本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及其鑒定方法。
背景技術(shù)：
達(dá)氏鱘又稱長(zhǎng)江鱘、沙臘子，是我國(guó)特有物種，主要分布于長(zhǎng)江干流及金沙江下游，以四川宜賓-合江段產(chǎn)量較高。近20年來(lái)，由于葛洲壩工程的興建以及水體污染、過度捕撈等原因，達(dá)氏鱘的野生資源量已經(jīng)極其稀少，1988年被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物和長(zhǎng)江上游一級(jí)急切保護(hù)魚類。通過對(duì)達(dá)氏鱘野生資源馴化培育，達(dá)到性成熟后進(jìn)行人工繁殖來(lái)是保護(hù)該物種的重要手段。達(dá)氏鱘繁殖時(shí)采用“一雌配多雄”的方法，能夠顯著提高人工受精率，進(jìn)而提高繁殖率。然而“一雌配多雄”的配種方式及子代混養(yǎng)帶來(lái)了親子關(guān)系不明，系譜結(jié)構(gòu)不清等問題，難以實(shí)現(xiàn)達(dá)氏鱘的科學(xué)選育。而按照傳統(tǒng)的方法獲取準(zhǔn)確的系譜結(jié)構(gòu)信息，需要將每一個(gè)家系單獨(dú)飼養(yǎng)，或者使用物理標(biāo)記，如熒光標(biāo)記和電子標(biāo)記。但采用單個(gè)家系單獨(dú)養(yǎng)殖的方式不僅占用空間大，勞動(dòng)強(qiáng)度高，養(yǎng)殖設(shè)備費(fèi)用高，更重要的是不同的環(huán)境效應(yīng)會(huì)影響不同家系的生長(zhǎng)性狀；而通過傳統(tǒng)的物理標(biāo)記存在操作繁瑣、費(fèi)用昂貴、對(duì)魚體有傷害、標(biāo)志容易脫落等缺點(diǎn)，不能區(qū)分單個(gè)個(gè)體。利用傳統(tǒng)的方法獲得可靠的親緣關(guān)系及系譜結(jié)構(gòu)信息非常困難。
微衛(wèi)星標(biāo)記(ssrs：simplesequencerepeats)或短串聯(lián)重復(fù)(shorttandemrepeats，strs)，是一種廣泛應(yīng)用的遺傳學(xué)領(lǐng)域的dna分子標(biāo)記。ssr與其它遺傳標(biāo)記相比較，具有位點(diǎn)眾多，多態(tài)性程度高，檢測(cè)時(shí)對(duì)dna模板要求程度低，檢測(cè)簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)良好的遺傳標(biāo)記。微衛(wèi)星dna的高突變性、共顯性表達(dá)及其在真核生物基因組中的普遍性，使其成為群體遺傳多樣性的分析、親緣關(guān)系的鑒定、基因組作圖和遺傳育種的優(yōu)越的分子標(biāo)記，與等位酶、rapd方法相比也有一定的優(yōu)越性。以微衛(wèi)星分型為基礎(chǔ)的親子鑒定技術(shù)是目前水產(chǎn)動(dòng)物系譜確認(rèn)中應(yīng)用最廣泛最可靠的手段之一。已應(yīng)用到中華鱘、扇貝、羅非魚、泥鰍、黃顙魚等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物育種中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及其利用該引物鑒定達(dá)氏鱘家系的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物，所述微衛(wèi)星引物共有18個(gè)引物對(duì)，分別為adx21、adx29、adx33、adx80、adx38、adx40、adx42、adx52、adx55、adx58、adx59、adx60、adx61、adx66、adx70、adx72、adx74和adx75，其中：
引物對(duì)adx21的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2中所示；
引物對(duì)adx29的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4中所示；
引物對(duì)adx33的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6中所示；
引物對(duì)adx80的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8中所示；
引物對(duì)adx38的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10中所示；
引物對(duì)adx40的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12中所示；
引物對(duì)adx42的核苷酸序列如seqidno.13和seqidno.14中所示；
引物對(duì)adx52的核苷酸序列如seqidno.15和seqidno.16中所示；
引物對(duì)adx55的核苷酸序列如seqidno.17和seqidno.18中所示；
引物對(duì)adx58的核苷酸序列如seqidno.19和seqidno.20中所示；
引物對(duì)adx59的核苷酸序列如seqidno.21和seqidno.22中所示；
引物對(duì)adx60的核苷酸序列如seqidno.23和seqidno.24中所示；
引物對(duì)adx61的核苷酸序列如seqidno.25和seqidno.26中所示；
引物對(duì)adx66的核苷酸序列如seqidno.27和seqidno.28中所示；
引物對(duì)adx70的核苷酸序列如seqidno.29和seqidno.30中所示；
引物對(duì)adx72的核苷酸序列如seqidno.31和seqidno.32中所示；
引物對(duì)adx74的核苷酸序列如seqidno.33和seqidno.34中所示；
引物對(duì)adx75的核苷酸序列如seqidno.35和seqidno.36中所示。
本發(fā)明還提供一種利用上述的微衛(wèi)星標(biāo)記引物鑒定達(dá)氏鱘家系的方法，步驟包括：
(1)達(dá)氏鱘親本及子代dna提?。悍謩e選取43尾f1代達(dá)氏鱘及67尾f2代達(dá)氏鱘作為鑒定的親本及子代，同時(shí)選取全同胞家系繁殖的20尾已知父母本的f2代達(dá)氏鱘作為本次鑒定的陽(yáng)性對(duì)照，選取親本及子代肌肉組織，采用ctab法提取dna，獲得達(dá)氏鱘全部親本及子代的dna作為模板待用；
(2)微衛(wèi)星標(biāo)記引物熒光修飾：選取上述19個(gè)引物對(duì)，在正向引物5’端分別用fam、hex或者tampa三種不同的熒光中的其中一種進(jìn)行修飾，用于pcr分析；
(3)熒光pcr：采用熒光pcr反應(yīng)利用步驟(2)中熒光基團(tuán)修飾過的19個(gè)引物對(duì)分別對(duì)步驟(1)中的親本及子代的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照步驟(2)中分組的方法進(jìn)行混合，混合物作為上機(jī)待測(cè)樣品；
(4)達(dá)氏鱘微衛(wèi)星家系鑒定：將上機(jī)待測(cè)樣品采用基因分析儀進(jìn)行分析，讀取每個(gè)樣品的基因型，對(duì)親本基因型和子代基因型進(jìn)行分析，判定子代個(gè)體的父母本，獲得達(dá)氏鱘的微衛(wèi)星家系。
進(jìn)一步的，步驟(3)中，熒光pcr反應(yīng)時(shí)，體系為20μl，包括50ng基因組dna、1×pcr緩沖液、mg2+(1.5mm)、1utaq酶、dntps0.2mm、正反引物均為0.25μm。
進(jìn)一步的，步驟(3)中，熒光pcr反應(yīng)時(shí)，94℃5min，94℃30s、退火30s、72℃30s、32循環(huán)，72℃8min，4℃保存。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)達(dá)氏鱘進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)不僅比傳統(tǒng)方法更為快捷，花費(fèi)更少，而且在獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的同時(shí)可以查找對(duì)應(yīng)est序列的功能性狀，與基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。本發(fā)明方法能快速、有效地鑒別達(dá)氏鱘不同家系及來(lái)源，為達(dá)氏鱘的選育，繁殖配組提供了依據(jù)。本發(fā)明選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)目較多，多態(tài)性高，可以用于達(dá)氏鱘的親子鑒定，有助于防止近親交配或小群體內(nèi)近交導(dǎo)致的種群質(zhì)量下降，也可以依據(jù)親本與子代的對(duì)應(yīng)關(guān)系，分析親本對(duì)子代的貢獻(xiàn)率，確定繁殖力較高的個(gè)體，為種群遺傳管理策略的制定提供理論依據(jù)，為制定科學(xué)的繁殖策略提供參考。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物的獲得和驗(yàn)證：
達(dá)氏鱘樣品收集及rna提?。?/p>
從四川省水產(chǎn)研究所挑選兩尾健康的達(dá)氏鱘，解剖取其性腺進(jìn)行totalrna的提取，隨后進(jìn)行達(dá)氏鱘轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序、拼接及組裝并查找微衛(wèi)星位點(diǎn)。經(jīng)過篩選之后最終選擇了18對(duì)條帶清晰，多態(tài)性高的引物作為家系鑒定的引物，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星引物信息
實(shí)施例2達(dá)氏鱘微衛(wèi)星家系的鑒定方法
(一)達(dá)氏鱘親本及子代dna提取
(1)達(dá)氏鱘家系的建立
選取四川省水產(chǎn)研究所43尾性成熟的達(dá)氏鱘作為此次鑒定的候選親本，選取2014年繁殖的f2代43尾及2015年繁殖的f2代24尾總共67尾幼魚作為此次鑒定的子代。同時(shí)，為了確保鑒定方法的可靠性，選取了20尾2016年繁殖的已知父母本的達(dá)氏鱘子代(分別來(lái)自兩個(gè)全同胞繁殖家系，每個(gè)家系各10尾魚苗)作為陽(yáng)性參照，來(lái)評(píng)估鑒定方法的準(zhǔn)確性。
(2)達(dá)氏鱘親本和子代基因組dna的提取
達(dá)氏鱘dna的制備采用ctab法進(jìn)行，具體步驟如下：將達(dá)氏鱘的鰭條約30mg放入1.5ml離心管中；離心管中加入500μl的組織裂解液(tris-hcl10mm，edta100mm，sds0.6％，nacl400mm，10mnaoh調(diào)節(jié)ph＝7.5)，用干凈的剪刀將組織剪碎，離心管中加入1μl20mg/ml蛋白酶k；55℃水浴3h，每隔半個(gè)小時(shí)輕輕顛倒混勻；向離心管中加入120μl飽和nacl，混勻，冰上放置5～10min；4℃，12000r/min離心10min，并轉(zhuǎn)移上清液(約500μl)到另一干凈1.5ml離心管中；加入等體積的異丙醇，輕搖，放置5min；4℃，12000r/min離心10min，棄上清液；加入1ml70％預(yù)冷的乙醇洗滌dna沉淀一次，自然晾干后以適量雙蒸水溶液溶解dna樣品；取1ul左右的樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)dna質(zhì)量，-20℃?zhèn)溆谩?/p>
(二)微衛(wèi)星標(biāo)記引物熒光修飾
選取實(shí)施例1中的18個(gè)引物對(duì)，根據(jù)擴(kuò)增片段大小的差異，分別在每組引物的正向引物5’端用fam、hex或tamra三種不同的熒光基團(tuán)進(jìn)行修飾，具體如表1中所示，用于pcr分析；
采用熒光pcr反應(yīng)利用上述熒光基團(tuán)修飾過的18個(gè)引物對(duì)分別對(duì)上述親本及子代的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，不同熒光的混合產(chǎn)物作為上機(jī)待測(cè)樣品。
擴(kuò)增體系為20μl，包括50ng基因組dna，1×pcr緩沖液，mg2+(1.5mm)，1utaq酶，dntps0.2mm，正反引物均為0.25μm。
擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)32次，最后72℃充分延伸8分鐘，4℃保存。
(三)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型及家系鑒定
(1)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型
擴(kuò)增產(chǎn)物在abi3730xl基因分析儀上進(jìn)行分型，用genemarker軟件讀取個(gè)體的基因型。
(2)家系鑒定結(jié)果
因達(dá)氏鱘為多倍體，所以所有的微衛(wèi)星分型結(jié)果都轉(zhuǎn)化為顯性遺傳標(biāo)記，即不考慮等位基因的劑量，每個(gè)等位基因只考慮有或無(wú)。
轉(zhuǎn)化后的微衛(wèi)星結(jié)果采用軟件colony2.0進(jìn)行家系鑒定。
對(duì)于陽(yáng)性參照的20尾子代，采用colony軟件中的full-pedigreelikelihood法，結(jié)果均找到了其真實(shí)的父母本。說(shuō)明此發(fā)明開發(fā)的18對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記在陽(yáng)性參照上的鑒定成功率為100％。
在實(shí)際鑒定的67個(gè)子代個(gè)體中，所有子代都找到了對(duì)應(yīng)的父本和母本，且置信度均在95％以上，沒有發(fā)現(xiàn)多重配對(duì)的情況。所以，此次家系鑒定從候選親本中找到真正父母親的概率為100％，能夠滿足遺傳育種中系譜分析的要求。
最后所應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
sequencelisting
<110>四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所
<120>一種用于達(dá)氏鱘家系鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記引物及其鑒定方法
<130>權(quán)利要求書、說(shuō)明書
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