75cm²細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞長至80％，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，進行α1-抗胰蛋白酶酶活檢測。

具體方法為：以sigma的α1-抗胰蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品進行梯度稀釋，并與過量的彈性蛋白酶孵育20分鐘，檢測剩余活性彈性蛋白酶的量(通過化學(xué)發(fā)光檢測405納米吸光度，反應(yīng)彈性蛋白酶底物suc-ala-ala-ala-pna(sigma)的分解底物含量)。以所得結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測培養(yǎng)上清中人α1-抗胰蛋白酶活性含量為0.4g/l。

sequencelisting

<110>深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司

<120>一種表達(dá)人α1-抗胰蛋白酶的重組細(xì)胞株及其應(yīng)用

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cysleuvalprovalserleualagluaspproglnglyaspalaala

202530

glnlysthraspthrserhishisaspglnasphisprothrpheasn

354045

lysilethrproasnleualagluphealapheserleutyrarggln

505560

leualahisglnserasnserthrasnilephepheserprovalser

65707580

ilealathralaphealametleuserleuglythrlysalaaspthr

859095

hisaspgluileleugluglyleuasnpheasnleuthrgluilepro

100105110

glualaglnilehisgluglypheglngluleuleuargthrleuasn

115120125

glnproaspserglnleuglnleuthrthrglyasnglyleupheleu

130135140

sergluglyleulysleuvalasplyspheleugluaspvallyslys

145150155160

leutyrhisserglualaphethrvalasnpheglyaspthrgluglu

165170175

alalyslysglnileasnasptyrvalglulysglythrglnglylys

180185190

ilevalaspleuvallysgluleuaspargaspthrvalphealaleu

195200205

valasntyrilephephelysglylystrpgluargprophegluval

210215220

lysaspthrgluglugluaspphehisvalaspglnvalthrthrval

225230235240

lysvalprometmetlysargleuglymetpheasnileglnhiscys

245250255

lyslysleusersertrpvalleuleumetlystyrleuglyasnala

260265270

thralailephepheleuproaspgluglylysleuglnhisleuglu

275280285

asngluleuthrhisaspileilethrlyspheleugluasngluasp

290295300

argargseralaserleuhisleuprolysleuserilethrglythr

305310315320

tyraspleulysservalleuglyglnleuglyilethrlysvalphe

325330335

serasnglyalaaspleuserglyvalthrgluglualaproleulys

340345350

leuserlysalavalhislysalavalleuthrileaspglulysgly

355360365

thrglualaalaglyalametpheleuglualaileprometserile

370375380

proprogluvallyspheasnlysprophevalpheleumetileglu

385390395400

glnasnthrlysserproleuphemetglylysvalvalasnprothr

405410415

glnlys

<210>2

<211>1257

<212>dna

<213>人α1-抗胰蛋白酶基因序列

<400>2

atgccgtcttctgtctcgtggggcatcctcctgctggcaggcctgtgctgcctggtccct60

gtctccctggctgaggatccccagggagatgctgcccagaagacagatacatcccaccat120

gatcaggatcacccaaccttcaacaagatcacccccaacctggctgagttcgccttcagc180

ctataccgccagctggcacaccagtccaacagcaccaatatcttcttctccccagtgagc240

atcgctacagcctttgcaatgctctccctggggaccaaggctgacactcacgatgaaatc300

ctggagggcctgaatttcaacctcacggagattccggaggctcagatccatgaaggcttc360

caggaactcctccgtaccctcaaccagccagacagccagctccagctgaccaccggcaat420

ggcttgttcctcagcgagggcctgaagctagtggataagtttttggaggatgttaaaaag480

ttgtaccactcagaagccttcactgtcaacttcggggacaccgaagaggccaagaaacag540

atcaacgattacgtggagaagggtactcaagggaaaattgtggatttggtcaaggagctt600

gacagagacacagtttttgctctggtgaattacatcttctttaaaggcaaatgggagaga660

ccctttgaagtcaaggacaccgaggaagaggacttccacgtggaccaggtgaccaccgtg720

aaggtgcctatgatgaagcgtttaggcatgtttaacatccagcactgtaagaagctgtcc780

agctgggtgctgctgatgaaatacctgggcaatgccaccgccatcttcttcctgcctgat840

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gaaaatgaagacagaaggtctgccagcttacatttacccaaactgtccattactggaacc960

tatgatctgaagagcgtcctgggtcaactgggcatcactaaggtcttcagcaatggggct1020

gacctctccggggtcacagaggaggcacccctgaagctctccaaggccgtgcataaggct1080

gtgctgaccatcgacgagaaagggactgaagctgctggggccatgtttttagaggccata1140

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caaaataccaagtctcccctcttcatgggaaaagtggtgaatcccacccaaaaataa1257

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>靶點序列

<400>3

ggggccactagggacaggat20

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>lox-p序列

<400>43

ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat34

<210>5

<211>6622

<212>dna

<213>左右同源臂之間的序列

<400>5

tgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacactt60

acatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaa120

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caaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgccc240

ggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggaca300

gcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctt360

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tgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggccca540

gatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctc600

tctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcacc660

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cctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctgggg780

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taatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggcacgc1260

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ttatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagt1380

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aagtttgtacaaaaaagcaggcttggaaggagttcgaaccatgccgtcttctgtctcgtg1740

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caacaagatcacccccaacctggctgagttcgccttcagcctataccgccagctggcaca1920

ccagtccaacagcaccaatatcttcttctccccagtgagcatcgctacagcctttgcaat1980

gctctccctggggaccaaggctgacactcacgatgaaatcctggagggcctgaatttcaa2040

cctcacggagattccggaggctcagatccatgaaggcttccaggaactcctccgtaccct2100

caaccagccagacagccagctccagctgaccaccggcaatggcttgttcctcagcgaggg2160

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ggatgcggtgggctctatggagatctataacttcgtatagcatacattatacgaagttat3300

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gccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccct3600

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cttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctg3840

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ggagagggcacccccaagcagggccgcatgaccaacaagatgaagagcaccaaaggcgcc4020

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aacacccgcatcgagaagtacgaggacggcggcgtgctgcacgtgagcttcagctaccgc4200

tacgaggccggccgcgtgatcggcgacttcaaggtggtgggcaccggcttccccgaggac4260

agcgtgatcttcaccgacaagatcatccgcagcaacgccaccgtggagcacctgcacccc4320

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cgcgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatg4680

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accctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgc4800

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gtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcc4980

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gtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaaat5280

caacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctcct5340

tttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcaataacttcgtatagcatac5400

attatacgaagttatgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaat5460

agcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtcc5520

aaactcatcaatgtatcttatcatgtctggaattgactcaaatgatgtcaattagtctat5580

cagaagctcatctggtctcccttccgggggacaagacatccctgtttaatatttaaacag5640

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tgactggattccttttttagggcccattggtatggtgtacactactagggacaggattgg5820

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ccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccat5940

ctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctggga6000

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aaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtc6240

cccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccag6300

ccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtg6360

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ccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagag6480

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tctcctgccccttccctacagg6622