(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組醛酮還原酶突變體、載體、工程菌株及其應(yīng)用，還包含利用高效表達(dá)該醛酮還原酶突變體的重組大腸桿菌手性生物催化合成阿托伐他汀手性側(cè)鏈6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的方法。

(二)

背景技術(shù)：

心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，其致死率居各類(lèi)疾病之首。動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是心腦血管疾病的主要死因，其背后元兇是血脂異常，特別是血清總膽固醇異常升高。阿托伐他汀能競(jìng)爭(zhēng)性抑制肝臟內(nèi)膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶—3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶的活性，降低內(nèi)源性膽固醇的合成，是治療高膽固醇血癥和混合型高脂血癥的有效藥物，具有起效快、降脂能力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是全球首個(gè)年銷(xiāo)售額超過(guò)百億美元的重磅炸彈藥。

6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯是阿托伐他汀合成的重要手性中間體，也是其藥效基團(tuán)。由于各國(guó)藥監(jiān)部門(mén)對(duì)藥物手性純度設(shè)置嚴(yán)苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的合成技術(shù)成為阿托伐他汀合成的關(guān)鍵核心技術(shù)。傳統(tǒng)的6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯化學(xué)法生產(chǎn)通常采用硼烷衍生物在-70℃不對(duì)稱(chēng)加氫還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯。這一技術(shù)方法存在諸多缺陷，首先，產(chǎn)物光學(xué)純度低，僅能達(dá)到98％，其次，硼烷化合物易燃；再次，反應(yīng)需要深冷條件，能耗較高。與化學(xué)合成法相比，生物催化的不對(duì)稱(chēng)合成具有選擇性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，代表了綠色合成技術(shù)的發(fā)展方向。開(kāi)發(fā)生物不對(duì)稱(chēng)還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯技術(shù)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種重組醛酮還原酶突變體，以及在催化6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯合成中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的重組醛酮還原酶突變體具有較高的立體選擇性和催化活力，催化過(guò)程對(duì)環(huán)境友好。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明涉及到一種重組醛酮還原酶突變體，所述突變體是將seqidno.1所示原始型醛酮還原酶氨基酸序列第297位的色氨酸突變?yōu)榻M氨酸(kmakr-w297h)的單位點(diǎn)突變體，或第296位的酪氨酸突變?yōu)樯彼崆业?97位的色氨酸突變?yōu)榻M氨酸(kmakr-y296w/w297h)的雙位點(diǎn)突變體。原始型醛酮還原酶氨基酸序列為seqidno.1所示，核苷酸序列為seqidno.2所示；重組醛酮還原酶單位點(diǎn)突變體氨基酸序列為seqidno.3所示，核苷酸序列為seqidno.4；重組醛酮還原酶雙位點(diǎn)突變體氨基酸序列為seqidno.5所示，核苷酸序列為seqidno.6。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seqidno.3和seqidno.5所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90％以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。

由于核苷酸序列的特殊性，任何seqidno.4和seqidno.6所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90％以上同源性，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的變位變異體或非生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)多核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的肽蛋白的功能。

本發(fā)明還涉及所述醛酮還原酶突變體編碼基因構(gòu)建的重組表達(dá)載體。本發(fā)明所述重組表達(dá)載體可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)得到，具體通過(guò)以下方法得到本發(fā)明的重組表達(dá)載體：以原始型醛酮還原酶基因的表達(dá)載體(pet28a(+)-kmakr)為模板，根據(jù)上游引物：5’-agattgtacnnkgttgatttctacaccaagtacaa-3’和下游引物：5’-gaaatcaacnnkgtacaatctaacaggttcatgtt-3’，全質(zhì)粒pcr擴(kuò)增得到原始型醛酮還原酶氨基酸序列297位飽和突變的重組表達(dá)載體，用dpni酶切后轉(zhuǎn)化至e.colijm109受體菌，進(jìn)行涂布后隨機(jī)挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得本發(fā)明的單位點(diǎn)突變體表達(dá)載體(pet28a(+)-kmakr-w297h)；隨后，以單位點(diǎn)突變體表達(dá)載體(pet28a(+)-kmakr-w297h)為模板，根據(jù)上游引物：5’-gttagattgnnkcatgttgatttctacaccaagta-3’和下游引物：5’-atcaacatgnnkcaatctaacaggttcatgttgta-3’，全質(zhì)粒pcr擴(kuò)增得到原始型醛酮還原酶氨基酸序列在297突變?yōu)榻M氨酸基礎(chǔ)上的296位飽和突變的重組表達(dá)載體，用dpni酶切后轉(zhuǎn)化至e.colijm109受體菌，進(jìn)行涂布后隨機(jī)挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得本發(fā)明的雙突變體表達(dá)載體(pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h)。

本發(fā)明涉及一種由所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌，通過(guò)將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿(mǎn)足表達(dá)載體可穩(wěn)定的自行復(fù)制，且所攜帶的醛酮還原酶突變體能被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選e.colibl21(de3)。將本發(fā)明重組表達(dá)載體pet28a(+)-kmakr-w297h和pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-w297h和e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h。

本發(fā)明涉及一種所述重組醛酮還原酶突變體在制備6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用如下：將含有重組醛酮還原酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心，以濕菌體為催化劑，以6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯底物，以葡萄糖為共底物，以采用常規(guī)方法構(gòu)建的含葡萄糖脫氫酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為輔酶再生酶，以ph值為5.0～9.0(優(yōu)選7.0)的100mm磷酸鈉緩沖液為介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，(先將催化劑與輔酶再生酶用反應(yīng)介質(zhì)重懸，超聲破碎，再加入底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯底物和共底物葡萄糖)，在25～55℃(優(yōu)選35℃)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。

進(jìn)一步，上述反應(yīng)體系：底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯初始濃度為10～100g/l(優(yōu)選75g/l)，共底物葡萄糖15～150g/l(優(yōu)選113g/l)，催化劑濕菌體用量10～100g/l(優(yōu)選75g/l)，輔酶再生酶用量10～100g/l(優(yōu)選25g/l)。

本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：

(1)斜面培養(yǎng)：將含有重組編碼醛酮還原酶突變體基因的重組基因工程菌接種至斜面培養(yǎng)基，在28～37℃培養(yǎng)12～24h，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，20g/l瓊脂，溶劑為水，ph值為7.0；

(2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至含終濃度50μg/ml卡那霉素(kan)的lysogeny-broth(lb)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～12h，獲得種子液；lb液體培養(yǎng)基終濃度組成：10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，溶劑為水，ph值7.0；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度2％的接種量將種子液接種至含有終濃度50μg/mlkan的lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37℃，180rpm培養(yǎng)至培養(yǎng)液的od600為0.6～0.8之間，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.1mm，28℃，180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，4℃、8000rpm離心10min，棄去上清液，收集濕菌體。

本發(fā)明還可以以濕菌體超聲破碎提取的純酶為催化劑，具體分離純化：將收集的濕菌體在ph7.0，100mm磷酸鈉緩沖液(100g/l，w/v)中重懸，進(jìn)行超聲波破碎(400w，30min)，取破碎后的上清液經(jīng)nickel-nta柱純化，上柱之前先用緩沖液(終濃度500mmnacl，溶劑為ph8.0、20mmnah2po4)進(jìn)行平衡；接著用洗脫緩沖液(終濃度500mmnacl、終濃度5mmimidazole，溶劑為ph8.0、20mmnah2po4)洗脫不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脫液(終濃度500mmnacl和終濃度500mmimidazole，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產(chǎn)生的流出液，獲得所述的酶。

本發(fā)明所述的含葡萄糖脫氫酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的制備方法：接種含葡萄糖脫氫酶基因的工程菌(優(yōu)選ecolibl21(de3)/pet28b-esgdh，genbankno.km817194.1)于50ml含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm培養(yǎng)10h得到種子液。以接種量4％(v/v)轉(zhuǎn)接到100ml含50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm培養(yǎng)至od600為0.8，加入終濃度9g/l的乳糖，在28℃、180rpm誘導(dǎo)9h。4℃、8000rpm離心10min，收集濕菌體細(xì)胞。

本發(fā)明所述野生型醛酮還原酶的重組表達(dá)載體由來(lái)自kluyveromycesmarxianus醛酮還原酶基因(genbankno.bap73216.1)插入到pet28a(+)構(gòu)建而成，并將其轉(zhuǎn)入到e.colibl21(de3)獲得e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明公開(kāi)的一條來(lái)自kluyveromycesmarxianus醛酮還原酶及其突變體，首次用于催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。其中，野生型k.marxianus醛酮還原酶對(duì)6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的立體選擇性中等(d.e.值僅僅80.5％)、活性一般。醛酮還原酶突變體w297h和y296w/w297h均對(duì)6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的立體選擇性和活性顯著提高，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％，產(chǎn)物達(dá)到光學(xué)純(d.e.值>99.5％)。

(四)附圖說(shuō)明

圖1野生型k.marxianus醛酮還原酶基因kmakr瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2野生型醛酮還原酶kmakr基因重組載體物理圖譜，其中a為pgem-t-easy-kmakr物理圖譜；b為pet28a(+)-kmakr物理圖譜。

圖3野生型kmakr及其突變體瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1為pet28a(+)-kmakr，泳道2為pet28a(+)-kmakr-w297h，泳道3為pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h。

圖4重組醛酮還原酶突變體的sds-page圖，m：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子；1：未誘導(dǎo)醛酮還原酶突變體工程菌細(xì)胞破碎液；2：iptg誘導(dǎo)醛酮還原酶突變體工程菌細(xì)胞破碎液上清；3：純化后重組醛酮還原酶突變體；4：純化后的原始型醛酮還原酶。

圖5野生型醛酮還原酶及其突變體與葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)不對(duì)稱(chēng)還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯生成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1:野生型醛酮還原酶kmakr基因克隆及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)目的基因的克隆

以kluyveromycesmarxianus(cicc32920)基因組dna為模板，通過(guò)上游引物：5’-ccatggccatgacaaaccaaaagttctttactt-3’，下游引物：5’-gcggccgctcacttctgggattcagaat-3’進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。取10μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物用0.9％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1所示，在1000bp左右出現(xiàn)條帶；

pcr反應(yīng)體系組成(總體積100μl)：10倍pfudna聚合酶緩沖液(含mg²⁺)10μl，10mmdntp混合物(datp、dctp、dgtp、dttp各2.5mm)0.5μl，濃度為50μm的克隆上游引物、下游引物各0.5μl，基因組dna1μl，pfudna聚合酶1μl，無(wú)核酸水86.5μl。采用bioradpcr儀，pcr反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃4min，然后進(jìn)入溫度循環(huán)94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，終止溫度為4℃。

(2)重組表達(dá)載體pet28a(+)-kmakr的構(gòu)建

將步驟(1)獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用axyprepdnagelextractionkit試劑盒回收，純化后的基因片段記為kmakr(核苷酸序列為seqidno.2所示，氨基酸序列為seqidno.1所示)，與pgem-teasyvector連接，得到重組克隆載體pgem-teasy-kmakr，如圖2中a。將重組克隆載體轉(zhuǎn)化至宿主e.colijm109中，利用含氨芐青霉素(amp，終濃度為50μg/ml)的lb平板篩選。分別用限制性?xún)?nèi)切酶ncoi和xhoi對(duì)制備的重組克隆載體pgem-teasy-kmakr進(jìn)行雙酶切，然后分別與經(jīng)相同限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切反應(yīng)形成的互補(bǔ)的粘性末端的表達(dá)載體pet28a(+)用t4dna連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pet28a(+)-kmakr，如圖2中b。將構(gòu)建的表達(dá)載體pet28a(+)-kmakr轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)中，涂布含終濃度50μg/ml卡那霉素(kan)的lb抗性平板上篩選，獲得e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr。

實(shí)施例2醛酮還原酶突變體kmakr-w297h重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以實(shí)施例1中構(gòu)建的pet28a(+)-kmakr為基礎(chǔ)，為提高原始型醛酮還原酶的立體選擇性和對(duì)底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的活性，對(duì)其進(jìn)行兩輪點(diǎn)飽和突變。第一輪突變，以pet28a(+)-kmakr的基因序列為模板，w297-f和w297-r為上下游引物(表1)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr反應(yīng)參數(shù)為：95℃4min；95℃15s，55℃15s，72℃7min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min)。將擴(kuò)增后回收的pcr產(chǎn)物用dpni酶切3h，應(yīng)用純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化至至e.colijm109受體菌，涂布于含終濃度50μg/mlkan的lb固體平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，平板上長(zhǎng)出許多白色菌落。隨機(jī)挑取白色克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后對(duì)突變后的陽(yáng)性菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中表達(dá)，獲得含有單突變基因(該核苷酸序列如seqidno：4所示)重組表達(dá)載體的e.colibl21(de3)，即e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-w297h。

第二輪突變，以pet28a(+)-kmakr-w297h為模板，y296/w297h-f和y296/w297h-r為上下游引物(如表1)，按照第一輪相同的操作方法，獲得含有雙位點(diǎn)突變基因(該核苷酸序列如seqidno：6所示)重組表達(dá)載體的e.colibl21(de3)，即e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h。

表1醛酮還原酶的突變引物

實(shí)施例3野生型醛酮還原酶kmakr和重組醛酮還原酶突變體kmakr-w297h、kmakr-y296w/w297h純化

依據(jù)在實(shí)施例1和2的方法，得到含有原始基因表達(dá)載體的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr和單位點(diǎn)突變體基因表達(dá)載體的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-w297h、雙位點(diǎn)突變基因表達(dá)載體的e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：將e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr、e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-w297h和e.colibl21(de3)/pet28a(+)-kmakr-y296w/w297h，分別接種至含終濃度50μg/mlkan的lysogeny-broth(lb)液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)10-12h，隨即以體積濃度2％的接種量接種至含有終濃度50μg/mlkan的lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃，180rpm培養(yǎng)至培養(yǎng)液的od600為0.6～0.8之間，加入終濃度為0.1mmiptg，28℃，180rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，4℃、8000rpm離心10min，分別收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的濕菌體。

(2)ni柱分離純化：將收集的濕菌體在ph7.0，100mm磷酸鈉緩沖液(100g/l(w/v))中重懸，進(jìn)行超聲波破碎(400w，30min)，4℃、8000rpm離心10min，取10ml的上清液作為粗酶液，進(jìn)行鎳-nta柱純化，上柱之前先用緩沖液(終濃度500mmnacl，溶劑為ph8.0、20mmnah2po4)進(jìn)行平衡；接著用洗脫緩沖液(終濃度500mmnacl、終濃度5mm咪唑，溶劑為20mmnah2po4(ph8.0)洗脫不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脫液(終濃度500mmnacl和終濃度500mm咪唑，溶劑為20mmph8.0、nah2po4洗脫目標(biāo)蛋白，收集蛋白洗脫液洗脫產(chǎn)生的流出液，分別獲得野生型醛酮還原酶kmakr純酶液、重組醛酮還原酶單位點(diǎn)突變體kmakr-w297h純酶液和重組醛酮還原酶雙位點(diǎn)突變體kmakr-y296w/w297h的純酶液，4℃下在ph7.0，nah2po4緩沖液中透析過(guò)夜，用sds-page凝膠電泳對(duì)其表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證(見(jiàn)圖2)。

實(shí)施例4野生型醛酮還原酶kmakr和重組醛酮還原酶突變體的比酶活和立體選擇性測(cè)定

利用酶標(biāo)儀測(cè)定純酶液的活力，方法如下：總反應(yīng)體系為200μl，分別加入終濃度0.25mmnapdh，終濃度5mm6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，以ph7.0、100mm磷酸鈉緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，35℃保溫5min，加入100μl實(shí)施例3中透析后純酶液，檢測(cè)340nm處吸光值的變化。酶活力定義為：在35℃條件下，每分鐘消耗1μmolnadph所需的酶量為一個(gè)活力單位(1u)?；盍y(cè)定均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值為最后結(jié)果。測(cè)定結(jié)果示于表2。

分別將實(shí)施例3中獲得的純酶液為催化劑，以6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。轉(zhuǎn)化體系(在1.5mlep管中進(jìn)行)組成及轉(zhuǎn)化操作如下：終濃度44mm6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、終濃度44mmnadph和5u的純酶液，后用ph7.0，100mm磷酸鈉緩沖液補(bǔ)加到1.0ml。35℃水浴搖床150rpm條件下反應(yīng)2h，加入10μl6mhcl終止反應(yīng)，12000rpm、離心10min，收集上清液檢測(cè)6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的濃度及其d.e.值。

采用液相色譜檢測(cè)生成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的d.e.值。檢測(cè)條件：ods-2c18柱(4.6×250mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈：水＝1:3(v/v)，柱溫40℃，流速1ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μl。6-氰基-(3s,5r)-二羥基己酸叔丁酯、6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯、6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯保留時(shí)間分別為7.4min、8.1min、12.5min。d.e.值測(cè)定均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取其平均值為最后結(jié)果。測(cè)定結(jié)果示于表2。

相比于野生型kmakr，最優(yōu)單位點(diǎn)突變體kmakr-w297h比酶活提高了2.8倍，產(chǎn)物6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯d.e.值從80.5％提高到了99.5％以上，立體選擇性顯著提升。最優(yōu)雙位點(diǎn)突變體kmakr-y296w/w297h比酶活則提高了11.1倍，產(chǎn)物光學(xué)純。

表2：野生型醛酮還原酶及其突變體酶活及立體選擇性比較

實(shí)施例5野生型醛酮還原酶kmakr及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

將實(shí)施例3制備的野生型醛酮還原酶kmakr純酶液及重組醛酮還原酶突變體kmakr-w297h和kmakr-y296w/w297h純酶液在35℃溫浴5min，獲得預(yù)處理的酶液?？偡磻?yīng)體系為200μl，固定6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯終濃度3.0mm、4.0mm、5.0mm、7.5mm、10.0mm時(shí)，分別加入終濃度0.125mm、0.25mm、0.375mm、0.5mm、0.6mm的napdh，以ph7.0、100.0mmol/l磷酸鈉緩沖鹽為反應(yīng)介質(zhì)，加入100μl純酶液，檢測(cè)340nm處吸光值的變化，從而得到酶催化反應(yīng)的初始速度。

野生型醛酮還原酶純酶及重組醛酮還原酶突變體純酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)vmax和km通過(guò)公式計(jì)算得到，其中[a]是nadph的濃度，[b]是6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的濃度，km^a和km^b分別為nadph和6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的米氏常數(shù)。通過(guò)origin8.0軟件進(jìn)行雙倒數(shù)曲線(xiàn)計(jì)算出原始型醛酮還原酶純酶及重組醛酮還原酶突變體動(dòng)力學(xué)常數(shù)vmax、km^a和km^b，如表3所示。分析結(jié)果表明，突變體相比野生型的催化效率kcat有大幅度提高，底物親和常數(shù)km^b則有少量降低，說(shuō)明酶活提高與前兩者都相關(guān)。

表3：原始型醛酮還原酶及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)施例6野生型醛酮還原酶kmakr及其突變體不對(duì)稱(chēng)還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的應(yīng)用

葡萄糖脫氫酶濕菌體的制備：所述e.colibl21(de3)/pet28b-esgdh由來(lái)自exiguobacteriumsibiriumdsm17290葡萄糖脫氫酶基因(genbankno.km817194.1)插入到pet28b構(gòu)建重組表達(dá)載體，并將此表達(dá)載體轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)制得。接種ecolibl21(de3)/pet28b-esgdh于50ml含50mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm培養(yǎng)10h得到種子液。以4％體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到100ml含50mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、180rpm培養(yǎng)至od600為0.8，加入終濃度9g/l的乳糖，在28℃、180rpm誘導(dǎo)9h。4℃、8000rpm離心10min，收集濕菌體細(xì)胞。

分別將實(shí)施例3中收集到的野生型kmakr濕菌體2.25g、單位點(diǎn)突變體kmakr-w297h濕菌體2.25g和雙位點(diǎn)突變體kmakr-y296w/w297h濕菌體2.25g與葡萄糖脫氫酶濕菌體0.75g混合，用體積為30ml的ph7.0，100mm磷酸緩沖液重懸，并按實(shí)施例4超聲破碎，用得到的破碎液催化6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱(chēng)合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。反應(yīng)體系(30ml)由30ml上述破碎液，不同終濃度(10g/l、50g/l、75g/l)的6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯和相應(yīng)1.5倍質(zhì)量濃度葡萄糖組成，在溫度35℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速300rpm下進(jìn)行，并用1mna2co3流加保持反應(yīng)體系ph為7.0。按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行液相檢測(cè)，底物轉(zhuǎn)化率與產(chǎn)物d.e.值示于表4示。相比于野生型kmakr，雙位點(diǎn)突變體kmakr-y296w/w297h能完全轉(zhuǎn)化的底物濃度極大的提高，達(dá)到75g/l，產(chǎn)物的d.e.大于99.5％。

表4野生kmakr及其突變體不對(duì)稱(chēng)還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>一種重組醛酮還原酶突變體、基因、載體、工程菌及其應(yīng)用

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