本發(fā)明屬于特色民族藥用植物中的有效成分提取分離以及活性篩選的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兩種蒽醌類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula），為傣族地區(qū)常用藥用植物，原產(chǎn)于印度、緬甸和斯里蘭卡，在我國南部和西南部均有栽培，是南方常見的庭院觀賞樹木，樹皮含單寧，可做紅色染料；根、樹皮、果瓤和種子均可入藥作緩瀉劑；木材堅重，耐朽力強，可作支柱、橋梁、車輛及農(nóng)具等用材；而其在民間被用于治療皮膚病、周期性發(fā)熱和腫瘤等疾病，更是突顯出了其一定的藥用價值；本發(fā)明從臘腸樹中分離得到兩個新的具有一定的細胞毒活性和抗煙草花葉病毒活性的蒽醌類化合物，其中，fistulaquinonea的6位具有少見的羥乙基取代，結(jié)構(gòu)具有一定的特點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供兩個新的蒽醌類化合物；第二目的在于提供所述蒽醌類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述蒽醌類化合物在制備抗癌和抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的兩個蒽醌類化合物是從豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝中分離得到，分別命名為fistulaquinonea（分子式：c19h18o5）和fistulaquinoneb（分子式：c19h18o5）分別具有下述結(jié)構(gòu)，其中，fistulaquinonea的6位具有少見的羥乙基取代：

。

本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，所述的蒽醌類化合物的制備方法，其特征在于蒽醌類化合物是以豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝為原料，經(jīng)有機溶劑提取、mci脫色、硅膠柱層析、高效液相色譜分離步驟而得到具體為：

a、浸膏提?。簩⒍箍铺K木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝20~40目粉碎，用有機溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、mci脫色：浸膏a，用重量比2~5倍量的甲醇水溶解，上mci柱，用80~90%甲醇水洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重1~2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量6~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、將9:1洗脫部分再次用體積比為9:1~1:2混合有機溶劑洗脫；

e、高效液相色譜分離：以50-80%的甲醇為流動相，流速8~12ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為202~280nm，每次進樣10~100ml，收集10~50min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的2個蒽醌類化合物；

其中a步驟所用的有機溶劑為70%的丙酮;b步驟所用的有機溶劑為90%甲醇;c步驟所用的混合有機溶劑為氯仿和丙酮的體積比配比為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1;d步驟所用的混合有機溶劑乙醚和丙酮的體積配比為9:1,8:2,7:3,6:4,1:1和1:2。

本發(fā)明兩個新的恩醌類化合物結(jié)構(gòu)是通過核磁共振和質(zhì)譜測定方法確定，并表征其具體結(jié)構(gòu)為：

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本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的蒽醌類化合物在制備抗癌和抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的兩個新蒽醌類化合物經(jīng)對抗煙草花葉病毒的實驗，其中fistulaquinonea和fistulaquinoneb的相對抑制率在20μm下分別達到25.2%和26.3%，低于陽性對照品南寧霉素的相對抑制率（28.8%），說明fistulaquinonea和fistulaquinoneb具有一定的抗煙草花葉病毒活性；此外，本發(fā)明的兩個新蒽醌類化合物對白血病急性早幼粒nb4細胞、肺腺癌a549細胞、人骨髓神經(jīng)母細胞瘤shsy5y細胞、人前列腺癌pc3細胞、人乳腺癌mcf7細胞的細胞毒活性測試；其中，蒽醌類化合物fistulaquinonea對nb4和shsy5y細胞株具有一定的細胞毒活性，ic50值分別達6.2和8.4μm；蒽醌類化合物fistulaquinoneb對a549細胞株具有一定的細胞毒活性，ic50值為5.5μm。

本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎活性好，可作為抗癌和抗煙草花葉病毒藥物的先導(dǎo)性化合物，在藥物發(fā)現(xiàn)方面有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明化合物fistulaquinonea的核磁共振碳譜（¹³cnmr）。

圖2為本發(fā)明化合物fistulaquinonea的核磁共振氫譜（¹hnmr）。

圖3為本發(fā)明化合物fistulaquinoneb的核磁共振氫譜（¹³cnmr）。

圖4為本發(fā)明化合物fistulaquinoneb的核磁共振氫譜（¹hnmr）。

圖5為化合物fistulaquinonesa和b的1d核磁數(shù)據(jù)（溶劑為c5d5n）(125and500mhz)。

圖6為兩個新蒽醌類化合物的細胞毒活性。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所述兩個蒽醌類化合物是從豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝中分離得到，分別命名為fistulaquinonea（分子式：c19h18o5）和fistulaquinoneb（分子式：c19h18o5），分別具有下述結(jié)構(gòu)：

其特征在于蒽醌類化合物是以豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝為原料，經(jīng)有機溶劑提取、mci脫色、硅膠柱層析、高效液相色譜分離步驟而得到具體為：

a、浸膏提?。簩⒍箍铺K木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的干燥的細枝20~40目粉碎，用有機溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、mci脫色：浸膏a，用重量比2~5倍量的甲醇水溶解，上mci柱，用80~90%甲醇水洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重1~2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量6~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、將9:1洗脫部分再次用體積比為9:1~1:2混合有機溶劑洗脫；

e、高效液相色譜分離：以50~80%的甲醇為流動相，流速8~12ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為202~280nm，每次進樣10~100ml，收集10~50min的色譜峰，多次累加后蒸干,即得所述的2個蒽醌類化合物；

其中a步驟所用的有機溶劑為70%的丙酮;b步驟所用的有機溶劑為90%甲醇;c步驟所用的混合有機溶劑為氯仿和丙酮的體積比配比為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1;d步驟所用的混合有機溶劑乙醚和丙酮的體積配比為9:1,8:2,7:3,6:4,1:1和1:2。

本發(fā)明所述的臘腸樹植物不受地區(qū)和品種限制，均可以實現(xiàn)本發(fā)明。

實施例1

取干燥的豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的細枝2.2kg,粗粉碎至40目，用70%的丙酮超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成63.5g的浸膏a；浸膏a用mci裝柱，在浸膏a中加入150g的80%甲醇水溶解，用90%甲醇水2~4l洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到31.2g浸膏c,浸膏c中加60g丙酮，然后加入100目硅膠60g拌樣，拌樣后，用200目硅膠500g裝柱；用體積比分別為0:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個部分a-f，其中，對收集到的樣品2部分6.42g，再重復(fù)硅膠柱層析，用體積比分別為9:1,8:2,7:3,6:4,1:1和1:2的乙醚-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個部分b1-b6，其中第b3部分，即7:3部分約650mg,再以50~80%的甲醇為流動相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進樣50ml，分別收集15min及21min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的兩個蒽醌類化合物fistulaquinonea和fistulaquinoneb。

實施例2

取干燥的豆科蘇木亞科決明屬木本植物臘腸樹（cassiafistula）的細枝5.0kg,粗粉碎至40目，用70%的丙酮超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成130g的浸膏a；浸膏a用mci裝柱，在浸膏a中加入320g的80%甲醇水溶解，用90%甲醇水3~8l洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到64.3g浸膏c,浸膏c中加130g丙酮，然后加入100目硅膠130g拌樣，拌樣后，用200目硅膠1200g裝柱；用體積比分別為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個部分a-f，其中，對收集到的樣品2部分13.2g，再重復(fù)硅膠柱層析，用體積比分別為9:1,8:2,7:3,6:4,1:1和1:2的乙醚-丙酮混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個部分b1-b6，其中第b3部分，即7:3部分約1.32g,再以50~80%的甲醇為流動相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進樣55ml，分別收集13min及20min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的兩個蒽醌類化合物fistulaquinonea和fistulaquinoneb。

實施例3

取實施例1或2制備的蒽醌類化合物fistulaquinonea，為紅色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)；

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），lmax(loge)：210(4.14),250(3.75),280(3.67),408(3.26)nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）nmax：3348,3085,2947,1662,1625,1560,1447,1401,1365,1332,1280,1246,1198,1113,1062,1010cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z349.1059[m+na]⁺（計算值為349.1052），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖5）給出其分子式為c19h18o5，其不飽和度為11，¹hnmr（c5d5n，500mhz）和¹³cnmr（c5d5n，125mhz）數(shù)據(jù)，見圖5；

取實施例1或2制備的蒽醌類化合物fistulaquinoneb，為紅色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)；

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），lmax(loge)：210(4.19),248(3.72),277(3.62),405(3.18)nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）nmax：3082,2945,1668,1620,1564,1443,1405,1358,1324,1283,1242,1196,1107,1054,996cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準分子離子峰m/z349.1046[m+na]⁺（計算值為349.1052），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖3和圖4，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖5）給出其分子式為c19h18o5，其不飽和度為11，¹hnmr（c5d5n，500mhz）和¹³cnmr（c5d5n，125mhz）數(shù)據(jù)，見圖5。

實施例4

取實施例2制備的蒽醌類化合物fistulaquinonesa和b分別按實施例3中的方法進行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實施例3，分子式分別為c19h18o5和c19h18o5。

實施例5

取實施例1和2所制備的蒽醌類化合物進行抗煙草花葉病毒活性檢測試驗，試驗情況如下：

采用半葉法，在藥劑的質(zhì)量濃度為50mg/l時對本發(fā)明化合物進行抗煙草花葉病毒性測定。在5~6齡烤煙的植株上，選取適用于測試的葉片（葉行正常，無病無蟲），先將葉片均勻撒上細金剛砂，用毛筆將備用的煙草花葉病毒源（3.0×10^-3）均勻抹在撒有細金剛砂的葉片上，待所有中選的葉片接毒結(jié)束后，立即放在盛有藥液的培養(yǎng)皿中處理20min，取出，擦去葉片上水珠和藥液，將兩個半葉復(fù)原排放在鋪有衛(wèi)生紙保濕金的玻璃缸中，并蓋上玻璃蓋，控溫（23±2）℃，放在室溫自然光照射，2~3d即可見枯斑，每個處理都設(shè)另一半葉為對照，另外設(shè)有1組為商品南霉素的處理作為對比，按下列公式計算相對抑制率：

xi％=(ck-t)/ck×100％

x：相對抑制率（%），ck：浸泡于清水中半片接毒葉的枯斑數(shù)（個），t：浸泡于藥液中半片接毒葉的枯斑數(shù)（個）；

經(jīng)對抗煙草花葉病毒的實驗，fistulaquinonea和fistulaquinoneb的相對抑制率在20μm下分別達到25.2%和26.3%，低于陽性對照品南寧霉素的相對抑制率（28.8%），說明fistulaquinonea和fistulaquinoneb均具有一定的抗煙草花葉病毒活性。

實施例6

取實施例1和2所制備的蒽醌類化合物進行抗煙草花葉病毒活性檢測試驗，試驗情況如下：

細胞株：白血病細胞（nb4）、肺癌細胞（a549）、人神經(jīng)母細胞瘤細胞（shsy5y）、前列腺癌細胞（pc3）、乳腺癌細胞（mcf7）均由中國科學院上海藥物研究所提供；

實驗設(shè)計：以上細胞與不同濃度化合物溫育72小時,每株細胞的實驗均重復(fù)一次,用兩次實驗的結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理,采用改良mtt法及srb法評價化合物對細胞增殖的抑制程度,計算抑制率,根據(jù)抑制率采用logit方法計算ic50,比較化合物的體外抗腫瘤活性；

細胞的增殖抑制率=(空白對照od值-加藥孔的od值)/空白對照od值×100%；

(a)改良mtt法

取處于對數(shù)生長期的懸浮細胞,將細胞濃度調(diào)整為4×10⁴/ml,加入96孔培養(yǎng)板,90μl/孔。陽性對照為順鉑,用生理鹽水溶解；每孔分別加入10μl不同濃度的樣品(1號試液-5號試液)；加樣組及對照組均設(shè)4個復(fù)孔,加樣組、陽性對照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔,每塊板均設(shè)有4個空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10及10²μg/ml,相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%；樣品在終濃度10²μg/ml時,用0.1%dmso作為溶劑對照,其余濃度均用生理鹽水作陰性對照。陽性對照藥順鉑的終濃度為10^-1、1、10μg/ml；細胞在37℃,5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育48h后,加入mtt(5mg/ml,sigma),10μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4h后,加入三聯(lián)液[10%sds–5%異丁醇–0.012mol/lhcl(w/v/v)],100μl/孔,放置過夜后用酶標儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的od值；

(b)srb法

取處于對數(shù)生長期的貼壁細胞株,用25%胰酶常規(guī)消化后,再用15%小牛血清完全rpmi-1640培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為5×10⁴/ml,加入96孔培養(yǎng)板,90μl/孔。細胞在37℃,5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育24h后加入陽性對照、陰性對照以及受試樣品(各受試濃度同上mtt法，10μl/孔)，樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10、10²μg/ml,相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%；樣品在終濃度10²μg/ml時用0.1%dmso作為溶劑對照,其余濃度均用生理鹽水作陰性對照；陽性對照藥的終濃度為10^-1、1、10μg/ml,陰性對照為等體積的生理鹽水；加樣組及對照組均設(shè)4復(fù)孔,加樣組、陽性對照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔,每塊板均設(shè)有4個空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)；將96孔培養(yǎng)板置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中孵育(細胞與樣品作用)48h后,加入4℃、50%的tca(三氯乙酸)50μl/孔；加完tca后,將96孔培養(yǎng)板置于4℃孵育1小時,取出培養(yǎng)板,輕輕傾去板內(nèi)液體；用自來水輕輕沖洗5遍(將自來水由燒杯中輕輕倒入板中,輕晃后再將水倒去),置于空氣中風干至不見水痕；然后加入配制好的0.4%srb(用1%乙酸稀釋),50μl/孔,于室溫下靜置染色30分鐘后傾去srb溶液,用1%乙酸沖洗4遍,以除去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料；置于空氣中風干至無水痕后,加入10mm未緩沖tris(緩血氨酸)溶液150μl/孔(ph10,用三蒸水配制),將染料溶解后,于振蕩器上振蕩5分鐘,用酶標儀在570nm波長下讀取各孔od值；

(c)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明：經(jīng)對白血病急性早幼粒nb4細胞、肺腺癌a549細胞、人骨髓神經(jīng)母細胞瘤shsy5y細胞、人前列腺癌pc3細胞、人乳腺癌mcf7細胞的細胞毒活性實驗，蒽醌類化合物fistulaquinonea對nb4和shsy5y細胞株具有一定的細胞毒活性，ic50值分別達6.2和8.4μm；蒽醌類化合物fistulaquinoneb對a549細胞株具有一定的細胞毒活性，ic50值為5.5μm。