本申請是分案申請，其原申請的國際申請?zhí)枮閜ct/ep2009/054329，中國國家申請?zhí)枮?00980121472.x，申請日為2009年4月9日，發(fā)明名稱為“核酸的制備”。本發(fā)明涉及一種逆轉錄酶和編碼其的多核苷酸，具體而言，編碼靶蛋白的核酸的制備方法和由此能夠獲得的靶蛋白，所述靶蛋白包括諸如核酸加工酶等酶，特別是逆轉錄酶。
背景技術：
：：蛋白進化是用于對來自大型文庫的蛋白進行選擇和定向進化的已知技術。選擇的基本原則是確保特定表型(蛋白)和編碼其的基因型之間存在聯(lián)系形式?？梢砸匀N不同的方式實現(xiàn)該表型-基因型聯(lián)系形式：·共價連接諸如mrna展示，和在一定程度上噬菌體展示、細菌展示、酵母展示等，·利用親和性相互作用的非共價連接。實例是核糖體展示、cis展示、質粒展示等，·區(qū)室化(compartmentalization)例如體外區(qū)室化(ivc)、區(qū)室化自我復制(csr)、簡單細菌篩選、高通量篩選等。如上述段落所指出，共價型表型-基因型連接的一個實例可以使用mrna展示而實現(xiàn)。根據(jù)roberts和szostak(1997)所述，mrna和其編碼的肽或蛋白之間的共價融合可以通過合成的mrna的體外翻譯來產生，所述mrna在其3'末端處攜帶嘌呤霉素，一種肽基受體抗生素。表型和基因型之間的非共價連接可以通過核糖體展示而實現(xiàn)。在核糖體展示中，使包括一種或多種編碼靶蛋白的rna在內的rna的陣列通過體外翻譯系統(tǒng)形成核糖體、mrna和與trna偶聯(lián)的蛋白的非共價三元復合物。三元復合物的這種陣列必須是穩(wěn)定的。因此，體外翻譯過程中形成的各三元復合物使用末端缺乏終止密碼子的mrna。所述三元復合物在低溫(4℃)和高濃度的鎂中(50mm)進一步得到穩(wěn)定。在穩(wěn)定的復合物中表型和基因型之間的連接得以保持。隨后進行選擇步驟，由此基于仍附著到三元復合物的蛋白的性質選擇靶蛋白。然后可以使所選擇的三元復合物解離，通過rt-pcr擴增與靶蛋白關連的mrna。通常，核糖體展示可成功地應用于肽(mattheakis等，1994；matsuura和pluckthun，2003)和蛋白(hanes和pluckthun，1997；he和taussig，1997；irving等，2001)的選擇，所述肽和蛋白與不同的靶結合。在某些情況下，可以使用核糖體展示來選擇酶促活性、使用自殺性抑制劑(amstutz等，2002)或活性位點配體(takahashi等，2002)進行蛋白的親和選擇。在體外區(qū)室化(ivc)中，通過對油包水乳液中的基因進行體外區(qū)室化而實現(xiàn)表型和基因型聯(lián)系形式。計算用于制備乳液的基因的數(shù)量，使得大多數(shù)水區(qū)室含有不超過一個基因。使區(qū)室化的基因轉錄和翻譯。然后評估所合成蛋白的活性。隨后基于蛋白活性進行的選擇，可以擴增編碼具有所需性質的活性蛋白的dna。大多數(shù)ivc應用中所用的水滴的尺寸為2μm～3μm，反應體積為～5飛升，并且相對于每1ml乳液，有～1010個油包水區(qū)室(50μl水相)。ivc選擇系統(tǒng)的首個成功實例基于靶特異性dna甲基化活性(tawfik和griffiths，1998)。將haeiii甲基轉移酶的基因區(qū)室化、轉錄和翻譯。在輔因子存在下，體外合成的甲基轉移酶能夠將其自身的dna甲基化。由于甲基化dna(反應產物)抗haeiii限制性內切核酸酶的消化，從107倍過量的其它dna分子中選出了編碼甲基轉移酶的基因。迄今為止已經設計和實現(xiàn)了更多改進的ivc。進行ivc選擇的最簡單方式是使用dna修飾酶，特別是dna甲基轉移酶(lee等，2002；cohen等，2004)。類似的實驗策略用于選擇限制性內切核酸酶foki的活性變體(doi等，2004)。對區(qū)室化的編碼活性限制性內切核酸酶的dna進行消化，并通過隨后導入生物素-dutp和與鏈親和素結合來選擇。對dna聚合酶的進化應用不同的ivc選擇策略(ghadessy等，2001；ghadessy等，2004；ong等，2006)。這種新的選擇方法基于編碼活性dna聚合酶的基因的‘區(qū)室化自我復制’(csr)。與其中目的蛋白原位表達的常用ivc相反，csr通過表達嗜熱性dna聚合酶的細菌細胞的區(qū)室化進行。對再懸浮于補充有引物和dntp的pcr緩沖液中的細胞進行乳化，產生尺寸為～15μm的區(qū)室。每個微小水滴充當分離的pcr區(qū)室。起始pcr變性步驟期間，使細菌細胞破碎，將所表達的嗜熱性dna聚合酶和其編碼基因釋放到反應混合物中，使自我復制得以進行，同時其它細菌蛋白由于高溫而變性。ivc的改進是使用水包油包水雙乳液?？梢詫Ρ挥蛯影鼑奈⑿∷斡胒acs以>104個變體每秒的速率進行分析和分選(bernath等，2004；mastrobattista等，2005)。還可以通過ivc對用于結合的蛋白進行選擇。油包水區(qū)室中表達的目的蛋白與編碼其的基因共價偶聯(lián)(bertschinger和neri，2004)或非共價偶聯(lián)(doi和yanagawa，1999；yonezawa等，2003；sepp和choo，2005)。已知的ivc的其它應用有包埋在區(qū)室中的微珠用作蛋白和基因偶聯(lián)的中間體。附著在微珠上的單基因在微小水滴中進行轉錄和翻譯。新合成的蛋白被捕獲到反應區(qū)室內的相同微珠上。將乳液破碎后，可以將分離的珠進一步用于親和選擇(sepp等，2002)。通常使用有機溶劑(己烷、醚、氯仿)破碎乳液，但這也會使得展示在所述珠上的某些酶的活性降低，限制了該技術的應用。為了選擇催化活性，可以對微珠簡單地進行洗滌，使其再懸浮于不同的反應緩沖液中，并通過第二乳化步驟再次進行區(qū)室化(griffiths和tawfik，2003)。然而有時剛性酶-珠-基因復合物(由于空間位阻和酶移動性限制)不能滿足基本的反應要求，并且所附著的酶的活性可能低于游離酶的活性。另外，由于必須使用許多其它成分(即，親和標簽、抗體和珠)，所述方法在技術上是復雜的。對ivc中所用乳液的組成進行設計，從而確保水區(qū)室的穩(wěn)定性和mrna體外轉錄以及隨后靶蛋白翻譯的有效性。體外進化具有許多待改進的目標。一些目的蛋白和酶是穩(wěn)健的勤奮工作者，并且在不同的緩沖液中，特別在ivc所用的反應混合物中具有足夠的活性。然而，存在許多復雜的酶，這些酶僅在經優(yōu)化的條件下或特定條件下才起作用。除此之外，體外進化的第一定律稱-“進化所要選擇的(youwillevolvewhatyouareselectingfor)”。這就是說，轉錄/翻譯反應混合物中進化和優(yōu)化的酶會在該特定混合物中良好地起作用，并且很有可能在其自身緩沖液中表現(xiàn)差的多。在某些情況下，酶工作條件與區(qū)室中用于蛋白表達的體外轉錄和翻譯混合物不相容。部分解決方案是用于將不同溶質運送到乳液區(qū)室中的納米微滴遞送系統(tǒng)(bernath等，2005)。使用微流控裝置可以完成使用油包水區(qū)室的甚至更為精密復雜的操作?？梢砸愿哌_10000個水性微滴每秒鐘的速率制備高度單分散的單乳液或雙乳液(thorsen等，2001；okushima等，2004)?？梢詫⑺a生的水區(qū)室運送到微流控通道(microfluidicchannel)中，使其融合、再分和分選(song等，2003；link等，2006)。但是區(qū)室中的全緩沖液交換仍然是個問題。逆轉錄酶是用于從mrna靶合成cdna的非常重要的商業(yè)化酶。為了改善逆轉錄酶的性質，已經進行了大量研究。然而迄今為止適合于逆轉錄酶體外進化的合適的工作選擇系統(tǒng)還是未知的。幾乎所有的改進和逆轉錄酶的突變體的選擇都是使用高通量篩選和合理設計而進行的。核糖體展示(rd)和體外區(qū)室化(ivc)都不能用于全活性逆轉錄酶的選擇。用于核糖體展示的三元復合物在進行逆轉錄選擇所需的較高溫度下通常是不穩(wěn)定的，并且因而會失去表型和基因型之間的連接。雖然使用合成的體外翻譯提取物wakopure可以產生用于核糖體展示的相對穩(wěn)定的三元復合物(matsuura等，2007)，但是固定在核糖體和mrna上的體外翻譯的逆轉錄酶在全長cdna的合成過程中會遭遇到明顯的空間位阻。還存在一種可能性，即固定的酶會反式以及順式方式起作用，這會同樣與蛋白進化策略不相容，原因在于不能保留表型-基因型連接。ivc通常使用dna作為遺傳材料。體外的mrna轉錄和靶蛋白翻譯在dna的存在下于空間上分離的經乳化水區(qū)室中進行。在體外進化逆轉錄酶的情況下，編碼dna序列的存在消除了選擇逆轉錄酶活性的主要先決條件-必須從頭合成cdna。換言之，更好的逆轉錄酶變體的選擇是基于酶從mrna合成其自身編碼cdna的能力。新合成的cdna必須通過pcr擴增，因此cdna應該是反應中dna的唯一來源。用于ivc選擇的dna會與cdna一起擴增，省略了基礎選擇方案。體外區(qū)室化的更復雜的變體方式，例如使用包埋在水區(qū)室中的微珠(sepp等，2002；griffiths和tawfik，2003)，使得反應緩沖液完全交換。在該方法中，利用微珠實現(xiàn)表型-基因型聯(lián)系，產生剛性選擇單元mrna-微珠-蛋白，在逆轉錄酶選擇的情況下，該剛性選擇單元mrna-微珠-蛋白同樣可以引起空間位阻，結果使得cdna的合成效率差。使用噬菌體展示技術的改進方法選擇能夠合成～300個核苷酸長的cdna的taqdna聚合酶(vichier-guerre等，2006)。雖然該方法起作用，但具有以下缺點：1)不是所有蛋白都可以在噬菌體上展示；2)絕對需要使用生物素標記的核苷酸以進行選擇；3)所展示的酶能夠以反式和順式方式起作用；4)由于空間位阻和酶移動性限制，噬菌體-酶-dna/rna復合物會干擾cdna的有效合成。wo0222869中也提到了對逆轉錄酶進行選擇的可能性，該申請涉及區(qū)室化自我復制(csr)法。csr技術用于選擇嗜熱性dna聚合酶，特別是taqdna聚合酶(ghadessy等，2001；ghadessy等，2004；ong等，2006)。將表達嗜熱性dna聚合酶的突變體文庫的細菌細胞懸浮于pcr混合物中并進行乳化，產生分離的用于體外選擇更具活性的聚合酶的pcr區(qū)室。細菌rna酶的存在會阻止逆轉錄酶活性的實時選擇，所述細菌rna酶在中等溫度下仍然有活性并會降解靶mrna。還存在來自未經選擇的質粒dna(釋放自細菌細胞)的dna污染，并且存在所有大腸桿菌酶、結構蛋白、核糖體、ntp、rna酶、dna酶和小分子量分子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供蛋白進化的改進方法，該方法不具有現(xiàn)有技術方法的缺點。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了編碼靶蛋白的核酸的產生方法，所述方法包括：(a)提供包括一種或多種編碼所述靶蛋白的rna或dna分子在內的rna或dna分子的陣列；(b)從所述陣列產生靶蛋白，從而形成rna-蛋白復合物或dna-蛋白復合物，其中所述rna或dna分子與所述復合物非共價或共價結合；(c)將所述復合物分隔到區(qū)室中，其中大多數(shù)或全部區(qū)室含有不超過一個復合物；(d)使所述復合物處于允許靶蛋白具有活性的反應條件下；和(e)基于與靶蛋白相關的活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸，其中當所述復合物是其中dna非共價結合的dna-蛋白復合物時，在不存在用于各復合物的分離的區(qū)室的情況下進行步驟b)。本發(fā)明人已經設計了一種方法，該方法使用兩種不同類型的表型-基因型聯(lián)系形式，并且獲得了用于實驗室內蛋白進化方法中使用的新型選擇系統(tǒng)。下文進一步描述的該方法的新特征使得其可以應用到與現(xiàn)有技術方法相比范圍更寬的靶蛋白上，使用更加簡單，適應性增加。特別是，本發(fā)明首次提出了進化和改進逆轉錄酶性質的可能性，所述逆轉錄酶是分子生物學家工具箱中最重要的酶類之一。在該方面的一個實施方式中，本發(fā)明提供了編碼靶蛋白的核酸的產生方法，所述方法包括：(a)提供包括一種或多種編碼所述靶蛋白的rna或dna分子在內的rna或dna分子的陣列；(b)從所述陣列產生靶蛋白，從而形成rna-蛋白復合物或dna-蛋白復合物，(c)將所述復合物分隔到區(qū)室中，其中大多數(shù)或全部區(qū)室含有不超過一個復合物；(d)使所述復合物處于允許靶蛋白具有活性的反應條件下；和(e)基于與靶蛋白相關的活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸，其中在所述rna-蛋白復合物中所述rna與其非共價結合或共價結合，在所述dna-蛋白復合物中所述dna與其共價結合。在該方面的第二實施方式中，本發(fā)明提供了編碼靶蛋白的核酸的產生方法，所述方法包括：(a)提供包括一種或多種編碼所述靶蛋白的rna或dna分子在內的rna或dna分子的陣列；(b)從所述陣列產生靶蛋白，從而形成rna-蛋白復合物或dna-蛋白復合物，其中所述rna或dna分子與所述復合物非共價或共價結合；(c)使所述復合物分隔到區(qū)室中，其中大多數(shù)或全部區(qū)室含有不超過一個復合物；(d)使所述復合物處于允許靶蛋白具有活性的反應條件下；和(e)基于與靶蛋白相關的活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸，其中在不存在用于各復合物的分離的區(qū)室的情況下進行步驟b)?？梢酝ㄟ^本領域已知的任何技術，例如mrna展示、噬菌體展示、細菌展示或酵母展示，產生dna或rna與靶蛋白之間的共價連接。具體而言，使用mrna展示技術可以產生共價rna-蛋白連接，而使用共價抗體展示(cad)技術可以產生共價dna-蛋白連接(reiersen等，2005)，通過共價dna展示(bertschinger和neri，2004)或使用類似的共價展示技術如stein等(2005)所述的技術進行區(qū)室內的翻譯。也可以通過本領域已知的任何技術，例如核糖體展示、cis展示或質粒展示產生dna或rna與靶蛋白之間的非共價連接。具體而言，使用cis展示在不存在區(qū)室時可以產生非共價dna-蛋白連接(odergrip等，2004)，而使用核糖體展示技術可以產生非共價rna-蛋白連接。如上指出，當所述復合物是其中dna為非共價結合的dna-蛋白復合物時，在不存在用于各復合物的分離的區(qū)室的情況下進行本發(fā)明方法中的步驟b)。換言之，步驟b)是非區(qū)室化的。具體而言，當產生的復合物是其中dna為非共價結合的dna-蛋白復合物時，無需將陣列的各成員彼此分隔即可進行產生步驟。特別是，無需通過體外區(qū)室化(ivc)將陣列的各成員分隔即可進行產生步驟。在特別優(yōu)選的實施方式中無需在油包水乳液中將陣列的各成員分隔即可進行產生步驟。還可以通過本領域已知的任何方法進行區(qū)室化，這些方法能夠使得所述復合物產生或分離從而使得所有或基本上所有的區(qū)室含有不超過一個復合物。特別是，優(yōu)選至少70％、至少80％或至少90％的區(qū)室含有不超過一個復合物。例如，可以通過將陣列的成員或各復合物分隔到位于微量滴定板或納米滴定板(nanotiterplate)上的不同的孔中，或通過體外區(qū)室化(ivc)進行區(qū)室化。具體而言，通過ivc進行的分隔可以包括分隔到油包水乳液或水包油包水乳液中的水性微滴中。本發(fā)明方法組合了選自以下所列中的至少兩種不同類型的基因型-表型聯(lián)系形式：共價連接、非共價連接和區(qū)室化。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述方法利用這些聯(lián)系形式中的至多兩種。因此在特別優(yōu)選的實施方式中所述方法利用共價連接或非共價連接作為步驟b)中的唯一表型-基因型聯(lián)系形式。換言之，在該實施方式中步驟b)中不存在區(qū)室化?？梢砸栽S多不同的方式，例如通過核糖體展示、mrna展示(roberts和szostak，1997)、cis展示(odergrip等，2004)或共價抗體展示(cad)(reiersen等，2005)在不存在區(qū)室時建立dna或rna與蛋白之間的共價/非共價連接。具體而言，通過使用cad技術可以在不存在區(qū)室時實現(xiàn)共價dna-蛋白連接，而通過mrna展示和核糖體展示分別可以建立共價rna-蛋白連接和非共價rna-蛋白連接?？梢酝ㄟ^許多不同聯(lián)系方式的組合實現(xiàn)本發(fā)明。例如，可以通過核糖體展示和體外區(qū)室化的組合，或通過mrna展示、cis展示或cad展示與ivc的組合實現(xiàn)本發(fā)明。在優(yōu)選方面，通過核糖體展示和體外區(qū)室化的組合實現(xiàn)編碼靶蛋白的核酸的產生方法。具體而言所述方法包括：(a)提供包括一種或多種編碼所述靶蛋白的mrna在內的mrna的陣列；(b)在用于核糖體翻譯的條件下對所述mrna的陣列進行溫育，從而產生三元復合物的陣列，每個三元復合物包含mrna、核糖體和由所述mrna翻譯的蛋白；(c)將三元復合物的陣列導入油包水或水包油包水乳液的水相微滴中，其中大多數(shù)或所有的水相微滴含有不超過一個三元復合物；(d)使所述水相微滴處于允許靶蛋白具有活性的反應條件下；和(e)基于與靶蛋白相關的酶活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸。本發(fā)明的這種方法可以稱為“區(qū)室化核糖體展示”(crd)。crd可應用于各種靶蛋白，包括酶。crd的優(yōu)點在于所述酶和mrna之間的聯(lián)系方式是非共價的。因此如果步驟(d)中所用的反應條件涉及增高的溫度，步驟(b)中產生的三元復合物會解離，并且會釋放所述酶。這避免了所述酶固定在珠上的現(xiàn)有技術中上述與酶移動性相關的問題。在步驟(e)中可以以許多方式對內部具有核糖體展示復合物的乳液微滴進行分選或選擇。優(yōu)選的是通過熒光激活細胞分選法(facs)或使用微流控技術對它們進行分選。兩種技術主要利用了基于熒光的微滴分選。然而，取決于步驟(d)中所用的反應條件和要選擇的蛋白活性，還可以通過尺寸、光衍射或光吸收對微滴進行分離。當所述靶蛋白是酶時優(yōu)選使用基于熒光的分選方法。在該實施方式中步驟(d)中所用的反應條件包括能夠轉化成熒光產物的非熒光底物。所述酶的活性產生熒光產物，使得可以使用facs來區(qū)分含有活性酶的熒光微滴和不含有活性酶或含有較弱活性酶的非熒光微滴或弱熒光微滴。尤其是，crd可應用于諸如逆轉錄酶等核酸加工酶，并使得可以進行快速有效的體外進化。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼靶蛋白的核酸的產生方法，所述方法包括：(a)提供包括一種或多種編碼所述靶蛋白的mrna在內的mrna的陣列，其中所述mrna包括酶的底物，所述酶包括靶蛋白或其輔酶；(b)在用于核糖體翻譯的條件下對所述mrna的陣列進行溫育，從而產生三元復合物的陣列，每個三元復合物包含mrna、核糖體和由所述mrna翻譯的蛋白；(c)將三元復合物的陣列和可選的輔酶導入油包水或水包油包水乳液的水相微滴中，其中大多數(shù)或所有的水相微滴含有不超過一個三元復合物；(d)使所述水相微滴處于允許靶蛋白具有活性的反應條件下；和(e)基于與靶蛋白相關的酶活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸。在本發(fā)明該方面的一種實施方式中，當所述核酸加工酶是dna依賴性dna聚合酶時，步驟(a)中的mrna可以連接到雙鏈dna銜接體(adaptor)分子，從而提供底物。crd多樣性為～109至1010個變體，并且受到ivc步驟限制。該新方法與能夠用于篩選～105至106個逆轉錄酶的突變體的高通量篩選(hts)相比，更加有效的多，耗時更少和更加廉價。crd多樣性比hts高約4個數(shù)量級，因此通過區(qū)室化核糖體展示選擇可以容易地尋找出被hts錯過的許多更有益的突變體。根據(jù)步驟(a)，提供通常是合成mrna的mrna的陣列，所述陣列包括編碼所述靶蛋白的一個或多個陣列成員。當靶蛋白是逆轉錄酶時，所述mrna包含酶的底物，所述酶包含靶蛋白或其輔酶。在隨后的選擇步驟(e)中，基于與靶蛋白相關的酶活性選擇編碼所述靶蛋白的核酸。這樣，涉及了本發(fā)明的兩個實施方式：一個實施方式中所述酶活性由靶蛋白提供，一個實施方式中在靶蛋白的存在下所述酶活性由所述靶蛋白的輔酶提供。在需要輔酶的實施方式中，與三元復合物的陣列一樣，將輔酶導入步驟(c)的油包水乳液的水相微滴中。當所述酶包括所述靶蛋白時，不必將另外的輔酶導入水相微滴中。在所述方法的步驟(b)中，用核糖體處理mrna的陣列以產生三元復合物的陣列，每個三元復合物包含mrna、核糖體和由mrna翻譯的蛋白?？梢栽谌魏芜m合于通常的mrna體外翻譯的條件下，例如于核糖體展示技術中所用的條件下進行該步驟。在這點上，可以對所述三元復合物進行純化，雖然這不是必須的。在這點上可以對所述三元復合物補充任何隨后酶活性所需的輔助底物(co-substrate)，然后通常將反應混合物乳化以獲得約1010個油包水區(qū)室，各區(qū)室的平均直徑通常為約2μm～3μm。即使是小體積(25μl)的體外翻譯反應也會產生約1011～1012個貯存核糖體復合物分子。通常的核糖體展示方法使用缺乏終止密碼子的mrna，雖然也可以存在終止密碼子(matsuura等，2007)。為了獲得其中大多數(shù)或所有水相微滴含有不超過一個三元復合物的水相微滴，三元復合物的濃度與通常的核糖體展示技術所用的相應濃度相比必須減少約兩個數(shù)量級。在所述方法的該步驟中僅使用非常低濃度的三元復合物。所述酶可以包括核酸加工酶，該核酸加工酶可以是rna加工酶。所述核酸加工酶可以包括靶蛋白，并且可以選自核酸聚合酶、核酸連接酶和末端脫氧核苷酸轉移酶。如本文進一步的詳述，所述核酸聚合酶可以包括逆轉錄酶。在該實施方式中，編碼逆轉錄酶的mrna自身是該逆轉錄酶的底物。選擇編碼靶蛋白的核酸的步驟(e)包括選擇通過逆轉錄酶的作用產生的cdna，所述cdna編碼逆轉錄酶。當靶蛋白是核酸連接酶時，可以對能夠連接rna和rna或連接dna和dna的rna(dna)連接酶進行選擇。優(yōu)選的是，允許酶具有活性的反應條件包含含有核酸連接子或銜接體的輔助底物，所述輔助底物還包括用于附著到配體結合伴侶的親和配體或用于rt-pcr中經加工的mrna的特異性擴增的序列標簽。在第一種情況下，編碼靶蛋白的mrna與在導入有編碼核酸連接酶的mrna的水相微滴中的輔助底物連接。優(yōu)選的是，所述親和配體包含生物素，并且所述配體結合伴侶包含鏈親和素。對編碼所述靶蛋白的核酸進行選擇的步驟包括通過附著到包含配體結合伴侶的固相而選擇引入所述輔助底物的mrna。在通常的方法中，將連接酶的突變體文庫進行體外翻譯，將純化的三元復合物稀釋并且在具有生物素標記的dna/rna連接子和/或銜接體的反應緩沖液中進行乳化。使乳液升溫到37℃后，核糖體三元復合物解體(disassemble)。連接酶將被釋放，并且mrna的3'末端將可接觸生物素標記的銜接體并用于隨后的連接反應。僅編碼連接酶的具有活性(或活性更高)的變體的生物素標記的mrna在鏈親和素珠上得到純化并可以通過rt-pcr進行擴增。在第二種情況下，選擇編碼靶蛋白的核酸的步驟包括選擇具有附著的序列特異性標簽的mrna，所述序列特異性標簽可用作用于逆轉錄和隨后的pcr的引物的選擇性退火位點。在通常的方法中，將連接酶的突變體文庫進行體外翻譯，并且將純化的三元復合物稀釋并且在具有dna/rna連接子和/或銜接體的反應緩沖液中進行乳化。將乳液升溫到37℃后，核糖體三元復合物解體。連接酶會被釋放，并且mrna的3'末端將可接觸所述銜接體并用于隨后的連接反應。僅編碼連接酶的具有活性(或活性更高)的變體的rna會具有在逆轉錄中所用引物的特異性退火所需的特異性連接子序列，并且可以通過rt-pcr進行有效地進行擴增。還可以對末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)進行選擇。該酶作用于rna并且可引入脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和核苷酸類似物等。在該實施方式中，允許酶具有活性的反應條件包括含有dntp的輔助底物，所述輔助底物還包括用于附著到配體結合伴侶的親和配體。與核酸連接酶一樣，所述親和配體可以是生物素，所述配體結合伴侶可以是鏈親和素。對編碼靶蛋白的核酸的選擇可以包括通過附著到包含配體結合伴侶的固相來選擇引入輔助底物的mrna?？梢詫dt的突變體文庫進行體外翻譯，并且需要將純化的核糖體三元復合物進行稀釋并且在具有生物素標記的核苷酸(例如生物素-dutp)的反應緩沖液中進行乳化。對于野生型酶最適的工作溫度是37℃。在該溫度下所述核糖體三元復合物會解體，并且mrna的3'末端將可用于模板非依賴性聚合反應。引入生物素標記的核苷酸的tdt-編碼mrna在鏈親和素珠上得到選擇，并且隨后可以進行逆轉錄和通過rt-pcr進行擴增。在另一個實施方式中，所述靶蛋白包括逆轉錄酶輔助酶(helperenzyme)，例如解旋酶、焦磷酸酶、持續(xù)因子(processivityfactor)、rna結合蛋白或其它在逆轉錄酶存在下能夠改善逆轉錄反應的蛋白。在該實施方式中，所述核酸加工酶包括逆轉錄酶，所述逆轉錄酶是導入油包水乳液的水相微滴中的輔酶。在選擇編碼靶蛋白的核酸的步驟(e)中，選擇通過逆轉錄酶的作用產生的并且編碼逆轉錄酶輔助酶的cdna。水相中逆轉錄酶輔助酶的存在促進了編碼所述輔助子的mrna的逆轉錄。因此，被逆轉錄的mrna形成編碼所述輔助子的cdna，并且可以被pcr擴增。在另一實施方式中，所述靶蛋白包括rna酶抑制劑。在該實施方式中，所述核酸加工酶包含rna酶。選擇編碼靶蛋白的核酸的步驟(e)包括選擇未被rna酶降解的mrna。在該實施方式中，將rna酶作為輔酶導入油包水乳液的水相微滴中。一旦反應條件允許酶具有活性，任何不含有有效rna酶抑制劑的微滴會顯示出rna酶活性，由此會將mrna降解。因此，編碼在所用的反應條件下有效的rna酶抑制劑的mrna會繼續(xù)存在。一般而言，對rna酶抑制劑的突變體文庫進行體外翻譯，并將純化的核糖體三元復合物稀釋并在具有合適rna酶的反應緩沖液中進行乳化。在替代性方案中，可以通過乳化微滴稍后遞送rna酶。對僅編碼具有活性(或更穩(wěn)定)的rna酶抑制劑的mrna進行純化和通過rt-pcr進行擴增。區(qū)室化核糖體展示還可用于體外區(qū)室化中的反應緩沖液交換，所述外區(qū)室化中選擇緩沖液與體外翻譯混合物不相容，并且底物到產物的轉化必須在嚴格受控的反應條件下進行。如本文討論，基于與靶蛋白相關的酶活性而選擇的編碼靶蛋白的核酸可以是dna或rna。可以對所述陣列進行轉化或擴增，從而形成dna或rna。在優(yōu)選的方案中，對所述陣列進行轉化或擴增，從而形成所述方法的步驟(a)中的mrna的陣列，并進行一個或多個另外的步驟(b)～(e)的循環(huán)，從而進一步富集具有更大量的編碼靶蛋白的mrna的陣列。使水相微滴處于允許酶具有活性的反應條件的步驟(d)為選擇步驟(e)提供了基礎，所述步驟(e)中選擇編碼靶蛋白的那些核酸。在步驟(d)中可以使用各種反應條件以提供選擇壓力。在一個實例中，反應條件包括在野生型酶的最適溫度之上的溫度。這些反應條件可以用于選擇比野生型酶具有更高熱穩(wěn)定性的突變酶或在該溫度下反應速率更高的突變酶或溫度-活性曲線發(fā)生改變的突變酶。突變酶可能需要以比野生型酶更高的敏感性運行，因為水相微滴中mrna的濃度是約400pm。突變酶還必須更精確地運行。所有這些選擇壓力對于逆轉錄酶特別重要。像生理條件一樣，反應條件可以包括緩沖液、諸如金屬離子等其它因子的濃度和ph的變化。在更好的逆轉錄酶的crd選擇中，可以施加許多更加不同的選擇壓力：1)選擇較不易于聚集的溶解度更高的酶—必須將三元復合物(乳化之前)與疏水性材料預溫育，從而消除具有表面暴露的疏水性殘基的蛋白；2)選擇非?？焖俚拿浮孓D錄反應時間在選擇循環(huán)期間需要逐漸減少；3)選擇合成長cdna的酶—逐漸延伸crd中使用的mrna文庫，結果合成更長的cdna；4)選擇能夠通過二級結構轉錄的酶—必須將二級結構形成序列導入到crd中使用的mrna文庫中；5)選擇在不同于rt緩沖液的緩沖液中起作用的酶(例如在pcr中，一步rt-pcr緩沖液或具有變性劑的緩沖液)—必須在我們選擇的緩沖液中進行crd選擇；6)選擇能夠導入核苷酸類似物的酶—必須在具有生物素標記的核苷酸類似物的rt緩沖液中進行選擇，并隨后在鏈親和素珠上進行cdna純化。區(qū)室化核糖體展示(crd)還適合于許多熒光激活細胞分選(facs)應用。必須以核糖體展示形式展示目的蛋白?？蛇x的是，應該對反應緩沖液中混合有非熒光底物(s)的經純化(或僅僅稀釋許多倍)的包含mrna-核糖體-蛋白(trna)的三元復合物進行乳化，產生水包油包水雙乳液(bernath等，2004；mastrobattista等，2005)。區(qū)室化酶的活性變體會將底物(s)轉化成熒光產物(p)，從而能夠以facs區(qū)分熒光微滴(內部為活性酶)和“暗”微滴(內部為失活酶)。與酶促反應必須在轉錄/翻譯混合物中進行的之前公開的實例相反，crd允許在更天然(為所需要的)的條件下進行完全緩沖液交換和活性酶選擇(圖10)。還可以使用crd選擇和進化熱穩(wěn)定性dna聚合酶(圖11)。必須以核糖體展示形式展示目的聚合酶?？蛇x的是，可以使用經純化(或僅僅稀釋許多倍)的包含mrna-核糖體-聚合酶的三元復合物來制備在pcr緩沖液中的具有逆轉錄酶(輔助酶)、dntp和引物組的反應混合物。應該對反應液進行乳化，產生油包水乳液。在第一步rt中-逆轉錄酶必須合成cdna，該cdna隨后用作第二步pcr的靶-利用核糖體展示的dna聚合酶進行cdna擴增。pcr中所用的引物之一可以具有生物素和非互補性5'末端，所述生物素用于可選的使用鏈親和素珠的隨后純化。將rt-pcr乳液破乳后，新合成的dna片段可通過生物素進行純化，并使用新引物組再次擴增，該新引物組含有的一個引物的序列與cdna不互補、但與第一次擴增反應中所用引物的5'部分相同(在cdna背景下的dna選擇性擴增)。相對于活性較低的變體，dna聚合酶的活性更高的變體將得到富集，并可用于進一步分析或下一輪選擇(圖11)。區(qū)室化核糖體展示技術的重要特征是：1).通過mrna文庫維持基因型，這對于選擇rna加工酶特別有用；2).選擇單元是mrna-核糖體-蛋白(trna)三元復合物，并且可以通過超速離心、凝膠過濾、親和標簽純化和其它簡單方法對其容易地進行純化；3).可以交換反應緩沖液，由此能夠將選擇單元轉移(經過純化或未經純化)到新的反應混合物，并且同時被稀釋100～200倍(從而將乳化后核糖體復合物的數(shù)量調整到低于1個分子/反應區(qū)室)；4).crd的mrna文庫多樣性僅受體外區(qū)室化的多樣性指數(shù)限制，并且低于1010的不同變體；5).一旦乳化，可以在4℃～94℃的寬范圍的溫度下進行選擇反應，原因在于在這些溫度下乳液是穩(wěn)定的；6).如果在較高溫度(30℃以上)進行選擇，三元復合物會解離，但保持區(qū)室化從而不喪失基因型-表型聯(lián)系，釋放mrna和體外翻譯的蛋白。已經發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的區(qū)室化核糖體展示方法對于促進新型逆轉錄酶的進化起特別良好的作用。作為實例，m-mulv逆轉錄酶(gerard等，1986，prt601)可用于選擇(該酶包括用于純化的n末端his標簽)。該逆轉錄酶的活性最適的溫度是42℃，并且在高達50℃的溫度下仍有活性?？梢栽诒景l(fā)明方法的步驟(d)中使編碼m-mulv逆轉錄酶的mrna的陣列處于溫育溫度為50℃～60℃并且包括cdna合成所需的引物和dntp的反應條件下。在這些較高的溫度下，在4℃下穩(wěn)定的貯存的核糖體復合物迅速解離，釋放逆轉錄酶底物(mrna)和酶到溶液中。在一個實施方式中，從核糖體復合物釋放的體外翻譯的逆轉錄酶m-mulv具有作為間隔子的與在核糖體展示構建中所用的λ噬菌體外表面蛋白d融合的c末端，從而保留在核糖體隧道(matsuura和pluckthun，2003)和共價結合的trna中，原因在于翻譯未正確地終止。蛋白d是非常良好表達的可溶且穩(wěn)定的蛋白，解折疊轉變溫度為～57℃(forrer和jaussi，1998)，因此是用于選擇熱穩(wěn)定性逆轉錄酶的良好融合伴侶。在區(qū)室化核糖體展示選擇方法中，只有具有完全活性的逆轉錄酶的變體可以執(zhí)行cdna的合成，該cdna編碼相同活性的酶。在1小時內，逆轉錄反應完成后，將乳液破乳，對cdna進行純化并通過巢式pcr進行擴增。由于crd的選擇性質，只有編碼能夠執(zhí)行全長cdna合成的逆轉錄酶的活性變體的cdna會被擴增，并且必要的話可被轉移到下一輪選擇。為了消除t7聚合酶啟動子區(qū)域、核糖體結合位點(rbs)和蛋白d序列中不期望的突變，可以將僅編碼m-mulv序列的擴增dna連接到天然5'和3'末端片段，從而恢復最初的核糖體展示構建體，并可以進行下一輪選擇。在5輪選擇中已經鑒定出在50°下具有比活性的酶變體，與用于文庫制備的原始酶的活性相比，該變體的活性高2倍至4倍。一些蛋白更快速，一些蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性。許多選擇的m-mulv變體具有d524g或d583n突變，這些突變關閉了逆轉錄酶的rna酶h活性，改善了cdna合成以及熱穩(wěn)定性(gerard等，2002)。許多更多的所選擇的m-mulv逆轉錄酶的變體具有之前提到和描述(us7056716；us20060094050a1；us7078208；us20050232934a1；wo07022045a2)的其它不同的有益突變(h204r；h638r；t197a；m289v；e302k；t306a；n454k；y64c；e69g；q190r；v223m；f309s；l435p；e562k)。除此之外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了逆轉錄酶氨基酸序列中的許多新的熱點。一些突變的重復頻率非常高，并且具有非常重要的意義，這對經純化的突變體進行分析時可以顯示(實施例2)。因此本發(fā)明人可以聲明，本發(fā)明的crd技術是非?？焖俣曳€(wěn)健(fastandrobust)的選擇方法，通過直接進化和m-mulv逆轉錄酶的改進可以確認其有效性。作為原理的驗證，我們已選擇出在更高溫度下工作更好的m-mulv逆轉錄酶的變體。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本文所述方法可獲得的逆轉錄酶。在另一方面，本發(fā)明提供了在超過42℃，優(yōu)選至少50℃，更優(yōu)選50℃～60℃的溫度下具有最佳活性的逆轉錄酶。通過應用具有較高溫度，優(yōu)選至少50℃的反應條件根據(jù)本文所述方法可以選擇逆轉錄酶。在本發(fā)明的這一方面，可以選擇與野生型酶相比活性-溫度曲線遷移的逆轉錄酶，所述活性-溫度曲線遷移使觀察到的最佳活性的溫度升高。在另一方面，本發(fā)明提供了一種逆轉錄酶，該逆轉錄酶包含在以下氨基酸位置中的一處或多處具有突變的mmlv逆轉錄酶氨基酸序列：當突變位于d653處時，優(yōu)選該突變不是d653n。當突變位于l603處時，優(yōu)選該突變不是l603a。另外，當突變位于h594處時，優(yōu)選該突變不是h594a。優(yōu)選位于上述位置處的突變是點突變。優(yōu)選的是，所述逆轉錄酶具有以下突變中的一個或多個突變：發(fā)現(xiàn)這些突變中的每個，例如使得突變酶在50℃時與相應的野生型酶相比具有更高的活性。這些突變的進一步詳細描述記載于具體實施例中。在本發(fā)明特別優(yōu)選的方面，突變酶具有至少兩個突變。在一個實施方式中所述兩個突變位于d200和l603處。例如所述突變?yōu)閐200n和l603w。在替代性實施方式中所述突變位于n479和h594。例如所述突變?yōu)閚479d和h594r。在另一方面，本發(fā)明提供了在大于37℃的溫度具有最佳活性的逆轉錄酶，其中50℃下的活性是37℃下活性的至少120％。優(yōu)選的是，50℃下的活性是37℃下活性的至少130％，更優(yōu)選至少160％。在另一方面，本發(fā)明提供了50℃下活性為相應野生型酶活性的至少兩倍的突變逆轉錄酶。在另一方面，本發(fā)明提供了37℃下比活性為相應野生型酶活性的至少130％的突變逆轉錄酶。優(yōu)選的是，所述突變逆轉錄酶的比活性是相應野生型酶比活性的至少140％，更優(yōu)選至少150％，特別優(yōu)選至少160％。如本文所述已經發(fā)現(xiàn)部分純化的野生型酶的37℃的比活性為約200000u/mg。在具體實施例中會更詳細地討論根據(jù)本發(fā)明獲得的具體突變逆轉錄酶。在另一方面，本發(fā)明提供了熱穩(wěn)定性為相應野生型酶熱穩(wěn)定性的至少1.5倍的突變逆轉錄酶。本申請中根據(jù)在50℃下處理5分鐘后在37℃下的殘留活性來測定熱穩(wěn)定性。優(yōu)選的是，突變逆轉錄酶的熱穩(wěn)定性是相應野生型酶熱穩(wěn)定性的至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，還更優(yōu)選至少2.5倍。通常，野生型逆轉錄酶37℃下的殘留活性是未經處理酶的約11％。優(yōu)選本發(fā)明的逆轉錄酶包括mmlv逆轉錄酶。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述逆轉錄酶的多核苷酸，例如mrna或dna。本發(fā)明的逆轉錄酶可以用于各種分子生物學技術，如rt-pcr(qrt-pcr等)。可以提供一種用于rt-pcr的試劑盒，所述試劑盒中的逆轉錄酶是本發(fā)明的逆轉錄酶。附圖說明現(xiàn)在參考僅作為示例的附圖和附錄，更詳細地描述本發(fā)明。圖1.實施例1的實驗流程圖。使用兩種質粒pet_his_mlv_pd(編碼與蛋白d間隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉錄酶)和pet_his_del_pd(編碼與蛋白d間隔子融合的失活(pol結構域中57個氨基酸缺失)的莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉錄酶)來合成pcr片段。pcr片段繼續(xù)用于轉錄反應和合成3'末端缺少終止密碼子的mrna。將經純化的mrna以1：50＝mlv(活性rt)：del(失活rt)的比例混合并用于體外翻譯反應。翻譯反應期間，核糖體復合物合成蛋白，并在缺少終止密碼子的mrna的末端停止。通過蔗糖墊超速離心對三元復合物(tc)的混合物進行純化。使用已經含有與體外翻譯的mlv逆轉錄酶相連的mrna的經純化三元復合物(取<3×109個分子)來制備逆轉錄反應混合物，該逆轉錄反應混合物補充有用于rt反應的外部dntp組和引物。對冰冷的rt反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。為了進行rt反應，對乳化rt反應混合物(低于一個tc(mrna+mlvrt)/區(qū)室)于42℃下溫育1小時。區(qū)室化rt反應混合物的溫度升高后，大多數(shù)tc解離，釋放mrna和逆轉錄酶。僅在含有活性mlv逆轉錄酶(mlv_pd)的區(qū)室中才進行成功的rt反應，在具有失活逆轉錄酶(del_pd)的區(qū)室中未合成cdna。隨后pcr擴增cdna，并觀察到活性逆轉錄酶(mlv_pd)基因相對于失活逆轉錄酶(del_pd)的富集。圖2.pet_his_mlv_pd質粒的示意圖。圖3.實施例1-對crd選擇期間合成的cdna進行的第一次pcr的瓊脂糖凝膠電泳。所用引物：rd_nde(seqidno：9)和pd_55(seqidno：10)。對于mlv_pd，pcr片段的預期長度是2185bp，對于del_pd是2014bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上進行擴增分析。圖4.實施例1-對第一次pcr產物進行的用于部分基因擴增的巢式pcr的瓊脂糖凝膠電泳。所用引物：m_f(seqidno：11)和m_2r(seqidno：12)。對于mlv_pda，pcr片段的預期長度是907bp，對于del_pd是736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上進行擴增分析。圖5.實施例1-對第一次pcr產物進行的用于全基因擴增的巢式pcr的瓊脂糖凝膠電泳。所用引物：m_esp(seqidno：13)和m_eri(seqidno：14)。對于mlv_pda，pcr片段的預期長度是2077bp，對于del_pd是1906bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上進行擴增分析。圖6.實施例2中crd選擇的實驗流程圖。使用編碼逆轉錄酶(與蛋白d融合)mlv_pd的突變體文庫的pcr片段來合成mrna。經純化的mrna用于體外翻譯反應。在翻譯混合物中形成mrna-核糖體-mlv_pd(trna)的三元復合物(tc)，并通過低溫和高濃度的mg2+離子將其穩(wěn)定。通過蔗糖墊超速離心對tc的混合物進行純化。將沉淀的tc溶解于冰冷的緩沖液(50mmmg2+)中并用于制備逆轉錄反應混合物，該逆轉錄反應混合物補充有用于rt反應的外部dntp組和引物。對冰冷的rt反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。mlvrt的最適反應溫度是～42℃。為了選擇在更高溫度下工作更好的逆轉錄酶變體，使乳化的rt反應混合物(低于一個tc(mrna+mlvrt)/區(qū)室)于50℃下溫育1小時。在該溫度下在含有更具活性或熱穩(wěn)定性的mlv逆轉錄酶變體的區(qū)室中全長cdna的成功合成進行地更好。隨后的pcr用于擴增全長cdna，并進行更具活性和熱穩(wěn)定性的逆轉錄酶基因的富集。通過pcr，將擴增的基因回復到crd形式，通過連接pcr恢復完整的5'(起始片段-t7聚合酶啟動子、sd和his-標簽編碼序列)和3'(末端片段-gs連接子、蛋白d和第二gs連接子)序列。含有逆轉錄酶基因的富集文庫的重建pcr片段被用于隨后的mrna轉錄和下一輪crd選擇。在溫度越來越高的rt反應中進行各輪選擇：50℃(第一輪)；52.5℃(第二輪)；55℃(第三輪)；57.5℃(第四輪)和60℃(第五輪)。圖7.新一輪crd選擇之前pcr片段的重建流程圖。用esp3i(ncoi相容末端(compatibleend))和ecori消化突變的mlvrt文庫，并將其與起始片段(244bp)和末端片段(398bp)連接，從而獲得適合crd選擇的pcr片段。通過對最初的983bp起始片段(靶-質粒pet_his_del_pd(seqidno：2)、引物-pro-pivex(seqidno：3)和m_1r(seqidno：15))進行pcr擴增和隨后用ncoi(識別序列c↓catgg)消化，構建起始片段(含有t7聚合酶啟動子、sd和his-標簽編碼序列)，產生244bp的dna片段。通過對最初的1039bp末端片段(靶-質粒pet_his_del_pd(seqidno：2),引物-m_3f(seqidno：16)和pd-ter(seqidno：4))進行pcr擴增和隨后用ecori(識別序列g↓aattc)消化，構建末端片段(含有gs連接子、蛋白d和第二gs連接子序列)，產生398bp的dna片段。圖8.37℃、50℃下測定的突變rt變體的逆轉錄酶活性和50℃下溫育5分鐘后在37℃下的殘留活性。將37℃下的逆轉錄酶活性標準化成總是100％并且將其省略。因此僅顯示兩種類型的柱(50℃下rt活性的百分比和50℃下溫育5分鐘后在37℃下的殘留rt活性的百分比)。作為對照，給出用于突變體文庫構建的wtm-mulv逆轉錄酶。該起始酶在與rt突變變體相同的載體中表達并以相同的方式進行純化。對于所有測試突變體50℃下的突變rt活性的平均值約為～92％，超過wt酶(45％)的2倍以上。50℃下預溫育5分鐘后在37℃下突變rt變體的平均殘留活性為12％(wt酶～11％)。圖9.37℃下10分鐘測定的部分純化的wt和突變rt變體的比活性(u/mg蛋白)。圖10.所提出的使用facs進行crd選擇的實驗流程圖。以核糖體展示形式展示目的蛋白。使包含mrna-核糖體-蛋白(trna)的經純化(或僅僅稀釋許多倍)的三元復合物與非熒光底物(s)在反應緩沖液中混合，并隨后進行乳化，產生水包油包水雙乳液。區(qū)室化酶的活性變體會將底物(s)轉化成熒光產物(p)，使得facs得以區(qū)分熒光微滴(內部為活性酶)和“暗”微滴(內部為失活酶)。圖11.所提出的使用crd對熱穩(wěn)定性dna聚合酶進行選擇和進化的實驗流程圖。必須以核糖體展示形式展示目的蛋白?？蛇x經純化(或僅僅稀釋許多倍)的包含mrna-核糖體-聚合酶的三元復合物可用來制備在pcr緩沖液中的具有逆轉錄酶(輔助酶)、dntp和引物組的反應混合物。應該對反應液進行乳化，產生油包水乳液。在第一步rt中-逆轉錄酶必須合成cdna，該cdna隨后用作第二步pcr的靶—利用核糖體展示的dna聚合酶進行cdna擴增。pcr中所用的引物之一可以具有生物素和非互補性5'末端，所述生物素用于可選的使用鏈親和素珠進行的隨后純化。將rt-pcr乳液破乳后，新合成的dna片段經由生物素進行純化，并使用新引物組再次擴增，該新引物組含有序列與cdna不互補、但與第一擴增反應(dna相對于cdna背景的選擇性擴增)中所用的引物的5'部分相同的一種引物。相對于活性較低的變體，dna聚合酶的活性更高的變體會得到富集，并可用于進一步分析或下一輪選擇。圖12.實施例4的實驗流程圖。在該實驗計劃中將m-mulv逆轉錄酶用作dna依賴性dna聚合酶。使用兩種質粒，pet_his_mlv_d583n_pd(編碼減去rna酶h的與蛋白d間隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉錄酶)和pet_his_del_pd(編碼與蛋白d間隔子融合的失活逆轉錄酶-在pol結構域中57個氨基酸缺失，并且在rna酶h結構域中存在點突變d583n)，來合成pcr片段。pcr片段繼續(xù)用于轉錄反應。將經純化的mrna以1：20＝mlv_d583n_pd(活性rt)：del_pd(失活rt)的比例混合，并用于通過使用t4dna連接酶將dsdna連接到mrna混合物上來制備mrna/dsdna復合物。mrna/dsdna復合物用于體外翻譯反應。翻譯反應期間，核糖體復合物合成蛋白，并在mrna的末端(位于mrna/dna雜交物的開始)處停止。通過蔗糖墊超速離心對三元復合物(tc)的混合物進行純化。使用已經含有與體外翻譯的聚合酶(m-mulv逆轉錄酶)連接的mrna/dsdna的經純化三元復合物(取<3×109個分子)來制備補充有外部生物素-dutp的延伸反應混合物。對冰冷的反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。為了導入生物素化核苷酸，將乳化延伸反應混合物(低于一個tc(mrna/dsdna+聚合酶)/區(qū)室)于37℃下溫育30分鐘。區(qū)室化反應混合物的溫度升高后，大多數(shù)tc解離，釋放mrna/dsdna復合物和聚合酶。僅在含有活性聚合酶(逆轉錄酶-mlv_d583n_pd)的區(qū)室中才進行成功的導入dsdna底物中的反應，在具有失活聚合酶(del_pd)的區(qū)室中未合成cdna。將乳液破乳后，使用凝膠過濾微柱除去過量的生物素-dutp。在鏈親和素珠上對生物素化的mrna/dsdna復合物進行純化并將其用于合成cdna。隨后pcr擴增cdna，觀察到活性聚合酶(逆轉錄酶-mlv_d583n_pd)基因相對于失活聚合酶(del_pd)的富集。圖13.確定生物素-dutp導入到mrna/dsdna復合物和導入到自為引物的mrna中的效率。對導入dttp或生物素-dutp后的mrna/dsdna(mlv_d583n_pd)和mrna(del_pd)樣品進行的rt-pcr的圖像。對于mlv_d583n_pd，預測的擴增子大小為907bp，對于del_pdcdna為736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上分析pcr產物。圖14.通過導入dttp(生物素-dutp)和[α-p33]datp進行的mrna/dsdna復合物存在的一般對比。在導入最初的dttp或生物素-dutp后，應該將放射性datp導入到dsdna底物中。a–用溴化乙錠可視化的瓊脂糖凝膠(mrna或mrna/dsdna帶-2.5kb)。b–濾紙上干燥的與a相同凝膠，并且使用cyclonephosphorimager(perkin-elmer，wellesley，ma)使其可視化。觀察到標記的mrna/dsdna復合物和/或僅觀察到dsdna帶。c-mrna/dsdna復合物中dsdna對應物(counterpart)的結構和序列。圖15.實施例4的所得最終rt-pcr片段的分析。對于mlv_d583n_pd，預測的擴增子大小為907bp，對于del_pdcdna為736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上分析pcr產物。進行鏈親和素珠純化前的rt-pcr樣品相當于活性聚合酶基因與失活聚合酶基因的比例為1：20(幾乎只有del_pd片段～736bp可見)。在鏈親和素珠上純化后的rt-pcr樣品相當于活性聚合酶基因與失活聚合酶基因的一輪選擇后的比例為1：1。在該輪選擇中觀察到～20的富集倍數(shù)。圖16.用于確定1kb和4.5kbcdna合成反應的最高溫度的堿性瓊脂糖凝膠的一些實例。pcr儀-eppendormastercyclegradient。a-d-1kbcdna合成(m-mulv(wt)、d200n、l603w和q221r)；溫度梯度41.9℃、43.6℃、45.5℃、47.8℃、50.4℃、53.1℃、55.8℃、58.1℃、60.1℃、62.1℃；尺寸標準(sizestandart)-dnafastruler中等范圍(fermentas)。e-g-4.5kbcdna合成(m2、m3和m4)；溫度梯度49.8℃、51.5℃、53.4℃、55.7℃、58.3℃、61.0℃、63.7℃、66.1℃、68.0℃、70.0℃；尺寸標準-ziprulerexpressdnaladder2(fermentas)。附錄1.起始mlvrt文庫(ncoi和ecori限制性位點之間的序列-seqidno.24)中發(fā)現(xiàn)的突變的概覽。于10個測序基因中發(fā)現(xiàn)23個核苷酸突變(1個顛換、20個轉換-突變位置加下劃線，在序列之上標出突變，2個缺失-加下劃線并在序列之上標示為虛線)，產生15個氨基酸交換、6個沉默突變、1個終止密碼子和2個編碼框的移碼-平均每個基因1至2個氨基酸取代。附錄2.為了與文獻中通常所用的氨基酸編號相同，對所有104個蛋白序列進行不帶n末端his標簽的clustalw比對。表示為mlv(seqidno：25)的野生型序列總是以第一序列給出(按照顯示順序突變序列表示seqidnos：26～128)。使用于黑色背景中的白色字體標記突變。發(fā)生了某種程度上改善m-mulv逆轉錄酶性質和描述于不同的專利申請中的突變處的氨基酸位置在比對中標記為以灰色突出顯示的氨基酸(白色字體)的柱。源自我們的選擇并且位于灰色柱中的突變表明，我們的選擇方法精確地靶向有益的熱點或甚至別處所述的確切氨基酸突變。與初始wtm-mulv相比50℃下的活性實質上更好(與wt活性的45％相比，為70％以上)的所分析蛋白的序列用灰色突出顯示。附錄3.所有選擇的rt變體中發(fā)現(xiàn)的突變的列表。按照突變數(shù)量的遞減對蛋白進行排列。附錄4.所選擇rt變體的突變頻率(降序)。與初始wtm-mulv相比50℃下的活性實質上更好(與wt活性的45％相比，為70％以上)的所分析蛋白的名稱用灰色突出顯示。附錄5.關于m-mulv(wt)逆轉錄酶和單突變體的數(shù)據(jù)的總結表，所述表包含：蛋白名稱；選擇頻率(具有確切突變的測序突變體的數(shù)量，括號中的數(shù)字表示選擇中發(fā)現(xiàn)的具體氨基酸突變的總數(shù))；蛋白濃度(mg/ml)；37℃下的逆轉錄酶比活性(u/mg)；50℃下的相對活性(％)；在50℃下酶溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留活性(％)；蛋白的rna酶h比活性(u/mol)；相對rna酶h活性(％)以及1kbcdna合成反應的最高溫度。附錄6.關于m-mulv(wt)逆轉錄酶和單突變體的數(shù)據(jù)的總結表，所述表包含：蛋白名稱；蛋白濃度(mg/ml)；37℃下的逆轉錄酶比活性(u/mg)；50℃下的相對活性(％)以及1kb和4.5kbcdna合成反應的最高溫度。附錄7.seqidnos：1～23相關的序列和信息。具體實施方式實施例1-crd–原理驗證為了提供區(qū)室化核糖體展示選擇系統(tǒng)的原理驗證，進行測試選擇。通常的原理驗證實驗對于活性酶(對于我們的情況是起始mlv逆轉錄酶的rt-pcr片段)應該給出陽性信號和對于失活酶沒有信號(對于失活的mlv逆轉錄酶沒有rt-pcr片段)。更復雜的實驗使用編碼活性酶和失活酶的基因的規(guī)定比例的混合物。作為成功實驗的結果，編碼活性酶的基因應該相對于編碼失活酶的基因富集。實驗的一般流程圖示于圖1。使用兩種質粒，pet_his_mlv_pd(編碼與蛋白d間隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉錄酶)和pet_his_del_pd(編碼與蛋白d間隔子融合的失活(pol結構域中57個氨基酸缺失)的莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mlv)逆轉錄酶)來合成pcr片段。進而pcr片段用于合成mrna的轉錄反應，所述mrna的3'末端缺少終止密碼子。將從兩個上述pcr片段產生的經純化的mrna以1：50＝mlv(活性rt)：del(失活rt)的比例混合并用于體外翻譯反應。翻譯反應期間，核糖體復合物合成蛋白，并在缺少終止密碼子的mrna的末端停止。通過用冰冷的含有50mmmg2+的緩沖液進行稀釋來終止翻譯反應。低溫、高濃度的mg2+離子和在mrna的末端不存在終止密碼子使得mrna-核糖體-蛋白(trna)的三元復合物(tc)穩(wěn)定化。通過蔗糖墊超速離心對三元復合物(tc)的混合物進行純化。對超速離心進行優(yōu)化，以使tc(-3.5mda)沉淀于超速離心管的底部，同時小分子量的分子、蛋白和大多數(shù)游離mrna(～0.9mda)留在上清液中。將沉淀的tc溶解于冰冷的緩沖液(50mmmg2+)中。使用已經含有與體外翻譯的mlv逆轉錄酶相連的mrna的經純化三元復合物(取<3×109個分子)來制備逆轉錄反應混合物，該逆轉錄反應混合物補充有用于rt反應的外部dntp組和引物。對冰冷的rt反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。為了進行rt反應，對乳化rt反應混合物(低于一個tc(mrna+mlvrt)/區(qū)室)于42℃下溫育1小時。區(qū)室化rt反應混合物的溫度升高后，大多數(shù)tc解離，釋放mrna和逆轉錄酶。僅在含有活性mlv逆轉錄酶(mlv_pd)的區(qū)室中才進行成功的rt反應，在具有失活逆轉錄酶(del_pd)的區(qū)室中未合成cdna。隨后的pcr確保了所合成的cdna的擴增，并且觀察到活性逆轉錄酶(mlv_pd)基因相對于失活逆轉錄酶(del_pd)的富集。方法和材料通過對pet型質粒的t7聚合酶啟動子和shine-dalgarno序列區(qū)域進行修飾，并且插入具有n末端his-標簽(seqidno：1的258-305)和與甘氨酸-絲氨酸(gs)連接子(seqidno：1的2364-2393)、來自λ噬菌體的蛋白d的部分(pd)(seqidno：1的2394-2669)和第二甘氨酸-絲氨酸(gs)連接子(seqidno：1的2670-2759)融合的c末端的mlvh+逆轉錄酶編碼序列(seqidno：1的306-2363)，構建起始質粒pet_his_mlv_pd(seqidno：1和圖2)。n末端his-標簽用于蛋白表達純化。在蛋白體外翻譯和形成mrna-核糖體-mlv(trna)三元復合物期間c末端融合必須保留在核糖體隧道中。m-mulv逆轉錄酶具有兩種主要的酶促活性：rna依賴性dna聚合酶和rna酶h。導入點突變d583n(在質粒pet_his_mlv_pd，seqidno：1中的2055位處單核苷酸g交換為a)使逆轉錄酶rna酶h活性關閉。天冬氨酸583位于rna酶h活性位點，參與mg離子結合并且對于rna酶h活性是關鍵的。新質粒鑒定為pet_his_mlv_d583n_pd，并進一步用于下一質粒pet_his_del_pd(seqidno：2)的構建，所述下一質粒編碼失活的逆轉錄酶。用限制性內切核酸酶xmaji(識別序列c↓ctagg-seqidno：1的1047和1218位)消化質粒pet_his_mlv_d583n_pd。除去長度為171bp的基因片段，使經消化的質粒自連接，產生pet_his_del_pd(seqidno：2)，pet_his_del_pd編碼縮短171個核苷酸或57個氨基酸的逆轉錄酶基因，在蛋白翻譯框上未發(fā)生移碼。重要的是使得相同的逆轉錄酶基因具有以下特征：1)長度縮短(用于容易pcr檢測)；2)失活(實驗上確認聚合酶結構域中的57個氨基酸的缺失使聚合酶活性完全失活，以及突變d583n使rna酶h活性失活)和3)沒有移碼(任何移碼會導致終止密碼子的出現(xiàn)，這與核糖體展示形式不相容)。用于體外轉錄的pcr片段的制備。在冰上制備pcr混合物：20μl—10x具有kc1的taq緩沖液(fermentas)；20μl—2mm的各dntp(fermentas)；12μl—25mmmgcl2(fermentas)；16μl—dmso(d8418-sigma)；4μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1μl—100μmpro-pivex引物(seqidno：3)；1μl—100μmpd-ter引物(seqidno：4)；122μl水—將混合物分成2x98μl的兩試管。向2x98μlpcr主混合物(mastermix)中添加2μlpet_his_mlv_pd(稀釋到～1ng/μl)或2μlpet_his_del_pd(稀釋到～1ng/μl)。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，30個循環(huán)(94℃下45秒鐘，53℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。從2ng質粒(7873bp)至～5μg(50ng/μl)擴增產物(對于pet_his_mlv_pd為2702bppcr片段；對于pet_his_del_pd為2531bppcr片段)，擴增了～7000倍。制備轉錄混合物：40μl—5xt7轉錄緩沖液(ph為7.6的1mhepes-koh；150mm乙酸鎂；10mm亞精胺；0.2mdtt)；56μl—25mm各ntp(fermentas)；8μl—20u/μlt7rna聚合酶(fermentas)；4μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；52μl不含核酸酶的水—將混合物分成2x80μl的兩試管，并且添加20μl—50ng/μl的mlv_pd(pro-pivex//pd-ter)或20μl—50ng/μl的del_pd(pro-pivex//pd-ter)pcr混合物。轉錄在37℃下進行3小時。用冰冷的不含核酸酶的水將兩種轉錄混合物都稀釋到200μl，并且添加200μl6mlicl溶液。將混合物在+4℃下溫育30分鐘，在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度(25'000g)離心30分鐘。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將試管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊進行干燥12分鐘，并隨后通過在+4℃和1400rpm下振搖15分鐘使其再懸浮于200μl不含核酸酶的冰冷水中。再次將試管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，從而分離未溶解的rna。將約180μl的上清液移到具有20μl10xdna酶i緩沖液(mg2+)(fermentas)；1μl—1u/μl的dna酶i(不含rna酶)(fermentas)的新試管中，并且在37℃下溫育20分鐘，從而降解dna。向各試管添加20μlph為5.0的3m乙酸鈉溶液和500μl冰冷的96％乙醇。最后通過在-20℃下溫育30分鐘，并在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度(25'000g)離心30分鐘使rna沉淀。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將試管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊進行干燥12分鐘，并隨后通過在+4℃和1400rpm下振搖15分鐘使其再懸浮于43μl不含核酸酶的冰冷水中。將rna溶液等分為4x10μl，并用液氮冷凍。分光光度法測定mrna的濃度，并在使用riborulertmrnaladder，高范圍(fermentas)的瓊脂糖凝膠上進行復核—mlv_pdmrna～1.2μg/μl；del_pdmrna～1.2μg/μl。將經純化mrna以1：50＝mlv(活性rt)：del(失活rt)的比例混合。將mlv_pdmrna稀釋25倍至～48ng/μl，使1μl(～48ng)與2μl～1.2μg/μl的del_pdmrna(2.4μg)混合，得到～0.8μg/μl比例為1：50的mrna混合物。使用兩種翻譯系統(tǒng)rts100大腸桿菌hy試劑盒(03186148001-roche)和合成型wakopure(295-59503-wako)進行體外翻譯。給出蛋白翻譯序列，對于mlv_pd為seqidno：6，對于del_pd為seqidno：7。用于rtshy系統(tǒng)的翻譯混合物(25μl)：6μl—大腸桿菌裂解物(roche)；5μl—反應混合物(roche)；6μl-氨基酸(roche)；0.5μl—100mm蛋氨酸(roche)；0.5μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；0.4μl—200μmassra寡核苷酸(seqidno：5)；0.25μl—1mdtt；2.5μl重建緩沖液(roche)；2.5μl不含核酸酶的水和1.5μl—0.8μg/μlmrna混合物1：50＝mlv_pd：del_pd(～1200ng)。在30℃下進行體外翻譯20分鐘。用于wakopure系統(tǒng)的翻譯混合物(25μl)：12.5μl–a溶液(wako)；5μl—b溶液(wako)；0.5μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；0.4μl—200μmαssra寡核苷酸(seqidno：6)；0.25μl—1mdtt；5μl不含核酸酶的水和1.5μl—0.8μg/μlmrna混合物l：50＝mlv_pd：del_pd(～1200ng)。在37℃下進行體外翻譯30分鐘。通過添加155μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(25℃下ph為7.5的50mmtris-乙酸鹽(tris-acetate)；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma))并在+4℃和25'000g下離心5分鐘來終止兩個翻譯體系(～25μl)。非常仔細地將160μl經離心的翻譯混合物移液到840μl35％(w/v)蔗糖在wbk500+dtt+triton中的溶液(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma)；35％(w/v)–蔗糖(84097-fluka))的頂部。為了對mrna-核糖體-蛋白(trna)的三元復合物(tc)進行純化，使用tl-100beckman超速離心機；tla100.2固定角轉頭(beckman)；透明的1ml超速離心管(343778-beckman)在+4℃和100'000rpm下進行超速離心9分鐘。為了將小的透明tc團塊保持在超速離心管的底部，小心地處理完整的試管。最初從離心管的最上部除去750μl溶液。然后(非常仔細地)用750μlwbk500(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1)洗滌管壁。最后從離心管的最上部開始處除去所有溶液，并且將團塊溶解于30μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma))中。如超速離心后使用放射性標記的mrna所確定，5％至30％的輸入的mrna位于三元復合物團塊中。因此預期在30μl緩沖液中具有低于360ng(翻譯反應中所用的1200ngmrna的30％)的mrna(～12ng/μl或9×109個分子/μl的三元復合物)。在冰上制備用于選擇的逆轉錄反應混合物：60μl—5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液(fermentas)；7.5μl-40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；15μl—20μmpd_42寡核苷酸(seqidno：8)；188μl不含核酸酶的水—將混合物分成2x135μl的兩試管，添加0.9μl經純化的tc(<8×109個分子)(在roche-rtshy試劑盒中翻譯)或0.9μl經純化的tc(<8×109個分子)(在wako-wakopure翻譯)。將各反應混合物(～135μl)再次分成45μl和90μl的兩試管。向第一部分—45μl的rt混合物中添加5μl不含核酸酶的水。認為該樣品為陰性選擇對照(無dntp)，和必須證明在反應混合物中無dna污染，并且cdna合成與來自三元復合物中的mlvrt的逆轉錄酶功能活性嚴格關聯(lián)。向第二部分—90μl的rt混合物中添加10μl—10mm各dntp混合物(fermentas)，并且將反應混合物再次分為用于選擇對照的50μl和用于陽性選擇對照的補充有1μl—200u/μl的revertaidh-m-mulv逆轉錄酶(fermentas)的50μl兩試管。根據(jù)所述方案，各逆轉錄反應混合物在50μl體積中含有<2.7×109個分子的三元復合物。通過將abilem90(goldschmidt)混入礦物油(m5904-sigma)至終濃度4％(v/v)來制備乳化用油類表面活性劑混合物(ghadessy和holliger，2004；us2005064460)。通過將950μl油類表面活性劑與50μlrt混合物混合在+4℃下在5ml冷凍小瓶(cryogenicvial)(430492-corning)中制備乳液。使用速度控制在～2100rpm的ms-3000磁力攪拌器、具有中心環(huán)的-(3x8mm)磁性隨動裝置(1489.2-roth)進行混合；每30秒鐘向水相添加10μl等分試樣，繼續(xù)混合另外2分鐘(總混合時間—4分鐘)。根據(jù)光學顯微鏡數(shù)據(jù)，本發(fā)明乳液中的區(qū)室大小為0.5μm～10μm，平均直徑為～2μm。因此預期對50μl逆轉錄反應混合物進行乳化后具有～l×1010個油包水區(qū)室，含有低于2.7×109個分子的三元復合物(每3至4個區(qū)室約1個mrna和逆轉錄酶分子)。對所有6種乳液在+42℃下溫育一小時，所述6種乳液代表在roche-rtshy試劑盒中翻譯的具有tc的rt混合物(陰性選擇對照、選擇對照和陽性選擇對照)和在wako-wakopure中翻譯的具有tc的rt混合物(陰性選擇對照、選擇對照和陽性選擇對照)。為了回收反應混合物，將乳液移至1.5ml的試管，在室溫和25'000g下離心1分鐘。除去油相，在試管底部留下濃縮(但仍完整)的乳液，并添加250μlpb緩沖液(qiagenpcr純化試劑盒)。最后通過用0.9ml水飽和的醚提??；0.9ml水飽和的乙酸乙酯(為了除去abilem90洗滌劑)提??；并再次用0.9ml水飽和的醚提取將乳液破乳。在室溫下于真空中對水相干燥5分鐘。對所合成的cdna用qiagenpcr純化試劑盒進行純化，并在30μleb緩沖液(qiagenpcr純化試劑盒)中洗脫。通過巢式pcr進行cdna的擴增。在冰上制備起始的pcr混合物：16μl—10x具有kc1的taq緩沖液(fermentas)；16μl—2mm的各dntp(fermentas)；9.6μl—25mmmgcl2(fermentas)；3.2μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；0.8μl—100μmrd_nde引物(seqidno：9)；0.8μl—100μmpd_55引物(seqidno：10)；74μl水—將混合物分成6個15μl的樣品(6x15μl)和30μl的樣品。向6x15μlpcr主混合物中添加5μlcdna(rt樣品1至6)；向30μlpcr主混合物中添加9μl水，并再次將混合物分成2x19.5μl的兩試管以用于陰性pcr對照(加0.5μl水)和陽性pcr對照(加0.5μl—pet_his_mlv_pd和pet_his_del_pd質粒的1：1混合物(～1ng))。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，25個循環(huán)(94℃下45秒鐘，58℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。對于mlv_pd，pcr片段的預期長度是2185bp，對于del_pd是2014bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上對擴增分進行析。使用兩組不同的引物進行巢式pcr，導致部分基因擴增(以更好的分辨rt樣品中的mlv：delcdn比例)或全基因擴增(以證明全基因恢復的可能性)。在冰上制備用于部分基因擴增的巢式pcr混合物：28μl—10x具有kc1的taq緩沖液(fermentas)；28μl—2mm的各dntp(fermentas)；16.8μl—25mmmgcl2(fermentas)；5.6μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1.4μl—100μmm_f引物(seqidno：11)；1.4μl—100μmm_2r引物(seqidno：12)；185μl水—將混合物分成2x19μl和6x38μl。向2x19μl的pcr主混合物中添加1μl第一次pcr物的陽性對照或陰性對照(引物組rd_nde//pd_55)—30個pcr循環(huán)擴增；向6x38μl的pcr主混合物中添加2μl第一次pcr(引物組rd_nde//pd_55)(樣品1至6)—將各樣品再次分成2x20μl的兩部分以用于23或30個pcr循環(huán)擴增。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，23或30個循環(huán)(94℃下45秒鐘，57℃下45秒鐘和72℃下1分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。對于mlv_pd，pcr片段的預期長度是907bp，對于del_pd是736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上對擴增進行分析(圖4)。在冰上制備用于全基因擴增的巢式pcr混合物：28μl—10x具有kc1的taq緩沖液(fermentas)；28μl—2mm各dntp(fermentas)；16.8μl—25mmmgcl2(fermentas)；5.6μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1.4μl—100μmm_esp引物(seqidno：13)；1.4μl—100μmm_eri引物(seqidno：14)；185μl水—將混合物分成2x19μl和6x38μl。向2x19μlpcr主混合物中添加1μl第一次pcr物的陽性或陰性對照(引物組rd_nde//pd_55)—30個pcr循環(huán)擴增；向6x38μlpcr主混合物中添加2μl首次pcr(引物組rd_nde//pd_55)(樣品1至6)—將各樣品再次分成2x20μl的兩部分以用于23或30個pcr循環(huán)擴增。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，23或30個循環(huán)(94℃下45秒鐘，55℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。對于mlv_pd，pcr片段的預期長度是2077bp，對于del_pd是1906bp。在每孔加載10μlpcr混合物的瓊脂糖凝膠上對擴增進行分析(圖5)。結果為了證明區(qū)室化核糖體展示(crd)法的原理驗證，使用與蛋白d間隔子融合的編碼活性(mlv)和失活(del)逆轉錄酶的兩種mrna的l：50＝mlv：del起始混合物進行選擇。使用兩種不同的翻譯系統(tǒng)roche-rts100大腸桿菌hy或wako–wakopure進行體外翻譯，以了解在本發(fā)明的實驗方案中哪一種翻譯系統(tǒng)更好。對于各翻譯系統(tǒng)進行三種區(qū)室化rt反應：無dntp的陰性選擇對照，其需要證明在反應混合物中無dna污染；選擇對照，其需要證明編碼活性(mlv)逆轉錄酶的基因相對于編碼失活酶(del)的基因的富集，原因在于僅活性酶可以合成cdna；以及補充有外部revertaidh-商業(yè)逆轉錄酶的陽性選擇對照，其必須充當在所有區(qū)室中合成來自mlv_pd和del_pdmrna的cdna的陽性rt對照，以表明不施加選擇壓力時反應混合物中基因的真實比例。通過巢式pcr對合成的cdna進行擴增。起始pcr(25個循環(huán))的瓊脂糖凝膠電泳圖像(圖3)僅在兩個陽性選擇對照(翻譯系統(tǒng)-roche和wako)的情況下顯示了弱的pcr片段帶。這是正常的，原因在于這些樣品含有外部rt酶，該酶與每區(qū)室含有僅一個體外合成的逆轉錄酶分子的反應相比，合成cdna的效率高得多。巢式pcr(部分基因擴增)瓊脂糖凝膠電泳的圖像示于圖4。23和30個pcr循環(huán)后擴增結果一致：1)在陰性選擇對照(w/odntp)中無擴增(無dna污染)；2)在陽性選擇對照(外部rt酶)中觀察到del_pdcdna(736bpdna片段)的非常有效的擴增，并且未見到mlv_pdcdna的擴增，原因在于mlv_pd與del_pdmrna的起始比例為1：50；3)在選擇對照的情況下觀察到cdnamlv_pd(907bpdna片段)和del_pd(736bpdna片段)的擴增；4)在由roche體外翻譯系統(tǒng)所合成的逆轉錄酶的情況下觀察到～1：1的mlv_pd：del_pd的比例，這意味著mlv_pd基因相對于del_pd基因從起始的1：50比例開始富集了～50倍；5)在由wako體外翻譯系統(tǒng)所合成的逆轉錄酶的情況下觀察到～1：3的mlv_pd：del_pd的比例，這意味著mlv_pd基因相對于del_pd基因從起始的1：50比例開始富集了～16倍；巢式pcr(全基因擴增)瓊脂糖凝膠電泳的圖像示于圖5。在23和30個pcr循環(huán)的結果之間，以及與用于部分基因擴增的巢式pcr(圖5)的結果相比，23和30個pcr循環(huán)后的擴增結果一致：1)在陰性選擇對照(w/odntp)中無擴增(無dna污染)；2)在陽性選擇對照(外部rt酶)中觀察到del_pdcdna(1906bpdna片段)的非常有效的擴增，并且未見到mlv_pdcdna的擴增，原因在于mlv_pd與del_pdmrna的起始比例為1：50；3)在選擇對照的情況下觀察到cdnamlv_pd(2077bpdna片段)和del_pd(1906bpdna片段)的擴增；4)在全基因擴增的情況下難以確定mlv_pd：del_pd的比例，原因在于2077bp(mlv_pd)和1906bp(del_pd)dna片段之間的相對差不夠大，但是通常比例與用于部分基因擴增的巢式pcr的結果相似。作為該實施例的結果，可以總結出在以crd形式進行的逆轉錄反應期間，相對于編碼失活酶的基因富集了編碼活性mlv逆轉錄酶的基因，在roche翻譯系統(tǒng)的情況下富集倍數(shù)為50，在用于體外合成酶的wako翻譯系統(tǒng)的情況下富集倍數(shù)為16。實施例2-crd–選擇在更高溫度下性能改善的逆轉錄酶為了了解區(qū)室化核糖體展示(crd)選擇如何有效地起作用，進行莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶(m-mulvrt)的進化實驗。實驗的一般流程圖示于圖6。通過使用核苷酸類似物dptp和8-氧-dgtp的易錯pcr構建逆轉錄酶的起始突變體文庫。進行全基因(～2kb)誘變，每個基因引入2至3個核苷酸或1至2個氨基酸突變。使用編碼逆轉錄酶(與蛋白d融合)mlv_pd的突變體文庫的pcr片段來合成mrna。經純化的mrna用于體外翻譯反應。在翻譯混合物中形成mrna-核糖體-mlv_pd(trna)的三元復合物(tc)，并通過低溫和高濃度的mg2+離子將其穩(wěn)定。通過蔗糖墊超速離心對tc的混合物進行純化。將沉淀的tc溶解于冰冷的緩沖液(50mmmg2+)中并用于制備逆轉錄反應混合物，該逆轉錄反應混合物補充有用于rt反應的外部dntp組和引物。對冰冷的rt反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。mlvrt的最適反應溫度是～42℃。為了選擇在更高溫度下工作更好的逆轉錄酶變體，使乳化rt反應混合物(低于一個tc(mrna+mlvrt)/區(qū)室)于50℃下溫育1小時。在該溫度下在含有更具活性或熱穩(wěn)定性的mlv逆轉錄酶變體的區(qū)室中，全長cdna的成功合成進行地更好。隨后的pcr用于擴增全長cdna，并進行更具活性和熱穩(wěn)定性的逆轉錄酶基因的富集。通過pcr，將擴增的基因回復到crd形式，通過連接-pcr恢復完整的5'(起始片段-t7聚合酶啟動子、sd和his-標簽編碼序列)和3'(末端片段-gs連接子、蛋白d和第二gs連接子)序列。含有逆轉錄酶基因的富集文庫的重建pcr片段用于隨后的mrna轉錄和下一輪crd選擇。以溫度越來越高的rt反應進行各輪選擇：50℃(第一輪)；52.5℃(第二輪)；55℃(第三輪)；57.5℃(第四輪)和60℃(第五輪)。將第五輪選擇后逆轉錄酶基因的擴增文庫(無c末端pd連接子)克隆到質粒載體。對個體克隆進行測序和分析。使用親和色譜通過his-標簽對進化蛋白以及個體突變體的庫進行純化。確定37℃、50℃下mlv逆轉錄酶的比活性和在50℃下酶溫育5分鐘后在37℃下的殘留活性。方法和材料使用起始質粒pet_his_mlv_pd(seqidno：1和圖2)作為易錯pcr的起始材料。使用核苷酸類似物dptp和8-氧-dgtp引入突變。在冰上制備用于易錯pcr的pcr混合物：10μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；10μl—2mm各dntp(fermentas)；6μl—25mmmgcl2(fermentas)；2μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；0.5μl—100μmm_esp引物(seqidno：13)；0.5μl—100μmm_eri引物(seqidno：14)；1μl—10μmdptp(trilinkbiotechnolgies)；5μl—100μm8-氧-dgtp(trilinkbiotechnolgies)；3.75μl—40ng/μl(總共150ng)的pet_his_mlv_pd質粒；61.25μl水。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，30個循環(huán)(94℃下30秒鐘，55℃下30秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。從150ng質粒(7873bp)到～6至12μg的擴增產物(對于pet_his_mlv_pd為2077bppcr片段)，擴增了150至300倍。使用qiagenpcr純化試劑盒對pcr片段進行純化，用esp3i(識別序列cgtctc(1/5))和ecori(識別序列g↓aattc)進行消化，最后使用qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中進行純化，得到的dna濃度為～50ng/μl。通過對亞克隆回用ncoi和ecori消化的起始pet_his_mlv_pd質粒中的個體克隆進行測序，從而檢查突變發(fā)生效率和文庫質量。據(jù)預期突變隨機分布在整個mlvrt基因的擴增序列中(附錄1)。在10個測序基因中，發(fā)現(xiàn)23個核苷酸突變(1個顛換、20個轉換、2個缺失—在附錄1中用紅色標記)，產生15個氨基酸交換、6個沉默突變、1個終止密碼子和2個編碼框的移碼—平均每個基因1至2個氨基酸取代。將突變文庫與起始片段(244bp)和末端片段(398bp)連接，從而獲得適合crd選擇的pcr片段(圖7)。通過對最初的983bp起始片段(靶-質粒pet_his_del_pd(seqidno:2)、引物—pro-pivex(seqidno:3)和m_1r(seqidno:15))進行的pcr擴增和隨后用ncoi(識別序列c↓catgg)進行的消化，構建起始片段(含有t7聚合酶啟動子、sd和his-標簽編碼序列)，獲得244bp的dna片段。通過對最初的1039bp末端片段(靶-質粒pet_his_del_pd(seqidno:2)、引物—m_3f(seqidno:16)和pd-ter(seqidno:4))的進行pcr擴增和隨后用ecori(識別序列g↓aattc)進行的消化，構建末端片段(含有gs連接子、蛋白d和第二gs連接子序列)，獲得398bp的dna片段。在室溫下制備連接反應物(150μl)：15μl—10x用于t4dna連接酶的連接緩沖液(fermentas)；15μl—1u/μlt4dna連接酶(fermentas)；26μl—50ng/μl用esp3i(ncoi相容末端)和ecori消化的突變mlvrt文庫(～1300ng或～5.9×1011個分子)；9.4μl—35ng/μl用ncoi消化的起始片段(～329ng或～1.2×1012個分子)；15.7μl—35ng/μl用ecori消化的末端片段(～548ng或～1.2×1012個分子)；68.9μl–水。在+4℃下進行連接過夜。將反應混合物用苯酚處理1次，并用氯仿處理2次，使其沉淀并溶解于53μl的水。比較連接混合物和已知量的質粒pet_his_mlv_pd的擴增效率，確定連接產率為約～20％。考慮到20％的連接產率，將mlvrt突變體文庫的多樣性定為～1.2×1011個分子(50μl)。通過pcr擴增連接的mlvrt文庫(1ml–在冰上制備)：100μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；100μl—2mm各dntp(fermentas)；60μl—25mmmgcl2(fermentas)；80μl—dmso(d8418-sigma)；20μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；5μl—100μmpro-pivex引物(seqidno：3)；5μl—100μmpd-ter-引物(seqidno：17)；20μl–連接的mlvrt文庫(～5×1010個分子)；610μl–水。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，15個循環(huán)(94℃下30秒鐘，53℃下30秒鐘和72℃下3分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。從～5×1010個分子(相當于～150ng)的大小為2702bp的最終連接片段至～30μg(30ng/μl)的擴增產物(2702bppcr片段)，擴增了～200倍。第1輪選擇制備轉錄混合物(100μl)：20μl—5xt7轉錄緩沖液(ph為7.6的1mhepes-koh；150mm乙酸鎂；10mm亞精胺；0.2mdtt)；28μl—25mm各ntp(fermentas)；4μl—20u/μlt7rna聚合酶(fermentas)；2μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；30μl—30ng/μl突變體文庫(pro-pivex//pd-ter-)pcr混合物(～900ng或～3×1011個分子)；16μl不含核酸酶的水。在37℃下轉錄進行3小時(文庫多樣性～5×1010個分子)。用冰冷的不含核酸酶的水將轉錄混合物稀釋到200μl，并添加200μl6mlicl溶液。將混合物在+4℃下溫育30分鐘，在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度(25'000g)離心30分鐘。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將試管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊進行干燥12分鐘，并隨后通過在+4℃和1400rpm下振搖15分鐘使其再懸浮于200μl不含核酸酶的冰冷的水中。再次將管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，從而分離未溶解的rna。將約180μl的上清液移到具有20μl10xdna酶i緩沖液(mg2+)(fermentas)；1μl—1u/μl的dna酶i(不含rna酶)(fermentas)的新試管中，并且在37℃下溫育30分鐘，從而降解dna。向反應混合物添加20μlph為5.0的3m乙酸鈉溶液和500μl冰冷的96％乙醇。最后通過在-20℃下溫育30分鐘，并在+4℃下于冷卻的的離心機中以最大速度(25'000g)離心30分鐘使rna沉淀。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將管在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度離心5分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊進行干燥12分鐘，并隨后通過在+4℃和1400rpm下振搖10分鐘再懸浮于33μl不含核酸酶的冰冷的水中。將rna溶液等分為3x10μl，并用液氮冷凍。分光光度法測定mrna的濃度，并在使用riborulertmrnaladder，高范圍(fermentas)的瓊脂糖凝膠上進行復核-mlvrt文庫mrna-2.1μg/μl。使用rts100大腸桿菌hy(03186148001-roche)翻譯系統(tǒng)進行體外翻譯(25μl)：6μl–大腸桿菌裂解物(roche)；5μl–反應混合物(roche)；6μl–氨基酸(roche)；0.5μl—100mm蛋氨酸(roche)；0.5μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；0.4μl—200umassra寡核苷酸(seqidno：5)；0.25μl—1mdtt；3μl重組緩沖液(roche)；2.5μl不含核酸酶的水和0.6μl—2.1μg/μlmrna(-1200ng)。在30℃下使反應混合物溫育20分鐘。通過添加155μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(25℃下ph為7.5的50mmtris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkcl；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma))來終止翻譯，并在+4℃和25'000g下離心5分鐘來終止翻譯。非常仔細地將160μl經離心的翻譯混合物移液到840μl35％(w/v)蔗糖在wbksoo+dtt+triton中的35％(w/v)蔗糖溶液(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma)；35％(w/v)–蔗糖(84097-fluka))的頂部。為了對mrna-核糖體-mlv(trna)的三元復合物(tc)進行純化，使用tl-100beckman超速離心機、tla100.2固定角轉頭(beckman)、透明的1ml超速離心管(343778-beckman)在+4℃和100,000rpm下進行超速離心9分鐘。為了將小的透明tc團塊保持在超速離心管的底部，小心地處理完整的試管。最初從離心管的最上部除去750μl溶液。然后(非常仔細地)用750μlwbk500(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1)洗滌管壁。最后從離心管的最上部開始除去所有溶液，并且將團塊溶解于30μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma))中。使用放射性標記的mrna通過實驗確定：超速離心在三元復合物團塊中得到輸入mrna的5％至30％。因此據(jù)預測在30μl緩沖液中具有低于360ng(翻譯反應中所用的1200ngmrna的30％)的mrna(～12ng/μl或9×109個分子/μl的三元復合物)。在冰上制備用于選擇的逆轉錄反應混合物：60μl—5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液(fermentas)；7.5μl—40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；15μl—20μmpd_42寡核苷酸(seqidno：8)；186μl不含核酸酶的水和1.8μl經純化(<1.8×1010個分子)tc(在roche-rtshy試劑盒中翻譯)。將反應混合物分成45μl和225μl的兩試管。向第一部分—45μl的rt混合物中添加5μl的不含核酸酶的水。該樣品作為陰性選擇對照(無dntp)，并且需要證明在反應混合物中無dna污染，并且cdna合成與來自三元復合物中的mlvrt的逆轉錄酶功能活性嚴格關聯(lián)。向第二部分—225μl的rt混合物中添加25μl—10mm各dntp混合物(fermentas)，并且將反應混合物再次分為兩試管：用于選擇對照的200μl(4x50μl)(總共<1.2×1010個分子的tc)和用于陽性選擇對照的補充有1μl—200u/μl的revertaidh-m-mulv逆轉錄酶(fermentas)的50μl。根據(jù)方案，各逆轉錄反應混合物在50μl體積中含有<3×109個分子的三元復合物。通過將abilem90(goldschmidt)混入礦物油(m5904-sigma)至終濃度4％(v/v)來制備乳化用油-表面活性劑混合物(ghadessy和holliger，2004；us2005064460)。通過將950μl油-表面活性劑混合物與50μlrt混合物混合，從而在+4℃下在5ml冷凍小瓶(cryogenicvial)(430492-corning)中制備乳液。使用速度控制在～2100rpm的ms-3000磁力攪拌器、具有中心環(huán)的-(3x8mm)磁性隨動裝置(1489.2-roth)進行混合；每30秒鐘向水相添加10μl等分試樣，繼續(xù)混合另外2分鐘(總混合時間-4分鐘)。根據(jù)光學顯微鏡數(shù)據(jù)，本發(fā)明乳液中的區(qū)室大小為0.5μm～10μm，平均直徑為～2μm。因此據(jù)預期對50μl逆轉錄反應混合物進行乳化后具有～l×1010個油包水區(qū)室，含有低于3×109個分子的三元復合物(每3至4個區(qū)室約1個mrna和逆轉錄酶分子)。使所有乳液在+50℃下溫育1小時，以選擇在更高溫度下工作更好的逆轉錄酶變體。為了回收反應混合物，將乳液移至1.5ml的試管，在室溫和25'000g下離心10分鐘。除去油相，在試管底部留下濃縮(但仍完整)的乳液。通過用0.9ml水飽和的醚提??；0.9ml水飽和的乙酸乙酯(為了除去abilem90洗滌劑)提??；并再次用0.9ml水飽和的醚提取將乳液破乳。在室溫下于真空中對水相進行干燥5分鐘，并且添加250μl的pb緩沖液(qiagenpcr純化試劑盒)。將四個選擇樣品合并到兩個試管中。用qiagenpcr純化試劑盒將所合成的cdna進一步純化，并在陰性和陽性選擇對照的情況下在30μleb緩沖液(qiagenpcr純化試劑盒)中洗脫，在選擇對照的情況下用2x30μl的eb緩沖液洗脫。通過巢式pcr進行cdna的擴增。首先進行小pcr擴增，以檢查陰性和陽性選擇對照，并確定對于選擇樣品中的cdna進行有效擴增所需的pcr循環(huán)的最小數(shù)量。在冰上制備pcr混合物(200μl)：20μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；20μl—2mm各dntp(fermentas)；12μl—25mmmgcl2(fermentas)；2.5μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1μl—2.5u/μlpfudna聚合酶(fermentas)；1μl—100μmrd_nde引物(seqidno：9)；1μl—100μmpd_55引物(seqidno：10)；50μl–選擇對照的純化cdna；92μl水。用于2185bppcr片段的循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，25個循環(huán)(94℃下45秒鐘，58℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。在冰上制備用于全基因擴增的巢式pcr混合物(500μl)：50μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；50μl—2mm各dntp(fermentas)；30μl—25mmmgcl2(fermentas)；6.25μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；2.5μl—2.5u/μlpfudna聚合酶(fermentas)；2.5μl—100μmm_esp引物(seqidno：13)；2.5μl—100μmm_eri引物(seqidno：14)；50μl第一次pcr物(引物組rd_nde//pd_55)；306μl水。用于2077bppcr片段的循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，22個循環(huán)(94℃下45秒鐘，55℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。使用qiagen凝膠提取試劑盒對選擇樣品的最終pcr片段進行瓊脂糖凝膠純化(在60μl中洗脫～50ng/μl)。在37℃下用ecori和esp3i對經純化的pcr片段消化1小時，并再次進行瓊脂糖-凝膠純化(在30μl中洗脫～50ng/μl)。將第一輪選擇后回收的mlv逆轉錄酶文庫與起始片段和末端片段(在本實施例中之前已描述構建)連接，從而獲得適合第二輪crd選擇(圖6)的pcr片段(圖7)。在室溫下制備連接反應物(40μl)：4μl—10x用于t4dna連接酶的連接緩沖液(fermentas)；2μl—1u/μlt4dna連接酶(fermentas)；4μl—50ng/μl用esp3i和ecori消化的選擇文庫(～200ng或0.9×1011個分子)；1.1μl—35ng/μl用ncoi消化的起始片段(～35ng或～1.5×1011分子)；1.76μl—35ng/μl用ecori消化的末端片段(～61ng或～1.5×1011個分子)；27.2μl–水。在室溫下進行連接1小時。通過pcr對連接的mlvrt文庫進行擴增(300μl–在冰上制備)：30μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；30μl—2mm各dntp(fermentas)；18μl—25mmmgcl2(fermentas)；24μl—dmso(d8418-sigma)；3.7μl—1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1.5μl—2.5u/μlpfudna聚合酶(fermentas)；1.5μl—100μmpro-pivex引物(seqidno：3)；1.5μl—100μmpd-ter-引物(seqidno：17)；25.5μl–連接的mlvrt文庫(～.6×1010個分子)；164.3μl–水。用于2702bppcr片段的循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，15個循環(huán)(94℃下45秒鐘，53℃下45秒鐘和72℃下3分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。使用qiagen凝膠提取試劑盒對pcr片段進行瓊脂糖凝膠純化(在30μl中洗脫～100ng/μl)。第2輪選擇第2輪選擇按照第1輪選擇實驗流程的一般設置進行，不同之處在于pcr循環(huán)、乳化rt反應溫度和幾個其它細節(jié)上的微小改動。所有改動如下給出：·轉錄—取10μl—100ng/μl(～1000ng)的瓊脂糖凝膠純化的pcr片段，第2輪選擇中所用的mrna的終濃度為1.5μg/μl；·翻譯—取0.8μl—1.5μg/μl(～1.2μg)的mrna；·乳化rt反應在52.5℃進行1小時；·第一次pcr(rd_nde//pd_55)—進行24個循環(huán)；·第二次(巢式)pcr(m_esp//m_eri)—進行23個循環(huán)；·經消化pcr片段的終濃度—80ng/μl；·連接—取200ng(～0.9×1011個分子)的mlvrt文庫；·pcr(對連接混合物進行)—取<0.6×1010個分子的經選擇文庫，并進行15個pcr循環(huán)；最終瓊脂糖凝膠純化的pcr片段的濃度為200ng/μl。第3輪選擇第3輪選擇按照第1輪選擇實驗流程的一般設置進行，不同之處在于pcr循環(huán)、乳化rt反應溫度和幾個其它細節(jié)上的微小改動。所有改動如下給出：·轉錄—取5μl—200ng/μl(～1000ng)的瓊脂糖凝膠純化的pcr片段，第3輪選擇中所用的mrna的終濃度為1.5μg/μl；·翻譯—取0.8μl—1.5μg/μl(～1.2μg)的mrna；·乳化rt反應在55℃下進行1小時；·第一次pcr(rd_nde//pd_55)—進行25個循環(huán)；·第二次(巢式)pcr(m_esp//m_eri)—進行22個循環(huán)；·經消化pcr片段的終濃度—70ng/μl；·連接—取200ng(～0.9×1011個分子)的mlvrt文庫；·pcr(對連接混合物進行)—取<0.6×1010個分子的所選擇文庫，并進行15個pcr循環(huán)；最終瓊脂糖凝膠純化的pcr片段的濃度為100ng/μl。第4輪選擇第4輪選擇按照第1輪選擇實驗流程的一般設置進行，不同之處在于pcr循環(huán)、乳化rt反應溫度和幾個其它細節(jié)上的微小改動。所有改動如下給出：·轉錄—取10μl—100ng/μl(～1000ng)的瓊脂糖凝膠純化的pcr片段，第4輪選擇中所用的mrna的終濃度為1.8μg/μl；·翻譯—取0.67μl—1.8μg/μl(～1.2μg)的mrna；·乳化rt反應在57.5℃下進行1小時；·第一次pcr(rd_nde//pd_55)—進行25個循環(huán)；·第二次(巢式)pcr(m_esp//m_eri)—進行24個循環(huán)；·經消化pcr片段的終濃度—50ng/μl；·連接—取200ng(～0.9×1011個分子)的mlvrt文庫；·pcr(對連接混合物進行)—取<0.6×1010個分子的所選擇文庫，并進行15個pcr循環(huán)；最終瓊脂糖凝膠純化的pcr片段的濃度為100ng/μl。第5輪選擇第5輪選擇按照第1輪選擇實驗流程的一般設置進行，不同之處在于pcr循環(huán)、乳化rt反應溫度和分析最終階段上的一些改動。所有改動如下給出：·轉錄—取10μl—100ng/μl(～1000ng)的瓊脂糖凝膠純化的pcr片段，第5輪選擇中所用的mrna的終濃度為1.1μg/μl；·翻譯—取1.1μl—1.1μg/μl(～1.2μg)的mrna；·乳化rt反應在60℃下進行1小時；·第一次pcr(rd_nde//pd_55)—進行25個循環(huán)；·第二次(巢式)pcr(m_esp//m_eri)—進行33個循環(huán)；在冰上制備用于全基因擴增的巢式pcr混合物(500μl)：50μl—10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；50μl-2mm各dntp(fermentas)；30μl-25mmmgcl2(fermentas)；6.25μl-1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；2.5μl-2.5u/μlpfudna聚合酶(fermentas)；2.5μl-100μmm_esp引物(seqidno：13)；2.5μl-100μmm_hind3+引物(seqidno：18)；50μl的第一次pcr物(引物組rd_nde//pd_55)；306μl水。用于2077bppcr片段的循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，22個循環(huán)(94℃下45秒鐘，55℃下45秒鐘和72℃下3分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。使用qiagen凝膠提取試劑盒對選擇樣品的最終pcr片段進行瓊脂糖凝膠純化(在60μl中洗脫～60ng/μl)。經純化的pcr片段在37℃下用hindiii和esp3i消化1小時，并再次進行瓊脂糖凝膠純化(在40μl中洗脫～50ng/μl)。將第5輪選擇后將回收的mlv逆轉錄酶文庫連接到從用ncoi和hindiii消化的pet_his_mlv_pd(seqidno：1和圖2)制備的質粒載體中，得到編碼mlvrt的新的7474bp質粒pet_his_mlv(seqidno：19)，該mlvrt具有n末端his-標簽，并且在c末端上沒有pd融合以用于使用親和色譜的快速蛋白純化。將第5輪選擇后的連接的mlvrt文庫電穿孔到t7表達株er2566中。對個體克隆進行測序和分析。使在相同構建中進化蛋白的庫以及個體突變體和初始wtm-mulv逆轉錄酶在200mllb中生長至a590為～0.7，并使用2mlqiagen-ni-ntasuperflow樹脂利用his標簽進行純化(根據(jù)供應商建議在天然條件下進行所有純化)。在1mleb(50mm—nah2po4，300mm—nacl，ph為8.0的250mm—咪唑，10mm—β-巰基乙醇和0.1％tritonx-100)中進行洗脫。以50倍過量的貯存緩沖液(50mmtris-hcl(在25℃下ph8.3)，0.1mnacl，1mmedta，5mmdtt，0.1％(v/v)tritonx-100和50％(v/v)甘油)對所有蛋白進行透析。在sds-page上檢查蛋白純度(通常～40％至80％的靶蛋白)。使用基于bredford法的bio-rad蛋白檢測(500-0006)確定蛋白濃度。在37℃、50℃下測定mlv逆轉錄酶的比活性(將酶稀釋于特定的稀釋緩沖液：30mm25℃下ph為8.3的tris-hcl，10mmdtt，0.5mg/mlbsa)，以及在50℃下使酶溫育5分鐘后在37℃下測定殘留活性(將酶稀釋，并在1xrt反應緩沖液：50mm25℃下ph為8.3的tris-hcl，4mmmgcl2，10mmdtt，50mmkcl中測定其穩(wěn)定性)。在以下最終混合物中檢測所有情況下的酶活性：50mmtris-hcl(25℃下ph為8.3)，6mmmgcl2，10mmdtt，40mmkc1，0.5mmdttp，0.4mbq/ml[3h]-dttp，0.4mmpolya·寡(dt)12-18。確定活性單位，測定在特定反應溫度下在10分鐘內dtmp在多核苷酸級分(在de-81上吸收)中的導入，并且與已知量的商業(yè)酶比較。結果在選擇數(shù)據(jù)進行的分析的期間，我們已經累積了104個表達全長m-mulv逆轉錄酶的序列。為了與文獻中通常所用的具有相同的氨基酸編號相同，使將對所有蛋白(附錄2)進行的全部總clustalw比對以編譯成無不帶n末端his標簽的方式匯編記。表示為mlv的野生型序列總是作為第一序列給出。使用于黑色背景中的白色字體標記突變(附錄2)。其處發(fā)生的突變某種程度上改善m-mulv逆轉錄酶性質并和描述于不同的專利申請中的突變處的氨基酸位置，在比對中標記為以灰色突出顯示的氨基酸(白色字體)的柱。源自我們的選擇并且位于灰色柱中的突變作為證明表明，我們的選擇方法精確地靶向有益的熱點或甚至別處所述的準確確切氨基酸突變。從104個測序克隆中我們發(fā)現(xiàn)了98個獨特序列和1個wt(l5_87)序列。5個序列重復兩次(l5_21和l5_111；l5_43和l5_112；l5_49和l5_63；l5_64和l5_93；l5_85和l5_96)。我們總共隨機表達了55個蛋白。從在55個所表達蛋白中，根據(jù)sds-page，將40個m-mulv逆轉錄酶的40個酶促活性突變變體(包括對照wt)利用sds-page成功純化到40％至80％均勻性均一性(homogeneity)。純化rt樣品中的總蛋白濃度為0.6mg/ml-至5.5mg/ml。在37℃，50℃下測試突變rt變體在37℃、50℃下的逆轉錄酶活性和在50℃下溫育5分鐘后在37℃下的殘留活性(圖8)。將37℃下的逆轉錄酶活性標準化成100％并且在圖8中省略。因此僅顯示兩種類型的柱(50℃下rt活性的百分比和50℃下溫育5分鐘后在37℃下的殘留rt活性的百分比)。作為對照，顯示了提出用于突變體文庫構建的wtm-mulv逆轉錄酶。該起始酶在與rt突變變體相同的載體中表達并以相同的方式進行純化。50℃下wt酶rt活性的平均值為37℃下活性的約45％。除了少量例外，幾乎所有測試蛋白在50℃下具有高于45％的活性。對于所有測試突變體50℃下的rt活性的平均值約為～92％，超過wt酶(45％)的2倍。一些變體在50℃下的活性是37℃下活性的100％或甚至更高：20、23、l5_16、l5_24、l5_30、l5_35、l5_37、l5_43、l5_46、l5_47、l5_49、l5_52、l5_55、l5_64、l5_65、l5_68、l5_72。發(fā)現(xiàn)的最佳突變體在50℃下具有的rt活性是約140％以上(比wt的45％高3倍)：20(165％)、l5_37(162％)、l5_43(156％)、l5_46(135％)、l5_47(179％)、l5_52(137％)、l5_64(142％)和l5_68(153％)。即使大多數(shù)的突變體在50℃下具有非常高的rt活性，它們仍然不是熱穩(wěn)定的。wt對照的50℃下溫育5分鐘后在37℃的殘留rt活性為～11％。所選擇酶的相同平均殘留活性為類似的～12％。雖然一些所測試的rt變體實質上熱穩(wěn)定性更高，并且具有的殘留活性比wt酶(11％)高2至3倍：l5_8(25％)、l5_43(32％)、l5_46(27％)、l5_64(28％)、l5_65(25％)、l5_68(31％)。部分經純化wt酶的比活性(u/mg蛋白)是～200'000u/mg(圖9)。以各種方式表達和純化所選擇的rt變體，并且平均比活性(～155'000u/mg)稍微低于wt對照(圖9)。比活性在某些情況下減少，在某些情況下增加(20—～274'000u/mg；l5_11—～273'000u/mg；l5_28—～230'000u/mg；l5_30—～224'000u/mg；l5_35—～316'000u/mg；l5_43—～328'000u/mg；l5_46—～304'000u/mg；l5_52—～310'000u/mg；l5_64—～256'000u/mg；l5_65—～247'000u/mg)。顯然我們的選擇系統(tǒng)運行良好。使用rt反應的溫度升高作為選擇壓力因子，我們成功地進化了更快(50℃下的rt比活性更高)和熱穩(wěn)定性(50℃下預溫育5分鐘后在37℃的殘留rt活性)更高的逆轉錄酶。有價值信息的來源是所選擇蛋白序列的比對(附錄2)。與初始wtm-mulv相比50℃下的活性實質上更好(與wt活性的45％相比，為70％以上)的所分析蛋白的序列用灰色突出顯示(附錄2)。發(fā)生突變的氨基酸數(shù)量為0(wt或l5_87)～12(l5_9)。在所有所選擇rt變體中發(fā)現(xiàn)的突變的列表如附錄3所示。蛋白按突變數(shù)量遞減排序。大多數(shù)突變體(104個中的53個)具有4至6個突變/序列。顯然逆轉錄酶序列具有一些熱點，這些熱點通常對于rt反應和對于酶的熱穩(wěn)定性是重要和有益的。作為特定位置處的突變集合，這些熱點可以在多序列比對(附錄2)中容易鑒定。特別重要的是m-mulv逆轉錄酶的運行更好的變體中發(fā)現(xiàn)的突變(序列以灰色突出顯示—附錄2)。關于頻率最高的突變的總結信息(以降序)示于附錄4。如之前附錄一樣，在50℃下具有實質上更高活性的突變蛋白用灰色突出顯示。如果相同突變重復許多次并且具有該突變的測試逆轉錄酶在50℃下運行更好，這意味著該突變以某種方式對逆轉錄反應有益。根據(jù)突變的發(fā)現(xiàn)頻率，可以將它們分成5類：21至31個重復；14至18個重復；4至7個重復；2至3個重復和1個重復。第一組頻率最高的突變包括四個氨基酸d524(31個重復)；d200(30個重復)；d653(23個重復)和d583(21個重復)。已知兩個氨基酸(d524和d583)在核糖核酸酶h結構域的活性中心絡合鎂離子。使用突變d524g、d583n和e562q來關閉m-mulv逆轉錄酶的rna酶h活性(gerard等，2002)，這改善cdna的合成。我們的選擇結果驚人地相似。在98個序列中的31個內發(fā)現(xiàn)天冬氨酸524的突變。另外，d524n取代發(fā)現(xiàn)1次，d524a發(fā)現(xiàn)10次以及最后d524g發(fā)現(xiàn)20次。因此我們的選擇不僅精確靶向重要的氨基酸，還靶向已知為最佳的相同的氨基酸取代。完全相同的情況是天冬氨酸583的突變，其在104個所選擇蛋白中的21個中重復。取代d583e發(fā)現(xiàn)1次，d583a發(fā)現(xiàn)3次，d583g發(fā)現(xiàn)7次以及最后d583n發(fā)現(xiàn)10次。再次，選擇頻率最高的是已知為最佳的相同氨基酸和相同取代(d583n)。來自invitrogen的商業(yè)酶superscriptii具有3個突變：d524g，d583n和e562q(wo2004024749)。令人感興趣的事情是第3個氨基酸取代e562的突變在我們選擇中僅發(fā)現(xiàn)一次(在l5_71中的e562k)。該結果表明，很有可能谷氨酸562不如天冬氨酸524和583那樣重要，或出于某些原因該氨基酸的交換可能引起某些副作用，并且對于在較高溫度(>50℃)下進行的rt反應不利。對經選擇蛋白序列的進一步分析可以鑒定更多熱點氨基酸位置，這些熱點氨基酸的突變在改善的m-mulv逆轉錄酶的其它專利申請中有所描述：h204r—7個重復(us7078208)；h638r—4個重復(us20050232934a1)；t197a-2個重復(us7056716)；m289v(l)、t306a(m)—2個重復(us7078208)；e302k、n454k—2個重復(wo07022045a2)；e69g、l435p—1個序列(wo07022045a2)；y64c、q190r、v223m、f309s—1個序列(us7056716)；e562k—1個序列(us7078208)。還存在兩個經選擇的逆轉錄酶序列，所述序列具有文獻中所述的3個氨基酸取代的組合(30—d200n、t306m、d524n、d583g；l5_28—t306a、f309s、d524a、h594r、f625s)。除了已知的突變之外，我們還鑒定出許多經常發(fā)生突變的其它氨基酸位置：d200n(a，g)—30個重復；d653n(g、a、h、v)—23個重復；l603w(m)—18個重復；t330p—15個重復；l139p—14個重復；q221r—6個重復；t287a—6個重復；i49v(t)—5個重復；n479d—5個重復；h594r(q)—5個重復；f625s(l)—5個重復；p65s—4個重復；h126s(r)—4個重復；l333q(p)—4個重復；a502v—4個重復；e607k(g，a)—4個重復；k658r(q)—4個重復；h8p(r)—3個重復；p130s—3個重復；e233k—3個重復；q237r—3個重復；n249d—3個重復；a283d(t)—3個重復；a307v—3個重復；y344h—3個重復；p407s(l)—3個重復；m428l—3個重復；q430r—3個重復；d449g(a)—3個重復；a644v(t)—3個重復；n649s—3個重復；l671p—3個重復；e673g(k)—3個重復；n678i—3個重復(附錄4)。表現(xiàn)最佳的rt變體通常具有被修飾最頻繁的氨基酸的突變：20(50℃-123％)-d200n(30個重復)，l603w(18個重復)和稍微修飾的c末端-n678i，s679p，r680a；l5_35(50℃-125％)-d200n(30個重復)，t330p(15個重復)，n479d(5個重復)；l5_37(50℃-162％)-h123s(4個重復)，l149f(1個序列)，d200n(30個重復)，n454k(2個重復)，d583n(21個重復)；l5_43(50℃-160％)-d200n(30個重復)，q237r(3個重復)，t330p(15個重復)，d524g(31個重復)，f625s(5個重復)，d653n(23個重復)；l5_46(50℃-135％)-d200n(30個重復)，t330p(15個重復)，d583n(21個重復)，t644t(3個重復)；l5_47(50℃-179％)-n107s(1個重復)，h126r(4個重復)，t128a(1個重復)，ii79v(2個重復)，d200n(30個重復)，h642y(2個重復)，d653n(23個重復)；l5_52(50℃-137％)-d200n(30個重復)，t330p(15個重復)，q374r(2個重復)，d583n(21個重復)；l5_64(50℃-142％)-d200n(30個重復)，d216g(2個重復)，d524g(31個重復)，e545g(2個重復)；l5_65(50℃-127％)-d200n(30個重復)，q238h(1個重復)，l570i(1個重復)，l603w(18個重復)；l5_68(50℃-153％)-m39v(2個重復)，i49v(2個重復)，q91r(2個重復)，h204r(7個重復)，t287a(6個重復)，n454k(2個重復)，f625l(5個重復)，d653h(23個重復)。突變蛋白的所測定rt活性和序列比對分析的組合數(shù)據(jù)組允許我們確定m-mulv逆轉錄酶序列中的許多有益突變(和其組合)。實施例3-莫洛尼氏鼠白血病病毒逆轉錄酶突變體的分析實施例2中所述的體外進化實驗是非常有效的。利用溫度逐漸增加的逆轉錄反應作為選擇壓力并且產生m-mulvrt的大量不同突變變體。與最初的酶相比，它們中的大多數(shù)在升高的溫度下能夠表現(xiàn)地更好。所進化的逆轉錄酶的序列分析指明了熱點和負責酶性質的復雜改善的最重要的氨基酸位置(置換)。為了闡明不同突變的個體影響，構建m-mulvrt的單突變體和多突變體，并對其部分純化和進行分析。突變體構建的起點是編碼m-mulvrt的7474bp質粒pet_his_mlv(seqidno：19)，具有用于使用親和色譜進行快速蛋白純化的n-末端標簽。確定37℃下m-mulv逆轉錄酶的比活性、50℃下的相對活性和在50℃下使酶溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留活性。在某些情況下檢查rna酶h活性，并在不同溫度下對1kb或4.5kbrna進行cdna合成反應。方法和材料使用起始質粒pet_his_mlv(seqidno：19)作為用于突變發(fā)生pcr的起始材料。使用突變發(fā)生引物引入突變。對個體克隆進行測序和分析。在t7表達菌株er2566中表達m-mulvrt突變體。使相同構建中個體蛋白和起始wtm-mulv逆轉錄酶在200mllb中生長至a590為～0.7，并通過使用2mlqiagen-ni-ntasuperflow樹脂的親和色譜利用his-標簽進行純化(根據(jù)供應商建議在天然條件下進行所有純化)。在1mleb(50mm—nah2po4，300mm—nacl，ph為8.0的250mm—咪唑，10mm—β-巰基乙醇和0.1％tritonx-100)中進行洗脫。以50倍過量的貯存緩沖液(50mmtris-hcl(在25℃下ph8.3)，0.1mnacl，1mmedta，5mmdtt，0.1％(v/v)tritonx-100和50％(v/v)甘油)對所有蛋白進行透析。在sds-page上檢查蛋白純度(通常為靶蛋白的～40％至80％)。使用bradford試劑(fermentas#r1271)確定蛋白濃度。在37℃、50℃下測定mlv逆轉錄酶的活性(將酶稀釋于特定的稀釋緩沖液中：30mm25℃下ph為8.3的tris-hcl，10mmdtt，0.5mg/mlbsa)，以及在50℃下使酶溫育5分鐘后在37℃下測定殘留活性(將酶稀釋，并在1xrt反應緩沖液：50mm25℃下ph為8.3的tris-hcl，4mmmgcl2，10mmdtt，50mmkcl中測定其穩(wěn)定性)。在以下最終混合物中檢測所有情況下的酶活性：50mmtris-hcl(25℃下ph為8.3)，6mmmgcl2，10mmdtt，40mmkc1，0.5mmdttp，0.4mbq/ml[3h]-dttp，0.4mmpolya·寡(dt)12-18。確定活性單位，測定在特定反應溫度下在10分鐘內dtmp在多核苷酸級分(在de-81上吸收)中的導入，并且與已知量的商業(yè)酶比較。根據(jù)美國專利us5405776測定m-mulv逆轉錄酶變體的rna酶h活性。在含有ph為8.3的50mmtris-hcl，2mmmncl2，1mmdtt和[3h](a)n*(dt)n(5μm[3h](a)n，35cpm/pmol；20μm(dt)n)的反應混合物(50μl)中檢測經純化酶的rna酶h活性。使反應在37℃下進行溫育10分鐘，并通過添加10μl的trna(1mg/ml)和20μl的冷50％tca而終止。在冰上10分鐘后，在eppendorf離心機中使混合物離心10分鐘(25000g)。在lsc-通用雞尾酒式混合物(lsc-universalcocktail)(roth-rotiszintecoplus)中對40μl上清液進行計量。1單位的rna酶h活性為：[3h](a)n*(dt)n中，在37℃下在10分鐘內使1摩爾[3h](a)n溶解所需的酶的量。使用"revertaidtmfirststrandcdnasynthesiskit"(#k1622-fermentas)及其對照1.1kb具有3'-poly(a)尾的rna和寡(dt)18引物來檢查經純化逆轉錄酶在不同溫度下合成cdna的能力。作為選擇，使用4.5kbrna(從eco31i線性化的ptz19r質粒合成，其另外含有λ噬菌體dna5505-8469bp的碎片)來測試逆轉錄反應。按照所提供的策略使用試劑盒組分1μg的合成rna，在20μl反應體積中進行1小時的cdna合成，不同之處在于僅一些小的改動(沒有在37℃下預溫育5分鐘)。在eppendorfmastercyclergradientpcr儀上使用相應的溫度梯度在96孔pcr板上進行逆轉錄反應。通過堿性瓊脂糖凝膠電泳(用溴化乙錠染色)分析所合成的cdna。在堿性瓊脂糖凝膠上cdna合成分析的樣品示于圖16。結果根據(jù)m-mulv逆轉錄酶進化期間的突變發(fā)現(xiàn)的頻率，將突變分成5類：21至31個重復；14至18個重復；4至7個重復；2至3個重復和1個重復。通常根據(jù)該信息進行個體逆轉錄酶突變體的構建。首先測試發(fā)現(xiàn)頻率最高的突變。確定37℃下逆轉錄酶的比活性、50℃下的相對活性和在50℃下使酶溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留活性。在某些情況下檢查rna酶h活性，并在不同溫度下對1kb或4.5kbrna進行cdna合成反應。關于個體突變體的所有實驗數(shù)據(jù)示于附錄5。第二列(“選擇頻率”)表示具有確切突變的測序突變體的數(shù)量，括號中的數(shù)字表示在選擇中發(fā)現(xiàn)的特定氨基酸突變的總數(shù)。例如d200n-25(30)表示：該天冬氨酸200替換成天冬酰胺在全部30個d200突變中發(fā)現(xiàn)25次。37℃下測定的逆轉錄酶比活性的以單位/mg蛋白給出。50℃下的相對酶活性和在50℃下溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留rt活性以相對于37℃下測定的相同酶的比活性(100％)標準化的百分比給出。作為對照(第1行)給出用于突變體文庫構建的wtm-mulv逆轉錄酶。該起始酶在與rt突變變體相同的載體中表達并以相同的方式進行純化。wt酶在37℃下的比活性為約200'000u/mg，在50℃下的相對活性(相對于37℃下的活性)-45-50％(90'000u/mg至100'000u/mg)，在50℃下溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留rt活性(相對于37℃下的活性)為約11％(～22'000u/mg)。野生型酶的rna酶h活性為約160u/mol至200u/mol，并且在48℃下可以合成全長1kbcdna。已知的是，m-mulv逆轉錄酶通過與模板-引物底物結合而避免熱失活，反之酶僅在溶液中的熱穩(wěn)定性較差(gerard等，2002)。在50℃下溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留rt活性直接表明在不含底物的溶液中的酶的熱穩(wěn)定性。同時50℃下的相對活性表示在具有rna/dna底物的復合物中酶的熱穩(wěn)定性和cdna合成的速度。逆轉錄酶的速度快的突變變體會在50℃下產生數(shù)量增加的聚合酶單位，即使其熱穩(wěn)定性與野生型酶相同。cdna合成(在我們的情況下為1kb或4.5kb)的最高溫度是最全面的參數(shù)，其表示酶于較高的溫度下合成cdna的一般能力。在37℃下的比活性(≥220'000u/mg，200'000u/mg-wt)、相對于37℃下的突變活性的在50℃下的相對活性(≥54％，45％至50％-wt)或相對于37℃下的突變活性的在50℃下溫育5分鐘后在37℃下的相對殘留活性(≥13％，11％-wt)增加至少10％的逆轉錄酶突變體，以灰色陰影表示，并認為是顯著改善的酶。能夠在高于48℃的溫度下合成全長lkbcdna的突變體也以灰色陰影表示。37℃下具有更高比活性(≥220'000u/mg)的逆轉錄酶是(附錄5)：d200(d200n-254'000u/mg；d200g-276'000u/mg；d200h-234'000u/mg),t330(t330n-223'000u/mg；t330d-240'000u/mg),q221(q221r-268'000u/mg),h594(h594k-270'000u/mg；h594q-231'000u/mg),d449(d449e-224'000u/mg；d449n-221'000u/mg),m39(m39n-349'000u/mg),m66(m66l-237'000u/mg；m66v-227'000u/mg；m66i-240'000u/mg),h126(h126r-227'000u/mg),w388(w388r-266'000u/mg),i179(i179v-251'000u/mg).50℃下具有更高相對活性(≥54％)的逆轉錄酶(與37℃下的活性相比)是(附錄5)：d200(d200n-84％；d200a-87％；d200q-103％；d200e-79％；d200v-131％；d200w-103％；d200g-88％；d200k-102％；d200r-68％；d200h-54％),l603(l603w-105％；l603f-104％；l603y-95％；l603m-77％),d653(d653n-93％；d653k-106％；d653a-99％；d653v-98％；d653q-93％；d653l-83％；d653h-116％；d653g-90％；d653w-93％；d653e-80％),t330(t330p-80％；t330n-69％；t330d-55％；t330v-65％；t330s-67％),q221(q221r-94％；q221k-77％；q221e-64％；q221m-58％；q221y-77％),e607(e607k-84％；e607a-98％；e607g-72％；e607d-69％),l139(l139p-59％),t287(t287s-68％),n479(n479d-81％),h594(h594r-69％；h594k-80％；h594q-75％；h594n-61％),d449(d449g-79％；d449e-77％；d449n-75％；d449a-99％；d449v-83％),m39(m39v-54％；m39n-71％),m66(m66l-79％；m66v-73％；m66i-80％),l333(l333q-54％),h126(h126r-58％)，p130(p130s-70％)，q91(q91r-56％)，w388(w388r-72％)，r390(r390w-64％)，q374(q374r-56％)，e5(e5k-67％).在50℃下溫育5分鐘后在37℃下具有增加的相對殘留rt活性(≥13％)的逆轉錄酶(與37℃下的活性相比)是(附錄5)：d200(d200n-15％；d200a-18％；d200q-23％；d200r-27％；d200h-27％),l603(l603w-23％；l603y-13％；l603p-15％),d653(d653n-21％；d653k-15％；d653a-18％；d653v-16％；d653q-18％；d653h-13％；d653g-13％；d653w-13％；d653e-19％),t330(t330p-21％；t330n-13％；t330d-16％；t330s-15％),t287(t287a-13％；t287f-13％),h594(h594r-14％；h594q-13％),d449(d449g-13％),m39(m39v-13％),m66(m66l-13％),y344(y344h-13％),q91(q91r-13％),n649(n649s-16％),w388(w388r-14％).能夠在高于48℃的溫度下合成全長lkbcdna的突變體是(附錄5)：d200(d200n-50.4℃；d200h-50.4℃),l603(l603w-53.1℃；l603f-50.4℃；l603y-47.8℃至50.4℃),d653(d653n-50.4℃至53.1℃；d653k-50.4℃至53.1℃；d653a-50.4℃；d653v-50.4℃；d653q-50.4℃；d653l-50.4℃；d653h-50.4℃至53.1℃；d653g-50.4℃；d653w-50.4℃),q221(q221r-50.4℃),e607(e607k-47.8℃至50.4℃),h594(h594k-47.8℃至50.4℃；h594q-47.8℃至50.4℃)在堿性瓊脂糖凝膠上進行的1kbcdna合成分析的樣品示于圖16a-d。根據(jù)收集的生化數(shù)據(jù)，m-mulv逆轉錄酶序列中可以影響較高溫度下cdna合成的最重要的位置是：d200、l603、d653、t330、q221、e607、l139、t287、n479、h594、d449、m39、m66、l333、h126、y344、p130、q91、n649、w388、r390、1179、q374、e5。通常，可以對目的突變進行組合，進一步改善具有或不具有底物的m-mulv逆轉錄酶熱穩(wěn)定性結合、速率、持續(xù)性和較高溫度下合成cdna的總體能力。表明通過組合途徑改善酶的一些數(shù)據(jù)示于附錄6。單突變d200n和l603w在50℃下具有的相對活性為84％和105％。1kbcdna合成的最高溫度為50.4℃和53.1℃。雙重突變體d200n；l603w在50℃下的相對活性為131％，并且可以在56℃下合成1kbcdna。三重突變體d200n；l603w；t330p(在50℃下相對活性為80％；在47.8℃下合成1kbcdna)得到進一步改善并在50℃下具有175％的相對活性，并且可以在56℃至58℃下合成1kbcdna。四重突變體d200n；l603w；t330p；e607k(在50℃下相對活性為84％；在47.8℃至50.1℃合成下1kbcdna)在50℃下具有174％的相對活性，并且可以在60℃至62℃下合成1kbcdna。五重突變體d200n；l603w；t330p；e607k；l139p(在50℃下相對活性為59％；在47.8℃下合成1kbcdna)在50℃下具有176％的相對活性，并且可以在62℃下合成1kbcdna，該溫度比野生型m-mulv逆轉錄酶(在47.8℃下合成lkbcdna)的溫度高約14℃。在以下情況下也觀察到熱穩(wěn)定性的加和特征：n479d，h594r突變體(d200n；l603w-50℃下相對活性為131％，在56℃下合成lkbcdna，而d200n；l603w；n479d；h594r-在50℃下相對活性為182％，在56℃至58℃下合成lkbcdna，在56℃至58℃下合成4.5kbcdna)，t330p突變體(d200n；l603w；d653n；d524g-在50℃下相對活性為155％，在58℃至60℃下合成lkbcdna，而d200n；l603w；d653n；d524g；t330p-在50℃下相對活性為180％，在60℃至62℃下合成lkbcdna)。在堿性瓊脂糖凝膠上進行的4.5kbcdna合成分析的樣品示于圖16e-g。實施例4-crd的改進-使用生物素dutp選擇dna依賴性dna聚合酶活性(原理證明)該實施例闡釋了作為dna依賴性dna聚合酶的逆轉錄酶的基于活性的選擇策略，該酶能夠將修飾的核苷酸引入到dna-dna底物中。選擇的原理性示意圖圖示于圖12。使用兩個質粒pet_his_mlv_d583n_pd(編碼減去rna酶h的與蛋白d間隔子融合的莫洛尼氏鼠白血病病毒)及其衍生物pet_his_del_pd(編碼失活的逆轉錄酶；pol結構域中57個氨基酸缺失，并且rna酶h結構域中存在突變d583n，實施例1，seqidno:2)作為該實施例的起始材料。使用質粒pet_his_mlv_d583n_pd和pet_his_del_pd作為靶，在兩個單獨的聚合酶鏈式反應中合成起始的編碼活性逆轉錄酶和失活逆轉錄酶的dna片段。所合成的pcr片段用于合成mrna的轉錄反應，所述mrna的3'末端缺乏終止密碼子。將經純化的mrna以1：20＝mlv(活性rt)：del(失活rt)的比例混合。通過t4dna連接酶將雙鏈dna銜接體(選擇dna依賴性dna聚合酶活性所需)連接到3'mrna。該mrna/dsdna復合物用于體外翻譯反應。沿著mrna移動的核糖體在rna-dna雜交的位點停止翻譯(tabuchi等，2001)。通過用冰冷的含有50mmmg2+的緩沖液稀釋翻譯混合物，從而使核糖體-mrna/dsdna-蛋白復合物穩(wěn)定化(與常規(guī)的核糖體展示一樣)。通過蔗糖墊超速離心對三元復合物(tc)的混合物進行純化。使用含有與體外翻譯的m-mulv(rna酶h-)逆轉錄酶連接的mrna-dsdna的經純化的三元復合物(取<3×109個分子)來制備反應混合物，該反應混合物另外補充有生物素-dutp和反應緩沖液。對冰冷的rt反應混合物進行乳化，產生～l×1010個大小為～2μm的油包水區(qū)室。在37℃下使乳化的反應混合物(小于一個tc,核糖體-mrna/dsdna-蛋白/區(qū)室)溫育30分鐘。區(qū)室化反應混合物的溫度升高后，大多數(shù)tc解離，釋放mrna/dsdna和逆轉錄酶。僅在含有活性m-mulv(rnaseh-)逆轉錄酶的區(qū)室中可以發(fā)生成功的引入反應，導致mrna/dsdna復合物的生物素化。使生物素化的復合物選擇性地固定于鏈親和素包被的磁珠上，并通過rt-pcr特異性擴增。作為成功實驗的結果，編碼活性酶的基因(在我們的情況下為mlv_d583n_pd逆轉錄酶的rt-pcr片段)應該相對于編碼失活酶(del_pd)的基因富集。方法和材料mrna/dsdna復合物的制備(1)連接效率的確定。通過使用ddc-long2引物(seqidno:22)引物作為夾板序列(splint)將mlv_pdmrna(從pet_his_vllv_pd質粒合成，實施例1)與引物long+tb(seqidno:23)連接，從而確定連接反應的效率。預先使用t4多核苷酸激酶(fermentas)將long+tb的5'末端磷酸化。通過將8.5pmol(～10μg)的經純化mlv_pdmrna與摩爾數(shù)4倍過量的long+tb(seqidno:23)以及摩爾數(shù)4.2倍過量的ddc-long2(seqidno:22)于不含核酸酶的水中混合，制備36μl的退火混合物。在70℃下使混合物溫育5分鐘，然后冷卻至室溫20分鐘。添加連接反應組分之前，將混合物移到冷卻臺2分鐘。向36μl的退火混合物中添加4.5μl的10x連接緩沖液和4.5μl的t4dna連接酶(5v/μl)(fermentas)。在37℃下使連接反應進行30分鐘，隨后用等體積的苯酚/氯仿(roth)提取1次，并用等體積的氯仿提取兩次。假設mrna的量接近于為連接反應而取的起始量，利用不含核酸酶的水將～5μg的連接產物混合物稀釋到43μl。在固定于dynabeadsm-280鏈親和素珠(kilobasebindertmkit(dynalbiotech))上之前，留出2μl所得混合物的等分試樣以用于在瓊脂糖凝膠上的分析。將10μl再懸浮的dynabeads轉移到1.5ml微量離心管中，用50μl試劑盒中所提供的結合溶液洗滌。將試管置于磁體上1分鐘至2分鐘直到珠于所述試管中沉淀，并且除去溶液。通過吹吸在38μl的補充有2μltrna(來自酵母的trna(roche))水溶液(lμg/μl)的結合緩沖液中溫和地使dynabead再懸浮，從而使得非特異性mrna結合最小化。向含有連接產物混合物的溶液(～40μl)中添加40μl在結合溶液中的dynabead。在+22℃下在熱混合器(eppendorf)中振搖60分鐘，對試管進行溫育。與所連接的mrna/dsdna結合后，除去上清液，并將所述珠用50μl洗滌液(試劑盒中提供)洗滌3次。使得所收集的具有固定物(連接mrna/dsdna復合物)的dynabead再懸浮于26μl不含核酸酶的水，隨后用40μl的苯酚/氯仿(roth)提取1次，并用40μl體積的氯仿提取兩次，從而使mrna/dsdna復合物從磁珠釋放。將1、2和5μl最終混合物與進行固定之前留出的樣品(2μl)和massrulertm高范圍dnaladder一起在瓊脂糖凝膠上分析。確定在鏈親和素珠上純化的mrna/dna復合物中mrna的量，比較固定前后的mrna的量。mrna的回收率為～60％，這意味著至少60％的mrna與dna雙鏈成功連接，產生mrna/dsdna復合物。(2)確定生物素-dutp導入到mrna/dsdna復合物和導入到自引導mrna中的效率。如第一次mrna與dsdna連接實驗所示，連接反應效率為～60％以上。連接混合物中剩下的游離mrna可以自引導，并參與使用m-mulv逆轉錄酶和生物素-dutp的延伸反應。進行該實驗，從而證明mrna/dsdna復合物(連接產物)是比游離的自引導mrna更好的底物。按照上述方法將mlv_d583n_pdmrna與long+寡核苷酸(seqidno:21)連接(起始質粒pet_his_mlv_d583n_pd和pet_his_del_pd的構建詳細地描述于實施例1)。將～12,5ng制備的(mlv_d583n_pdmrna/long+)底物與預先在70℃下溫育5分鐘的～12,5ngng的del_pdmrna混合，然后在不含核酸酶的水中冷卻至室溫20分鐘，總體積為12.5μl。制備用于通過逆轉錄酶導入dttp或生物素-dutp的第二混合物：8μl5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液；1μl—40u/μlribolocktmrna酶抑制劑(fermentas)；18.6μl不含核酸酶的水；0.4μl—200u/μlrevertaidtmminusm-mulv逆轉錄酶(fermentas)。將所制備的混合物分成2x15μl兩試管，并添加1μl的1mmdttp(fermentas)或1μl的1mm生物素-dutp(fermentas)。隨后向含有dttp和生物素-dutp的混合物中添加5μl底物(來自第一混合物)。在37℃下使反應進行60分鐘。然后向兩個樣品添加1μl0.5medta(ph8.0)，對反應混合物用等體積的苯酚/氯仿(roth)提取1次，用等體積的氯仿提取1次，然后在g-50微柱(gehealthcare)上進行純化。留下2μl所得反應產物用于直接rt反應(無進行鏈親和素珠純化)，并將剩余部分的溶液用于生物素化mrna-dsdna復合物在dynabeadsm-280鏈親和素珠(kilobasebindertmkit(dynalbiotech))上的固定。將10μl再懸浮的dynabead轉移到1.5ml微量離心管，用25μl所提供的結合緩沖液洗滌。將試管置于磁體上1分鐘至2分鐘直到珠沉淀在所述試管的底部，并且除去溶液。通過吹吸在90μl結合緩沖液中溫和地使dynabead再懸浮，并添加2μltrna(來自酵母的trna(roche))水溶液(lμg/μl)，從而使得非特異性mrna結合最小化。向含有延伸有通過dttp和生物素-dutp延伸的rna-dna片段的溶液(～40μl)中添加40μl在結合溶液中的40μldynabead。通過振搖(1400rpm)，使得試管在+22℃下在熱混合器(eppendorf)中溫育40分鐘。結合步驟后，除去上清液，并用50μl洗滌液(試劑盒中提供)在+22℃下振搖(1400rpm)5分鐘，對所述珠進行洗滌3次。使所收集的具有固定物(延伸mrna-dsdna復合物)的延伸mrna-dsdna復合物的dynabead再懸浮于逆轉錄反應混合物中。在冰上制備逆轉錄反應混合物：20μl-5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液(fermentas)；10μl-10mmdntp(fermentas)；2.5μl-40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；5μl-20μmpd_42寡核苷酸(seqidno:8)；2,5μlrevertaidtmminusm-mulv逆轉錄酶(200u/μl)(fermentas)；55μl不含核酸酶的水。將所制備的混合物分成5個19μl(5x19μl)的等分試樣。：兩個用于再懸浮使具有固定的延伸的mrna/dsdna復合物或mrna的dynabead再懸浮，將另兩個轉移到具有未進行鏈親和素珠純化的所留樣品的試管，向剩下的19μl等分試樣中添加1μl不含核酸酶的水-陰性反應對照，用于證明反應混合物未受到dna污染。通過在+42℃下在熱混合器(eppendorf)中振搖(1000rpm)1小時，使對所有反應混合物進行溫育，直到cdna合成反應結束。通過巢式pcr進行cdna的擴增。在冰上制備起始pcr混合物：14μl-10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；14μl-2mm各dntp(fermentas)；8.4μl-25mmmgcl2(fermentas)；2.8μl-1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；0.7μl-100μmm_f引物(seqidno:11)；0.7μl-100pmm_2r引物(seqidno:12)；92.4μl水—將混合物分成7個19μl的樣品(7x19μl)。向5x19μl的pcr主混合物中添加1μl的cdna(rt樣品1至5)；向第6管pcr主混合物中添加1μl的水-陰性pcr對照；向第7管(陽性pcr對照)-添加1μl的pet_his_mlv_d583n_pd質粒(～1ng)。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，25個循環(huán)(94℃下45秒鐘，57℃下45秒鐘和72℃下1分鐘)和最后在72℃下延伸3分鐘。對于mlv_d583n_pd，預測的擴增子大小為907bp，對于del_pdcdna，預測的大小為736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上分析pcr產物(圖13)。如所預期的，僅在使用生物素-dutp的延伸反應中觀察到有效的cdna擴增。在使用dttp的延伸反應中可以檢測到所擴增cdna的非常微弱的帶，并且可以解釋為mrna與鏈親和素珠的弱的非特異性結合。在鏈親和素珠上純化后，編碼mlv_d583n_pd基因(907bp)的dna相對于del_pd(736bp)的dna富集。這意味著mrna/dsdna復合物通過生物素-dutp的延伸比自引導del_pdmrna要有效的多。(3)mrna混合物(mlv_d583n_pd:del_pd＝l:20)和rna/dsdna復合物的制備。用于體外轉錄的pcr片段的制備。在冰上制備pcr混合物：20μl-10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；20μl-2mm的各dntp(fermentas)；12μl-25mmmgcl2(fermentas)；16μl-dmso(d8418-sigma)；4μl-1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1μl-100μmpro-pivex引物(seqidno:3)；1μl-100μmpd-ter引物(seqidno:20)；122μl水—將混合物分成2x98μl的兩試管。向2x98μl的pcr主混合物中添加2μlpet_hisjvilv_d583n_pd(稀釋至～1ng/μl)或2μlpet_his_del_pd(稀釋至～1ng/μl)(起始質粒pet_his_mlv_d583n_pd和pet_his_del_pd的構建詳細地描述于實施例1)。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，30個循環(huán)(94℃下45秒鐘，53℃下45秒鐘和72℃下2分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。從2ng質粒(7873bp)至～5μg(50ng/μl)擴增產物(來自pet_his_mlv_pd的2702bppcr片段mlv_d583n_pd；來自pet_his_del_pd的2531bppcr片段)，擴增效率為～7000倍。制備轉錄混合物：80μl–5xt7轉錄緩沖液(1mhepes-kohph7.6；150mm乙酸鎂；10mm亞精胺；0.2mdtt)；56μl–112mm各ntp(fermentas)；16μl-20u/μlt7rna聚合酶(fermentas)；8μl-40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；114μl不含核酸酶的水—將混合物分成2x165μl兩試管，并且添加35μl-20ng/μl的pcr片段mlv_d583n_pd(未經純化的pcr混合物)或35μl-20ng/μl的pcr片段del_pdpcr(未經純化的pcr混合物)。轉錄在37℃下進行2小時。用冰冷的不含核酸酶的水將兩種轉錄混合物都稀釋到200μl，并且添加200μl的6mlicl溶液。將混合物在+4℃下溫育25分鐘，在+4℃下于冷卻的離心機中以最大速度(25'000g)離心25分鐘。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將試管在+4℃下以最大速度離心5分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊干燥5分鐘，并隨后通過在+4℃和1400rpm下振搖15分鐘使其再懸浮于400μl不含核酸酶的冰冷的水中。再次將試管在+4℃下以最大速度離心5分鐘，以分離未溶解的rna。將約380μl的上清液移到具有42μl10xdna酶i緩沖液(mg2+)(fermentas)；3μl-1u/μl的dna酶i(不含rna酶)(fermentas)的新試管中，并且在37℃下溫育20分鐘，從而降解dna。對反應混合物用等體積的苯酚/氯仿(roth)提取1次，用等體積的氯仿提取2次，從而除去dna酶i。向各試管添加43μlph為5.0的3m乙酸鈉溶液和1075μl冰冷的96％乙醇。最后通過在-20℃下溫育30分鐘，并在+4℃下以最大速度(25'000g)離心25分鐘使rna沉淀。棄去上清液，用500μl冰冷的75％乙醇洗滌rna團塊。再次將試管在+4℃下以最大速度離心4分鐘，并棄去上清液。在室溫下對rna團塊干燥5分鐘，并隨后通過在+4℃下振搖(1400rpm)15分鐘使其再懸浮于150μl不含核酸酶的冰冷的水中。將rna溶液等分為10μl，并用液氮冷凍。用分光光度法測定mrna濃度，并在與riborulertmrnaladder,高范圍(fermentas)一同進行的瓊脂糖凝膠上復核。通過使用ddc-long2寡脫氧核苷酸作為夾板將long+寡脫氧核苷酸與mrna連接，從而產生mrna/dsdna復合物。使用t4多核苷酸激酶(fermentas)使long+的5'末端預先磷酸化。寡脫氧核苷酸ddc-long2具有3'末端修飾(ddc)，從而防止逆轉錄酶對其天然rna-dna底物的3'末端延伸的可能性。通過將17pmol比例為1:20＝mlv_d583n_pd(活性rt)：del_pd(失活rt)的經純化mrna混合物與在不含核酸酶的水中的摩爾數(shù)4.3倍過量的long+和摩爾數(shù)4.1倍過量的ddc-long2混合，制備50μl的退火混合物。在70℃下使所述混合物溫育5分鐘，然后冷卻至室溫20分鐘。添加連接反應組分之前，將混合物移到冷卻臺2分鐘。向40μl的退火混合物中添加5μl的10x連接緩沖液和5μl的t4dna連接酶(5v/μl)(fermentas)。使用在無t4dna連接酶的lx連接緩沖液中的相同退火混合物進行陰性連接反應。在37℃下使制備的連接反應混合物溫育30分鐘。為了終止連接，向兩個試管添加1μl的0.5medta(ph8.0)，并對反應混合物用等體積的苯酚/氯仿(roth)提取1次，并用等體積的氯仿提取兩次，然后在30℃下在真空濃縮器5301(eppendorf)中對反應產物濃縮10分鐘。使用illiustraprobequantg-50微柱(gehealthcare)進行脫鹽。通過利用riborulertmrnaladder,高范圍(fermentas)進行的瓊脂糖凝膠確定連接產物的濃度-與long+/ddc-long2寡脫氧核苷酸連接的mrna混合物(mlv_d583n_pd:del_pd＝l:20)～0.24μg/μl(具有t4dna連接酶的樣品)，和具有l(wèi)ong+/ddc-long2寡脫氧核苷酸的簡單mrna混合物～0.06μg/μl(無t4dna連接酶的樣品)。(4)通過引入[α-p33]datp獲得的mrna/dsdna復合物的一般對照。測試所制備的mrna/dsdna復合物(底物)的通過逆轉錄酶進行的dttp(或生物素-dutp)以及隨后[α-p33]datp導入。反應混合物：16μl5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液；4μl-40u/μlribolocktmrna酶抑制劑(fermentas)；2μl[α-p33]datp(10mci)/ml，srf-203(hartmannanalytic))；35μl不含核酸酶的水；lμl-200u/μlrevertaidtmminusm-mulv逆轉錄酶(fermentas)。將所制備的混合物分成2x28μl的兩試管，并添加2μl1mmdttp(fermentas)或2μl1mm生物素-dutp(fermentas)。將所得混合物分成2x15μl的兩試管。向第一管添加1.25μl(～0.3μg)連接產物和3.75μl不含核酸酶的水。向第二管添加5μl(～0.3μg)陰性連接反應產物。使反應混合物在37℃下溫育30分鐘。然后，向所有試管添加1μl0.5medta(ph8.0)，對反應混合物用等體積的苯酚/氯仿(roth)提取1次，用等體積的氯仿提取1次，然后在illiustrag-50微柱(gehealthcare)上進行純化。在利用riborulertmrnaladder,高范圍(fermentas)進行的瓊脂糖凝膠上分析反應產物(圖14a)。在所有樣品(具有或不具有連接酶)中我們可以看到del_pdmrna的離散的帶(～2500b)(比在mrna混合物中存在的不能被區(qū)分的mlv_d583n_pdmrna～2700b的量小20倍)。隨后在濾紙上對瓊脂糖凝膠進行干燥，并且僅在陽性連接樣品(具有連接酶)的情況下檢測放射性標記的mrna/dsdna復合物(在與mrna相同的位置)，而在陰性連接樣品(不具有連接酶)的情況下不進行檢測(圖14b)。(5)使用生物素-dutp對dna依賴性dna聚合酶活性進行的選擇。將之前制備的mrna/dsdna復合物(mrna混合物mlv_d583n_pd(活性rt)：del_pd(失活rt)＝l：20)用于使用合成wakopure系統(tǒng)(295-59503-wako)的體外翻譯。用于wakopure的翻譯混合物(25μl)：12,5μl–a溶液(wako)；5μl–b溶液(wako)；0,5μl–40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；0.25μl–1mdtt；1,75μl不含核酸酶的水和5μl–0.24μg/μlmrna/dsdna底物(～1200ng)。在37℃下進行體外翻譯120分鐘。通過添加155μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(25℃下ph為7.5的50mmtris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)–tritonx-100(t8787-sigma))終止翻譯物(～25μl)，并在+4℃和25'000g下離心5分鐘。非常仔細地將160μl經離心的翻譯混合物轉移到透明的1ml超速離心管(343778-beckman)中至840μl35％的蔗糖在wbk500+dtt+tritonx-100中的溶液(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)–tritonx-100(t8787-sigma)；35％(w/v)–蔗糖(84097-fluka))的頂部。通過在+4℃下以100,000rpm在tl-100beckman超速離心機中用tla100.2固定角轉頭(beckman)進行超速離心9分鐘，對由mrna/dsdna-核糖體-蛋白(trna)組成的三元復合物(tc)進行純化。最初從離心管的最上部移出750μl溶液。然后(非常仔細地使位于超速離心管底部的tc的小透明團塊保持完整)用750μlwbk500(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1)洗滌管壁。最后從離心管的最上部開始移出所有溶液，并且將團塊溶解于30μl冰冷的終止緩沖液wbk500+dtt+triton(50mm在25℃下ph為7.5的tris-乙酸鹽；50mmnacl；50mm乙酸鎂；500mmkc1；10mmdtt；0.1％(v/v)-tritonx-100(t8787-sigma))中。如超速離心后使用放射性標記的mrna所確定，5％至30％輸入的mrna位于三元復合物團塊中。因此據(jù)預測在30μl緩沖液中具有低于360ng(翻譯反應中所用的1200ngmrna的30％)的mrna(～12ng/μl或9×109個分子/μl的三元復合物)。在冰上通過將以下成分混合而制備導入經修飾核苷酸的反應混合物：5μl-5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液(fermentas)；1.25μl-40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；2.5μl–1mm生物素-dutp(fermentas)；40.95μl不含核酸酶的水和0.3μl經純化的(<2.7×109個分子)tc。根據(jù)所述方案，50μl的核苷酸導入反應混合物含有<2.7×109個分子的三元復合物。通過將abilem90(goldschmidt)混入礦物油(m5904-sigma)至終濃度4％(v/v)來制備油-表面活性劑混合物(ghadessy和holliger，2004；us2005064460)。通過將950μl油-類表面活性劑混合物與50μlrt混合物混合，在+4℃下在5ml冷凍小瓶(cryogenicvial)(430492-corning)中制備乳液。使用速度控制在～2100rpm的ms-3000磁力攪拌器、具有中心環(huán)的-(3x8mm)磁棒(1489.2-roth)進行混合；每30秒鐘向水相添加10μl等分試樣，繼續(xù)混合另外2分鐘(總混合時間-4分鐘)。根據(jù)光學顯微鏡數(shù)據(jù)，所制備乳液中的區(qū)室大小為0.5μm～10μm，平均直徑為～2μm。因此據(jù)預期對含有低于2.7×109個分子的三元復合物的50μl逆轉錄反應混合物進行乳化后具有～l×1010個油包水區(qū)室(約1個mrna-dsdna復合物和逆轉錄酶分子/3至4個區(qū)室)。使所制備的乳液在+37℃下溫育30分鐘。為了從乳液中回收反應混合物，向乳液添加20μl0.1medta，攪拌10秒鐘，然后添加50μl苯酚/氯仿混合物，并攪拌另外10秒鐘。然后，將乳液轉移到1.5ml微量離心管，添加0.5ml水飽和的醚，通過渦旋混合，并在室溫下以16'000g離心10分鐘。除去油-醚相，在試管底部留下濃縮(但仍完整)的乳液。最后通過用0.9ml水飽和的醚提取；0.9ml水飽和的乙酸乙酯(為了除去abilem90洗滌劑)提?。挥?.9ml水飽和的醚提取2次將乳液破乳。在室溫下對水相真空干燥12分鐘，然后在illiustraprobequantg-50微柱(gehealthcare)上除去導入的核苷酸。留出所得混合物的2μl等分試樣用于直接rt反應(未進行鏈親和素珠純化)，并將溶液的其余部分用于生物素化mrna-dsdna復合物在dynabeadsm-280鏈親和素珠(dynalbiotech)上的固定。根據(jù)所提供的產品說明書，使用kilobasebindertmkit(dynalbiotech)來分離生物素化mrna-dsdna復合物。將5μl再懸浮的dynabead轉移到1.5ml微量離心管，用20μl所提供的結合緩沖液洗滌。將試管置于磁體上1分鐘至2分鐘直到珠在所述試管中沉淀，并且除去溶液。通過移液在50μl結合緩沖液中溫和地使dynabead再懸浮，并添加1μltrna(來自酵母的trna(roche))水溶液(lμg/μl)，從而使得非特異性mrna結合最小化。向含有生物素化rna-dna片段的溶液(～50μl)中添加50μl在結合緩沖液中的dynabead。使試管在+22℃下在熱混合器(eppendorf)中振搖溫育1小時。mrna/dsdna結合后，從所述珠中除去上清液，并在+22℃下用50μl的洗滌液(試劑盒中提供)振搖(1400rpm)5分鐘對所述珠洗滌2次，并在+22℃下用50μl的洗滌液振搖(1400rpm)12分鐘對所述珠洗滌1次。使所收集的具有所固定的生物素化mrna-dsdna復合物的dynabead再懸浮于逆轉錄反應混合物中。在冰上制備用于所選擇的mrna/dsdna復合物的逆轉錄反應混合物：12μl-5x用于逆轉錄酶的反應緩沖液(fermentas)；6μl-10mmdntp(fermentas)；1.5μl-40u/μlribolockrna酶抑制劑(fermentas)；0.3μl-20μmpd_42寡核苷酸(seqidno:8)；1.5μlrevertaidtmminusm-mulv逆轉錄酶(200u/μl)(fermentas)；35.7μl不含核酸酶的水。將所制備的混合物分成3個19μl的等分試樣：一個用于使具有固定的生物素化mrna/dsdna復合物的dynabead再懸浮，將另一個19μl等分試樣轉移到具有留出的未進行鏈親和素珠純化的延伸mrna/dsdna復合物樣品的試管，向剩下的19μl等分試樣中添加1μl不含核酸酶的水(陰性反應對照-用于證明反應混合物未受到污染)。通過+42℃下在熱混合器(eppendorf)中振搖(1000rpm)1小時，使所有反應混合物進行溫育。通過巢式pcr進行cdna的擴增。在冰上制備起始pcr混合物：10μl-10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；10μl-2mm各dntp(fermentas)；6μl-25mmmgcl2(fermentas)；2μl-1u/μllc(重組)taqdna聚合酶(fermentas)；1μl-2.5u/μlpfudna聚合酶(fermentas)；0.5μl-100μmrd_nde引物(seqidno:9)；0.5μl-100pmpd_55引物(seqidno:10)；65μl水-–將混合物分成5個19μl的樣品(5x19μl)。向3x19μl的pcr主混合物中添加1μlcdna(rt樣品1至3)；向一個具有19μl的pcr主混合物的試管中添加1μl水-陰性pcr對照。對于陽性pcr對照，添加1μl的pet_his_mlv_pd質粒(～1ng)。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，30個循環(huán)(94℃下45秒鐘，58℃下45秒鐘和72℃下3分鐘)和最后在72℃下延伸5分鐘。在冰上制備用于部分基因擴增(為了更好地分辨rt樣品中mlv_d583n_pd:del_pdcdna的比例)的巢式pcr混合物：20μl-10x含有kcl的taq緩沖液(fermentas)；20μl-2mm各dntp(fermentas)；12μl-25mmmgcl2(fermentas)；0.9μl-5u/μltaqdna聚合酶(fermentas)；1.0μl-100μmm_f引物(seqidno:11)；1.0μl-100μmm_2r引物(seqidno:12)；135.1μl水–將混合物分成5x38μl。向所制備的巢式pcr混合物添加2μl第一次pcr(引物組rd_nde//pd_55)產物。將mastermix再次混合，并分成兩試管(2x20μl)以用于30個或35個pcr循環(huán)擴增。循環(huán)方案為：在94℃下進行起始變性步驟3分鐘，30或35個循環(huán)(94℃下45秒鐘，57℃下45秒鐘和72℃下1分鐘)和最后在72℃下延伸3分鐘。對于mlv_d583n_pd，pcr片段的預期長度是907bp，對于del_pd是736bp。在每孔加載10μlpcr混合物的1％瓊脂糖凝膠上對擴增進行分析(圖15)。結果1.使用t4dna連接酶將雙鏈(dsdna)銜接體成功地連接到mrna。如通過dsdna-生物素銜接體的連接所確定的，連接效率是約60％?？梢栽阪溣H和素珠上對mrna/dsdna復合物進行特異性純化，提供了分辨生物素標記的底物和未標記的底物的機會。與mrna/dsdna相比，游離mrna對于dna依賴性dna聚合酶是差得多的底物。因此，dsdna與mrna的60％連接效率足夠良好，并且所述底物可以成功地用于進化流程。2.進行使用mrna/dsdna復合物(mrna混合物mlv_d583n_pd:del_pd＝l:20)的一般選擇實驗。使用wakopure蛋白翻譯系統(tǒng)進行體外翻譯，并且進行區(qū)室化生物素-dutp導入到dsdna的反應，以證明編碼活性逆轉錄酶的基因(mlv_d583n_pd)相對于編碼失活酶的基因(del_pd)的富集。根據(jù)選擇流程(圖12)，生物素-dutp的導入反應應該僅發(fā)生在含有活性(mlv_d583n_pd)逆轉錄酶的水性區(qū)室中，導致mrna/dsdna復合物的生物素化。通過使生物素化的復合物與固定在磁珠上的鏈親和素結合，從而選擇dna依賴性dna聚合酶，然后通過rt-pcr對所選擇的基因進行擴增。編碼活性酶的基因(在我們的情況下是mlv_d583n_pd逆轉錄酶的rt-pcr片段)相對于編碼失活酶的基因富集(圖15)?；騧lv_d583n_pd：del_pd的起始比例為1：20，最終比例(富集后)是～1：1。個別地，在該特定實驗中富集倍數(shù)是～20倍。不同實驗中計算的富集倍數(shù)是5～200。并且經確認可以應用區(qū)室化核糖體展示(crd)法的，通過經修飾核苷酸的導入選擇dna依賴性dna聚合酶?？梢粤⒓催M行常規(guī)dna依賴性dna聚合酶的選擇。生物素-dutp可以與不同的的目核苷酸類似物(包括具有3'修飾的核苷酸類似物)交換。將所述核苷酸類似物導入dna鏈后，3'末端被封閉，不能延長，并且會終止延伸反應。該方法用于邊合成邊測序(sbs)方案，并且利用區(qū)室化核糖體展示(crd)技術可以容易地對適合于sbs的dna聚合酶進行進化。附錄1附錄2附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄2續(xù)附錄3附錄3續(xù)附錄4位置524,總突變31,3個不同的氨基酸d->g,20個序列(7,10,l5_8,l5_13,l5_15,l5_29,l5_41,l5_43,l5_53,l5_82,l5_84,l5_88,l5_94,l5_99,l5_104,l5_106,l5_112,l5_114,l5_115,l5_117)d->a,10個序列(1,23,l5_6,l5_28,l5_49,l5_56,l5_62,l5_63,l5_64,l5_93)d->n,1個序列(30)位置200,總突變30,3個不同的氨基酸d->g,2個序列(l5_14,l5_115)d->a,3個序列(l5_13,l5_20,l5_30)d->n,25個序列(17,18,20,30,l5_11,l5_35,l5_37,l5_39,l5_43,l5_46,l5_47,l5_52,l5_55,l5_60,l5_64,l5_65,l5_72,l5_76,l5_85,l5_90,l5_92,l5_93,l5_96,l5_103,l5_112)位置653,總突變23,5個不同的氨基酸d->v,1個序列(l5_58)d->g,5個序列(l5_15,l5_40,l5_78,l5_92,l5_114)d->a,4個序列(11,l5_84,l5_97,l5_115)d->n,10個序列(5,l5_21,l5_43,l5_47,l5_51,l5_60,l5_69,l5_82,l5_111,l5_112)d->h,3個序列(l5_55,l5_68,l5_116)位置583,總突變21,4個不同的氨基酸d->e,1個序列(l5_13)d->g,7個序列(18,30,l5_16,l5_32,l5_41,l5_80,l5_95)d->a,3個序列(21,l5_85,l5_96)d->n,10個序列(17,l5_30,l5_37,l5_44,l5_46,l5_52,l5_53,l5_76,l5_101,l5_106)位置603,總突變18,2個不同的氨基酸l->w,17個序列(3,13,20,l5_3,l5_14,l5_20,l5_21,l5_24,l5_42,l5_57,l5_65,l5_66,l5_69,l5_82,l5_111,l5_118,l5_120)l->m,1個序列(l5_16)位置330,總突變15,1個不同的氨基酸t(yī)->p,15個序列(8,18,l5_13,l5_30,l5_35,l5_40,l5_43,l5_46,l5_52,l5_72,l5_78,l5_85,l5_90,l5_96,l5_112)位置139,總突變14,1個不同的氨基酸l->p,14個序列(5,8,18,l5_24,l5_32,l5_41,l5_53,l5_72,l5_73,l5_84,l5_88,l5_107,l5_115,l5_117)位置204,總突變7,1個不同的氨基酸h->r,7個序列(7,21,l5_49,l5_62,l5_63,l5_68,l5_101)位置221,總突變6,1個不同的氨基酸q->r,6個序列(3,23,l5_13,l5_20,l5_24,l5_118)位置287,總突變6,1個不同的氨基酸t(yī)->a,6個序列(8,l5_6,l5_49,l5_63,l5_68,l5_118)位置680,總突變6,2個不同的氨基酸r->p,1個序列(l5_6)r->a,5個序列(18,20,21,l5_4,l5_8)位置49,總突變5,2個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_69)i->v,4個序列(1,17,l5_57,l5_68)位置479,總突變5,1個不同的氨基酸n->d,5個序列(18,l5_30,l5_35,l5_44,l5_88)附錄4續(xù)位置594,總突變5,2個不同的氨基酸h->q,1個序列(l5_72)h->r,4個序列(1,l5_6,l5_28,l5_56)位置625,總突變5,2個不同的氨基酸f->s,3個序列(l5_28,l5_43,l5_112)f->l,2個序列(l5_68,l5_88)位置679,總突變5,2個不同的氨基酸s->f,1個序列(l5_32)s->p,4個序列(18,20,21,l5_8)位置65,總突變4,1個不同的氨基酸p->s,4個序列(17,l5_21,l5_101,l5_111)位置126,總突變4,2個不同的氨基酸h->s,2個序列(l5_37,l5_92)h->r,2個序列(l5_47,l5_84)位置333,總突變4,2個不同的氨基酸l->q,3個序列(l5_75,l5_79,l5_117)l->p,1個序列(l5_42)位置502,總突變4,1個不同的氨基酸a->v,4個序列(17,l5_1,l5_29,l5_78)位置607,總突變4,3個不同的氨基酸e->g,1個序列(l5_103)e->a,1個序列(l5_11)e->k,2個序列(8,l5_94)位置638,總突變4,1個不同的氨基酸h->r,4個序列(l5_21,l5_85,l5_96,l5_111)位置658,總突變4,2個不同的氨基酸k->q,1個序列(l5_3)k->r,3個序列(l5_24,l5_75,l5_79)位置8,總突變3,2個不同的氨基酸h->p,2個序列(l5_56,l5_115)h->r,1個序列(28)位置130,總突變3,1個不同的氨基酸p->s,3個序列(l5_13,l5_53,l5_82)位置233,總突變3,1個不同的氨基酸e->k,3個序列(l5_21,l5_107,l5_111)位置237,總突變3,1個不同的氨基酸q->r,3個序列(12,l5_43,l5_112)位置249,總突變3,1個不同的氨基酸n->d,3個序列(l5_1,l5_15,l5_114)位置283,總突變3,2個不同的氨基酸a->d,2個序列(5,l5_101)a->t,1個序列(l5_118)附錄4續(xù)位置307,總突變3,1個不同的氨基酸a->v,3個序列(l5_15,l5_73,l5_114)位置344,總突變3,1個不同的氨基酸y->h,3個序列(l5_9,l5_15,l5_114)位置407,總突變3,2個不同的氨基酸p->s,2個序列(l5_21,l5_111)p->l,1個序列(l5_9)位置428,總突變3,1個不同的氨基酸m->l,3個序列(3,13,l5_20)位置430,總突變3,1個不同的氨基酸q->r,3個序列(l5_44,l5_75,l5_79)位置449,總突變3,2個不同的氨基酸d->g,2個序列(l5_13,l5_30)d->a,1個序列(l5_61)位置644,總突變3,2個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_46)a->v,2個序列(23,28)位置649,總突變3,1個不同的氨基酸n->s,3個序列(l5_24,l5_75,l5_79)位置671,總突變3,1個不同的氨基酸l->p,3個序列(l5_30,l5_55,l5_72)位置673,總突變3,2個不同的氨基酸e->g,2個序列(l5_75,l5_79)e->k,1個序列(l5_114)位置678,總突變3,1個不同的氨基酸n->i,3個序列(18,20,21)位置5,總突變2,1個不同的氨基酸e->k,2個序列(l5_2,l5_55)位置11,總突變2,2個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_78)h->y,1個序列(l5_75)位置12,總突變2,2個不同的氨基酸e->v,1個序列(l5_39)e->a,1個序列(l5_20)位置14,總突變2,2個不同的氨基酸s->t,1個序列(l5_69)s->p,1個序列(l5_117)位置17,總突變2,1個不同的氨基酸p->s,2個序列(l5_15,l5_114)附錄4續(xù)位置39,總突變2,2個不同的氨基酸m->v,1個序列(l5_68)m->l,1個序列(l5_25)位置50,總突變2,1個不同的氨基酸i->v,2個序列(l5_49,l5_63)位置66,總突變2,1個不同的氨基酸m->l,2個序列(l5_58,l5_76)位置83,總突變2,1個不同的氨基酸d->n,2個序列(18,l5_9)位置91,總突變2,2個不同的氨基酸q->r,1個序列(l5_68)q->l,1個序列(l5_16)位置95,總突變2,1個不同的氨基酸n->s,2個序列(l5_20,l5_117)位置108,總突變2,1個不同的氨基酸d->e,2個序列(l5_15,l5_114)位置135,總突變2,1個不同的氨基酸l->p,2個序列(l5_9,l5_32)位置148,總突變2,1個不同的氨基酸v->m,2個序列(11,l5_78)位置166,總突變2,1個不同的氨基酸p->s,2個序列(l5_9,l5_81)位置179,總突變2,2個不同的氨基酸i->t,1個序列(21)i->v,1個序列(l5_47)位置184,總突變2,1個不同的氨基酸t(yī)->a,2個序列(l5_2,l5_71)位置194,總突變2,1個不同的氨基酸n->s,2個序列(l5_49,l5_63)位置197,總突變2,1個不同的氨基酸t(yī)->a,2個序列(l5_14,l5_115)位置199,總突變2,2個不同的氨基酸f->l,1個序列(l5_81)f->y,1個序列(l5_41)位置216,總突變2,1個不同的氨基酸d->g,2個序列(l5_64,l5_93)位置289,總突變2,2個不同的氨基酸m->v,1個序列(l5_76)m->l,1個序列(l5_71)附錄4續(xù)位置302,總突變2,1個不同的氨基酸e->k,2個序列(l5_25,l5_57)位置306,總突變2,2個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_28)t->m,1個序列(30)位置325,總突變2,1個不同的氨基酸y->h,2個序列(l5_75,l5_79)位置346,總突變2,1個不同的氨基酸e->d,2個序列(l5_41,l5_62)位置358,總突變2,2個不同的氨基酸g->w,1個序列(l5_115)g->v,1個序列(5)位置374,總突變2,1個不同的氨基酸q->r,2個序列(l5_52,l5_90)位置380,總突變2,1個不同的氨基酸v->a,2個序列(l5_3,l5_117)位置388,總突變2,1個不同的氨基酸w->r,2個序列(l5_23,l5_104)位置390,總突變2,1個不同的氨基酸r->w,2個序列(11,l5_23)位置391,總突變2,2個不同的氨基酸p->s,1個序列(l5_101)p->l,1個序列(l5_2)位置409,總突變2,1個不同的氨基酸c->r,2個序列(17,l5_1)位置417,總突變2,1個不同的氨基酸a->v,2個序列(l5_53,l5_84)位置431,總突變2,1個不同的氨基酸p->q,2個序列(l5_32,l5_51)位置433,總突變2,1個不同的氨基酸v->a,2個序列(7,l5_14)位置436,總突變2,1個不同的氨基酸a->t,2個序列(l5_9,l5_76)位置450,總突變2,1個不同的氨基酸r->h,2個序列(l5_41,l5_59)位置454,總突變2,1個不同的氨基酸n->k,2個序列(l5_37,l5_68)位置457,總突變2,2個不同的氨基酸m->t,1個序列(l5_18)m->r,1個序列(l5_66)附錄4續(xù)位置470,總突變2,1個不同的氨基酸v->a,2個序列(17,l5_1)位置478,總突變2,1個不同的氨基酸l->p,2個序列(l5_21,l5_111)位置491,總突變2,1個不同的氨基酸l->p,2個序列(l5_76,l5_84)位置494,總突變2,2個不同的氨基酸n->d,1個序列(l5_94)n->k,1個序列(l5_95)位置503,總突變2,1個不同的氨基酸h->r,2個序列(l5_40,l5_59)位置530,總突變2,1個不同的氨基酸q->h,2個序列(l5_61,l5_81)位置545,總突變2,1個不同的氨基酸e->g,2個序列(l5_64,l5_93)位置559,總突變2,2個不同的氨基酸q->p,1個序列(l5_103)q->r,1個序列(l5_18)位置572,總突變2,2個不同的氨基酸m->l,1個序列(l5_72)m->i,1個序列(7)位置597,總突變2,1個不同的氨基酸i->t,2個序列(l5_75,l5_79)位置616,總突變2,1個不同的氨基酸e->k,2個序列(l5_75,l5_79)位置618,總突變2,1個不同的氨基酸l->v,2個序列(18,l5_95)位置623,總突變2,1個不同的氨基酸a->v,2個序列(12,l5_115)位置635,總突變2,2個不同的氨基酸c->s,1個序列(8)c->r,1個序列(l5_106)位置642,總突變2,2個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_107)h->y,1個序列(l5_47)位置676,總突變2,1個不同的氨基酸s->p,2個序列(l5_80,l5_82)位置15,總突變1,1個不同的氨基酸k->t,1個序列(l5_11)附錄4續(xù)位置23,總突變1,1個不同的氨基酸s->p,1個序列(12)位置24,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_40)位置26,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_82)位置29,總突變1,1個不同的氨基酸f->l,1個序列(11)位置30,總突變1,1個不同的氨基酸p->l,1個序列(l5_23)位置36,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->i,1個序列(l5_99)位置37,總突變1,1個不同的氨基酸g->w,1個序列(l5_14)位置41,總突變1,1個不同的氨基酸l->r,1個序列(l5_40)位置43,總突變1,1個不同的氨基酸v->i,1個序列(l5_2)位置51,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(13)位置60,總突變1,1個不同的氨基酸s->a,1個序列(l5_41)位置64,總突變1,1個不同的氨基酸y->c,1個序列(l5_61)位置67,總突變1,1個不同的氨基酸s->p,1個序列(l5_73)位置69,總突變1,1個不同的氨基酸e->g,1個序列(l5_32)位置70,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_88)位置74,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_79)位置77,總突變1,1個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_48)位置86,總突變1,1個不同的氨基酸i->v,1個序列(l5_39)位置87,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_20)附錄4續(xù)位置88,總突變1,1個不同的氨基酸v->a,1個序列(12)位置89,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(8)位置90,總突變1,1個不同的氨基酸c->y,1個序列(l5_58)位置92,總突變1,1個不同的氨基酸s->p,1個序列(l5_44)位置93,總突變1,1個不同的氨基酸p->l,1個序列(l5_66)位置96,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->m,1個序列(l5_103)位置97,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(l5_71)位置104,總突變1,1個不同的氨基酸p->r,1個序列(l5_79)位置105,總突變1,1個不同的氨基酸g->e,1個序列(l5_76)位置107,總突變1,1個不同的氨基酸n->s,1個序列(l5_47)位置110,總突變1,1個不同的氨基酸r->g,1個序列(l5_51)位置112,總突變1,1個不同的氨基酸v->a,1個序列(l5_60)位置118,總突變1,1個不同的氨基酸v->a,1個序列(l5_62)位置124,總突變1,1個不同的氨基酸d->g,1個序列(l5_95)位置125,總突變1,1個不同的氨基酸i->v,1個序列(l5_3)位置127,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(l5_40)位置128,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_47)位置131,總突變1,1個不同的氨基酸n->s,1個序列(21)位置132,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(l5_104)附錄4續(xù)位置136,總突變1,1個不同的氨基酸l->w,1個序列(13)位置137,總突變1,1個不同的氨基酸s->g,1個序列(l5_82)位置138,總突變1,1個不同的氨基酸g->r,1個序列(l5_3)位置143,總突變1,1個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_3)位置149,總突變1,1個不同的氨基酸l->f,1個序列(l5_37)位置151,總突變1,1個不同的氨基酸l->f,1個序列(l5_40)位置159,總突變1,1個不同的氨基酸r->k,1個序列(l5_13)位置164,總突變1,1個不同的氨基酸s->g,1個序列(l5_104)位置168,總突變1,1個不同的氨基酸f->s,1個序列(l5_41)位置173,總突變1,1個不同的氨基酸r->k,1個序列(l5_57)位置174,總突變1,1個不同的氨基酸d->g,1個序列(l5_29)位置187,總突變1,1個不同的氨基酸r->g,1個序列(l5_95)位置190,總突變1,1個不同的氨基酸q->r,1個序列(l5_117)位置192,總突變1,1個不同的氨基酸f->l,1個序列(l5_42)位置207,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(13)位置208,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_4)位置211,總突變1,1個不同的氨基酸r->w,1個序列(l5_56)位置214,總突變1,1個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_9)位置222,總突變1,1個不同的氨基酸y->c,1個序列(l5_9)附錄4續(xù)位置223,總突變1,1個不同的氨基酸v->m,1個序列(l5_23)位置225,總突變1,1個不同的氨基酸d->g,1個序列(l5_4)位置238,總突變1,1個不同的氨基酸q->h,1個序列(l5_65)位置240,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_55)位置241,總突變1,1個不同的氨基酸r->q,1個序列(16)位置242,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_20)位置250,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_71)位置252,總突變1,1個不同的氨基酸y->h,1個序列(l5_120)位置259,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(16)位置263,總突變1,1個不同的氨基酸q->r,1個序列(l5_95)位置280,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_60)位置282,總突變1,1個不同的氨基酸e->g,1個序列(l5_62)位置292,總突變1,1個不同的氨基酸p->l,1個序列(l5_56)位置293,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_9)位置295,總突變1,1個不同的氨基酸k->e,1個序列(l5_107)位置298,總突變1,1個不同的氨基酸r->g,1個序列(l5_90)位置308,總突變1,1個不同的氨基酸g->s,1個序列(l5_120)位置309,總突變1,1個不同的氨基酸f->s,1個序列(l5_28)位置311,總突變1,1個不同的氨基酸r->h,1個序列(16)附錄4續(xù)位置312,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_29)位置314,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_76)位置322,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_60)位置323,總突變1,1個不同的氨基酸p->l,1個序列(21)位置326,總突變1,1個不同的氨基酸p->s,1個序列(l5_80)位置331,總突變1,1個不同的氨基酸g->e,1個序列(l5_20)位置332,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->i,1個序列(23)位置339,總突變1,1個不同的氨基酸d->g,1個序列(l5_117)位置343,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_82)位置351,總突變1,1個不同的氨基酸l->v,1個序列(l5_61)位置353,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(21)位置356,總突變1,1個不同的氨基酸a->g,1個序列(l5_82)位置369,總突變1,1個不同的氨基酸f->i,1個序列(l5_118)位置376,總突變1,1個不同的氨基酸y->c,1個序列(l5_118)位置379,總突變1,1個不同的氨基酸g->s,1個序列(l5_60)位置383,總突變1,1個不同的氨基酸q->p,1個序列(l5_117)位置392,總突變1,1個不同的氨基酸v->a,1個序列(l5_57)位置393,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_72)位置415,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_9)附錄4續(xù)位置434,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_118)位置435,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_23)位置441,總突變1,1個不同的氨基酸e->g,1個序列(l5_120)位置444,總突變1,1個不同的氨基酸v->a,1個序列(l5_9)位置446,總突變1,1個不同的氨基酸q->r,1個序列(l5_81)位置447,總突變1,1個不同的氨基酸p->l,1個序列(l5_9)位置459,總突變1,1個不同的氨基酸h->r,1個序列(l5_78)位置462,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_18)位置468,總突變1,1個不同的氨基酸d->a,1個序列(l5_81)位置475,總突變1,1個不同的氨基酸v->g,1個序列(l5_8)位置481,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(10)位置484,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_97)位置486,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_56)位置497,總突變1,1個不同的氨基酸d->g,1個序列(l5_71)位置498,總突變1,1個不同的氨基酸i->v,1個序列(l5_97)位置501,總突變1,1個不同的氨基酸e->k,1個序列(l5_81)位置504,總突變1,1個不同的氨基酸g->r,1個序列(l5_18)位置514,總突變1,1個不同的氨基酸l->f,1個序列(8)位置528,總突變1,1個不同的氨基酸l->i,1個序列(l5_62)附錄4續(xù)位置532,總突變1,1個不同的氨基酸g->r,1個序列(l5_117)位置533,總突變1,1個不同的氨基酸q->k,1個序列(l5_104)位置538,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_69)位置539,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_82)位置543,總突變1,1個不同的氨基酸e->k,1個序列(l5_2)位置544,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->i,1個序列(16)位置551,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_71)位置552,總突變1,1個不同的氨基酸l->p,1個序列(l5_3)位置556,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_42)位置558,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_81)位置560,總突變1,1個不同的氨基酸r->w,1個序列(13)位置562,總突變1,1個不同的氨基酸e->k,1個序列(l5_71)位置570,總突變1,1個不同的氨基酸l->i,1個序列(l5_65)位置573,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(l5_76)位置576,總突變1,1個不同的氨基酸k->r,1個序列(l5_11)位置577,總突變1,1個不同的氨基酸k->q,1個序列(18)位置600,總突變1,1個不同的氨基酸r->k,1個序列(l5_16)位置602,總突變1,1個不同的氨基酸g->r,1個序列(3)位置622,總突變1,1個不同的氨基酸k->r,1個序列(l5_3)附錄4續(xù)位置628,總突變1,1個不同的氨基酸k->e,1個序列(l5_25)位置632,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(28)位置633,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_107)位置634,總突變1,1個不同的氨基酸h->y,1個序列(l5_53)位置643,總突變1,1個不同的氨基酸s->g,1個序列(l5_107)位置646,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_39)位置655,總突變1,1個不同的氨基酸a->v,1個序列(l5_18)位置656,總突變1,1個不同的氨基酸a->t,1個序列(16)位置661,總突變1,1個不同的氨基酸i->v,1個序列(23)位置662,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_116)位置663,總突變1,1個不同的氨基酸e->d,1個序列(8)位置667,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->a,1個序列(l5_78)位置668,總突變1,1個不同的氨基酸s->p,1個序列(l5_3)位置669,總突變1,1個不同的氨基酸t(yī)->s,1個序列(l5_57)位置670,總突變1,1個不同的氨基酸l->f,1個序列(l5_106)位置672,總突變1,1個不同的氨基酸i->t,1個序列(l5_72)附錄5附錄5續(xù)附錄5續(xù)附錄6附錄7seqidno:1seqidno:2seqidno:3寡核苷酸(22b)pro-pivex5’-gcgagcccgatcttccccatcg-3’seqidno:4寡核苷酸(21b)pd-ter5’-aagaagacacgatccaccgcc-3’seqidno:5寡核苷酸(38b)assra5’-ttaagctgctaaagcgtagttttcgtcgtttgcgacta-3’seqidno:6蛋白質(833aa)mlv_pdmrgshhhhhhgsgsmgmtlniedehrlhetskepdvslgstwlsdfpqawaetggmglavrqapliiplkatstpvsikqypmsqearlgikphiqrlldqgilvpcqspwntpllpvkkpgtndyrpvqdlrevnkrvedihptvpnpynllsglppshqwytvldlkdaffclrlhptsqplfafewrdpemgisgqltwtrlpqgfknsptlfdealhrdladfriqhpdlillqyvddlllaatseldcqqgtrallqtlgnlgyrasakkaqicqkqvkylgyllkegqrwltearketvmgqptpktprqlreflgtagfcrlwipgfaemaaplypltktgtlfnwgpdqqkayqeikqalltapalglpdltkpfelfvdekqgyakgvltqklgpwrrpvaylskkldpvaagwppclrmvaaiavltkdagkltmgqplvilaphavealvkqppdrwlsnarmthyqallldtdrvqfgpvvalnpatllplpeeglqhncldilaeahgtrpdltdqplpdadhtwytdgssllqegqrkagaavtteteviwakalpagtsaqraelialtqalkmaegkklnvytdsryafatahihgeiyrrrglltsegkeiknkdeilallkalflpkrlsiihcpghqkghsaeargnrmadqaarkaaitetpdtstlliensspnsrlinefgsgggsgggsmgtatapgglsakapamtplmldtssrklvawdgttdgaavgilavaadqtsttltfyksgtfryedvlwpeaasdetkkrtafagtaisivgsgggsgggsgggsgggsgggsgggscllseqidno:7蛋白質(766aa)del_pdmrgshhhhhhgsgsmgmtlniedehrlhetskepdvslgstwlsdfpqawaetggmglavrqapliiplkatstpvsikqypmsqearlgikphiqrlldqgilvpcqspwntpllpvkkpgtndyrpvqdlrevnkrvedihptvpnpynllsglppshqwytvldlkdaffclrlhptsqplfafewrdpemgisgqltwtrlpqgfknsptlfdealhrdladfriqhpdlillqyvddlllaatseldcqqgtrallqtlgtagfcrlwipgfaemaaplypltktgtlfnwgpdqqkayqeikqalltapalglpdltkpfelfvdekqgyakgvltqklgpwrrpvaylskkldpvaagwppclrmvaaiavltkdagkltmgqplvilaphavealvkqppdrwlsnarmthyqallldtdrvqfgpvvalnpatllplpeeglqhncldilaeahgtrpdltdqplpdadhtwytdgssllqegqrkagaavtteteviwakalpagtsaqraelialtqalkmaegkklnvytdsryafatahihgeiyrrrglltsegkeiknkdeilallkalflpkrlsiihcpghqkghsaeargnrmadqaarkaaitetpdtstlliensspnsrlinefgsgggsgggsmgtatapgglsakapamtplmldtssrklvawdgttdgaavgilavaadqtsttltfyksgtfryedvlwpeaasdetkkrtafagtaisivgsgggsgggsgggsgggsgggsgggscllseqidno:8寡核苷酸(15b)pd_425’-ttacggctggaggtg-3’seqidno:9寡核苷酸(28b)rd_nde5’-ctttaagaaagaggagaaattacatatg-3’seqidno:10寡核苷酸(14b)pd_555’-gccgggcgcggttg-3’seqidno:11寡核苷酸(23b)m_f5’-gatcaagccccacatacagagac-3’seqidno:12寡核苷酸(19b)m_2r5’-gccctgcttctcgtcgaca-3’seqidno:13寡核苷酸(40b)m_esp5’-atcgtctcccatgggcatgaccctaaatatagaagatgag-3’seqidno:14寡核苷酸(32b)m_eri5’-aatgaattcattaattaagcgggaattgggtg-3’seqidno:15寡核苷酸(18b)m_1r5’-cagggcccgagtaccttg-3’seqidno:16寡核苷酸(17b)m_3f5’-ccagttcggaccggtgg-3’seqidno:17寡核苷酸(19b)pd_ter-5’-aagaagacacgatccaccg-3’seqidno:18寡核苷酸(36b)m_hind3+5’-cggatcaagcttaattaattaagcgggaattgggtg-3’seqidno:19seqidno:20寡核苷酸(19b)pd-ter-5’-aagaagacacgatccaccg-3’seqidno:21寡核苷酸(35b)long+5’-cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagaagtc-3’seqidno:22寡核苷酸(71b+3’修飾ddc)ddc-long25’-tttttttagacttctttcttcccttcctttctcgccacgttcgaagaagacacgatccaccgccggttccg-ddc-3’seqidno:23寡核苷酸(35b+3’生物素(teg)long+tb5’-cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagaagtc-bio-3’參考文獻mattheakislc，bhattrr，dowerwj.aninvitropolysomedisplaysystemforidentifyingligandsfromverylargepeptidelibraries.procnatlacadsciusa.1994sep13；91(19):9022-6.matsuurat，pluckthuna.selectionbasedonthefoldingpropertiesofproteinswithribosomedisplay.feeslett.2003mar27；539(l-3):24-8.hanesj，pluckthuna.invitroselectionandevolutionoffunctionalproteinsbyusingribosomedisplay.procnatlacadsciusa.1997may13；94(10):4937-42.hem，taussigmj.antibody-ribosome-mrna(arm)complexesasefficientselectionparticlesforinvitrodisplayandevolutionofantibodycombiningsites.nucleicacidsres.1997dec15；25(24):5132-4.irvingra，coiag，robertsa，nuttallsd，hudsonpj.ribosomedisplayandaffinitymaturation:fromantibodiestosinglev-domainsandstepstowardscancertherapeutics.jimmunolmethods.2001febl；248(l-2):31-45.review.amstutzp，pelletierjn，guggisberga，jermutusl，cesaro-tadics，zahndc，pluckthuna.invitroselectionforcatalyticactivitywithribosomedisplay.jamchemsoc.2002aug14；124(32):9396-403.takahashif，ebiharat，miem，yanagiday，endoy，kobatakee，aizawam.ribosomedisplayforselectionofactivedihydrofolatereductasemutantsusingimmobilizedmethotrexateonagarosebeads.febslett.2002mar6；514(l):106-10.tawfikds，griffithsad.man-madecell-likecompartmentsformolecularevolution.natbiotechnol.1998jul；16(7):652-6.leeyf，tawfikds，griffithsad.investigatingthetargetrecognitionofdnacytosine-5methyltransferasehhalbylibraryselectionusinginvitrocompartmentalisation.nucleicacidsres.2002nov15；30(22):4937-44.cohenhm，tawfikds，griffithsad.alteringthesequencespecificityofhaeiiimethyltransferasebydirectedevolutionusinginvitrocompartmentalization.proteinengdessel.2004jan；17(l):3-11.ghadessyfj，ongjl，holligerp.directedevolutionofpolymerasefunctionbycompartmentalizedself-replication.procnatlacadsciusa.2001apr10；98(8):4552-7.epub2001mar27.ghadessyfj，ramsayn，boudsocqf，loakesd，browna，iwais，vaismana，woodgater，holligerp.genericexpansionofthesubstratespectrumofadnapolymerasebydirectedevolution.natbiotechnol.2004jun；22(6):755-9.epub2004may23.ongjl，loakesd，jaroslawskis，took，holligerp.directedevolutionofdnapolymerase，rnapolymeraseandreversetranscriptaseactivityinasinglepolypeptide.jmolbiol.2006aug18；361(3):537-50.epub2006jμl5.bernathk，haim，mastrobattistae，griffithsad，magdassis，tawfikds.invitrocompartmentalizationbydoubleemulsions:sortingandgeneenrichmentbyfluorescenceactivatedcellsorting.analbiochem.2004年2月l日；325(l):151-7.mastrobattistae，talyv，chanudete，treacyp，kellybt，griffithsad.high-throughputscreeningofenzymelibraries:invitroevolutionofabeta-galactosidasebyfluorescence-activatedsortingofdoubleemulsions.chembiol.2005年12月；12(12):1291-300.bertschingerj，nerid.covalentdnadisplayasanoveltoolfordirectedevolutionofproteinsinvitro.proteinengdessel.2004年9月；17(9):699-707.epub2004年11月2日。doin，yanagawah.stable:protein-dnafusionsystemforscreeningofcombinatorialproteinlibrariesinvitro.febslett.1999年8月27日；457(2):227-30.yonezawam，doin，kawahashiy，higashinakagawat，yanagawah.dnadisplayforinvitroselectionofdiversepeptidelibraries.nucleicacidsres.2003年11月1日；31(19):e118.seppa，chooy.cell-freeselectionofzincfingerdna-bindingproteinsusinginvitrocompartmentalization.jmolbiol.2005年11月25日；354(2):212-9.epub2005年10月3日.seppa，tawfikds，griffithsad.microbeaddisplaybyinvitrocompartmentalisation:selectionforbindingusingflowcytometry.febslett.2002年12月18日；532(3):455-8.griffithsad，tawfikds.directedevolutionofanextremelyfastphosphotriesterasebyinvitrocompartmentalization.emboj.2003年1月2日；22(l):24-35.bernathk，magdassis，tawfikds.directedevolutionofproteininhibitorsofdna-nucleasesb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