本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種真菌DNA提取液及提取方法。
背景技術(shù)：
真菌感染是臨床常見的疾病之一。對(duì)人類有致病性的真菌約有300多種。根據(jù)侵犯人體部位的不同，臨床上將致病真菌分為淺部真菌和深部真菌。淺部真菌僅侵犯皮膚、毛發(fā)和指甲，而深部真菌能侵犯黏膜、深部組織和內(nèi)臟，甚至引起全身播散性感染。
目前，臨床常見真菌檢測(cè)方法主要是通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，但該方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，受人員經(jīng)驗(yàn)影響比較大，且形態(tài)比較接近的真菌難以通過該方法鑒定到種，因此通過分子測(cè)序方法進(jìn)行真菌鑒定顯得越來越重要。然而，真菌細(xì)胞壁成分復(fù)雜，往往難以得到充分裂解，且真菌中富含多糖、色素、核酸酶等物質(zhì)使得真菌DNA的提取更加困難，從而限制了分子鑒定方法的應(yīng)用。因此，探索臨床常見真菌高效、快速的DNA提取方法十分重要。
傳統(tǒng)的真菌DNA提取方法步驟繁瑣，且耗時(shí)較長(zhǎng)，不符合真菌分子快速鑒定方法的需求。而市售的DNA提取液，在某些真菌DNA提取方面效果不佳，提取效率不高，使用范圍相對(duì)不夠廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于此，有必要提供一種能夠快速、有效的提取真菌DNA的真菌DNA提取液及提取方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下。
一種真菌DNA提取液，包括質(zhì)量百分含量為4％-6％的Chelex-100、8mM-12mM的pH為8.0-8.7的tris-HCl、0.08mM-0.12mM的EDTA-Na2、質(zhì)量百分含量為0.08％-0.12％的NaN3、200μg/ml-250μg/ml的蛋白酶K以及13mg/ml-15mg/ml的蝸牛酶。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述Chelex-100的質(zhì)量百分含量為5％；所述tris-HCl的濃度為10mM，pH為8.3，所述EDTA-Na2的濃度為0.1mM；所述NaN3的濃度為0.1％；所述蛋白酶K的濃度為200μg/ml；所述蝸牛酶的濃度為13mg/ml。
一種真菌DNA提取方法，使用上述任一實(shí)施例所述的真菌DNA提取液進(jìn)行提取。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，在提取過程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入45mg-55mg的真菌菌體的比例將待提取DNA的真菌菌體加入至所述真菌DNA提取液中，得到混合液。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，在提取過程中，將真菌菌體與真菌DNA提取液的混合液置于55℃-58℃下保溫以裂解細(xì)胞壁，釋放出DNA，之后再置于95℃-100℃下保溫使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)chelex-100吸附各種雜質(zhì)以對(duì)DNA進(jìn)行純化，最后離心收集上清液
在其中一個(gè)實(shí)施例中，在55℃-58℃下保溫時(shí)間為1h-2h；在95℃-100℃下保溫時(shí)間為10min-15min。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，在提取過程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入50mg的真菌菌體的比例將待提取DNA的真菌菌體加入至所述真菌DNA提取液中；
在提取過程中，將真菌菌體與真菌DNA提取液的混合液先置于56℃下保溫1小時(shí)，再置于100℃下保溫10分鐘，最后離心收集上清液。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述離心的轉(zhuǎn)速為13000rpm，時(shí)間為10分鐘。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，在將待提取DNA的真菌菌體加入至真菌DNA提取液之前，還包括破碎所述真菌菌體的細(xì)胞壁的步驟。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述破碎所述真菌菌體的細(xì)胞壁是使用液氮研磨的方法。
上述真菌DNA提取液中通過添加蝸牛酶，可以有效裂解細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)涵物有效釋放；通過添加NaN3可以促進(jìn)蛋白質(zhì)變性，防止提取到蛋白質(zhì)成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響；通過添加蛋白酶K，可進(jìn)一步溶解變性的蛋白質(zhì)；通過添加Chelex-100可以選擇性地結(jié)合多價(jià)陽離子，去除樣品和緩沖液中的金屬離子，避免煮沸過程中模板DNA的降解。通過使用該真菌DNA提取液，各組分可以發(fā)揮協(xié)同作用進(jìn)行真菌菌體DNA的提取，該提取液中的兩種酶和chelex-100這三個(gè)成分都是不可缺少的，蛋白酶K和蝸牛酶對(duì)于細(xì)胞壁的裂解是十分重要的，二者聯(lián)合應(yīng)用可以提高破壁效率，縮短孵育時(shí)間；chelex-100在除雜方面優(yōu)勢(shì)比較明顯，尤其在暗色真菌DNA提取方面優(yōu)勢(shì)更大，通過該方法獲得的DNA純度更高。
使用上述真菌DNA提取液對(duì)真菌DNA進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)便，提取周期短，并且適用范圍廣，對(duì)大多數(shù)真菌菌體都可以有效提取，提取效率高，DNA提取的純度高。
進(jìn)一步，對(duì)某些細(xì)胞壁極為復(fù)雜的細(xì)菌，可以先對(duì)其進(jìn)行破壁操作，如在一實(shí)施例中，使用液氮研磨的方式進(jìn)行破壁，再使用上述真菌DNA提取液進(jìn)行提取，提取效果非常明顯，可以有效提取傳統(tǒng)提取液提取不了的真菌，因而進(jìn)一步拓寬了該真菌DNA提取液和提取方法的適用范圍。
具體實(shí)施方式
為了便于理解本發(fā)明，下面將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。
實(shí)施例1
1.配方
本實(shí)施例所用的自制真菌DNA提取液的配方如下：
可理解，在其他實(shí)施例中，真菌DNA提取液的配方不限于此，如Chelex-100的質(zhì)量百分含量可以在4％-6％之間；tris-HCl的濃度可以在8mM-12mM之間，pH可以在8.0-8.7之間，EDTA-Na2的濃度可以在0.08mM-0.12mM之間；NaN3的濃度可以在0.08％-0.12％之間；蛋白酶K的濃度可以在200μg/ml-250μg/ml之間；蝸牛酶的可以在13mg/ml-15mg/ml之間。
2.步驟
在研究過程中，通過常規(guī)的PCR擴(kuò)增ITS(Internal Transcribed Spacer，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列)基因?qū)ψ灾频恼婢鶧NA提取液的DNA提取功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
通過收集到的34株真菌(涉及26個(gè)不同真菌屬，這些菌株均經(jīng)過真菌ITS基因測(cè)序鑒定)，將自制的真菌DNA提取液同市售的DNA提取液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(廠家Takara，貨號(hào)9164)進(jìn)行了比對(duì)。
加50mg菌體到含有50μl真菌DNA提取液的1.5ml離心管中，水浴56℃30min保溫消化，接著水浴100℃10min，最后13000rpm 10min離心獲取上清液，該上清液即可作為ITS基因PCR擴(kuò)增的DNA模板
結(jié)果共34株真菌，利用本實(shí)施例自制的真菌DNA提取液成功PCR擴(kuò)增32株真菌，得到了清晰的、單一的擴(kuò)增條帶；利用市售DNA提取液成功擴(kuò)增出27株真菌，結(jié)果詳見下表1。本實(shí)施例所選用的真菌屬達(dá)到26個(gè)，涉及的真菌種屬范圍廣，并且實(shí)驗(yàn)過程中盡可能地排除了試劑外其他因素的影響，因此，上述結(jié)果有效地證明了自制的DNA提取液具有高效性的特點(diǎn)。
在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)于自制的真菌DNA提取液和市售的DNA提取液均未能直接成功提出DNA的Trichophyton和Coprinopsis，在提DNA之前進(jìn)行液氮研磨，經(jīng)過液氮研磨破壁后，自制的真菌DNA提取液可以成功提出Trichophyton和Coprinopsis的DNA；而市售的DNA提取液僅可成功提出Coprinopsis的DNA，這進(jìn)一步地說明了本實(shí)施例的真菌DNA提取液在真菌DNA提取方面的有效性。
表1本實(shí)施例自制的真菌DNA提取液和市售提取液提取真菌DNA對(duì)應(yīng)的PCR檢測(cè)結(jié)果
由表1可以進(jìn)一步看出，本實(shí)施例的真菌DNA提取液具有操作簡(jiǎn)便、快速、高效、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)，是一種比較理想的提取真菌DNA的方法，可以作為后續(xù)PCR模板。極少數(shù)真菌因?yàn)榧?xì)胞壁成分更加復(fù)雜直接提取DNA難以成功，此時(shí)只要在提取DNA之前加液氮破壁步驟，運(yùn)用本實(shí)施例自制的真菌DNA提取液便可以成功提出DNA，進(jìn)行后續(xù)的PCR；而市售的DNA提取液仍沒能成功提出DNA，因此新研制試劑在提取真菌DNA方面有著極大的優(yōu)勢(shì)，有望研發(fā)成為一種新的試劑。
以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。