本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用定點(diǎn)突變及酶切技術(shù)制備熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)的方法。

背景技術(shù)：

分子量?jī)?nèi)標(biāo)是在進(jìn)行STR檢測(cè)時(shí)與樣品在同一通道電泳的一系列長(zhǎng)度不同的DNA片段，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，通過(guò)分析樣品DNA與分子量?jī)?nèi)標(biāo)的相對(duì)出峰位置，就可以標(biāo)定樣品DNA的大小。在電泳時(shí)，分子量?jī)?nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間和峰型也可以反映電泳儀器的工作狀態(tài)。

中國(guó)專利CN101050474(公開(kāi)日：2007.10.10)公開(kāi)的一種分子量?jī)?nèi)標(biāo)的制備方法及用該方法制備的分子量?jī)?nèi)標(biāo)，CN 105296473A(公開(kāi)日：2016.02.03)公開(kāi)的一種分子量?jī)?nèi)標(biāo)及其應(yīng)用，CN106282180A(公開(kāi)日：2017.01.04)公開(kāi)的一種分子量?jī)?nèi)標(biāo)及其制備方法和應(yīng)用》，三個(gè)技術(shù)方案都采用了PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)固定上游引物，依次向下設(shè)計(jì)下游引物的方法得到一系列長(zhǎng)度不等的片段，如圖1所示。然而，采用這種方法需要摸索PCR擴(kuò)增條件，擴(kuò)增產(chǎn)物容易有非特異性條帶，并且制備的分子量?jī)?nèi)標(biāo)穩(wěn)定性差。上述方法中，由于引物二聚體的長(zhǎng)度與內(nèi)標(biāo)中的小片段長(zhǎng)度相近，不易于純化，因此混有引物峰，容易在數(shù)據(jù)分析時(shí)產(chǎn)生誤判，且不易于規(guī)?；a(chǎn)。

目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道利用定點(diǎn)突變及酶切技術(shù)制備熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種利用定點(diǎn)突變及酶切技術(shù)制備熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)的方法，實(shí)現(xiàn)制備從50bp到500bp共14個(gè)片段的分子量?jī)?nèi)標(biāo)，制備的產(chǎn)物沒(méi)有引物峰等雜峰，且制備工藝適用于規(guī)?；a(chǎn)。

一種利用定點(diǎn)突變及酶切技術(shù)制備熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)的方法，包括如下步驟：

S1將目的DNA片段A克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒B；

S2以步驟S1中得到的重組質(zhì)粒B為模板，在DNA片段A的不同長(zhǎng)度位置分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，引入限制性酶切位點(diǎn)，并得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒C；

S3設(shè)計(jì)DNA片段A的擴(kuò)增引物F1、R1，并分別在引物5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記；

S4利用擴(kuò)增引物F1、R1擴(kuò)增重組質(zhì)粒C，得到擴(kuò)增產(chǎn)物D，將產(chǎn)物D進(jìn)行純化；

S5利用限制性內(nèi)切酶酶切純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物D，得到酶切產(chǎn)物E，即熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)。

需要說(shuō)明的是，步驟S1中，DNA片段A長(zhǎng)度為10bp到5000bp。

需要說(shuō)明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點(diǎn)為黏性末端的酶切位點(diǎn)或者平末端的酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步需要說(shuō)明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點(diǎn)為BamHI、HindIII、EcorV或EcorI。

需要說(shuō)明的是，步驟S3中，熒光標(biāo)記為能與DNA堿基結(jié)合并能被488nm-605nm激光激發(fā)出熒光的物質(zhì)。

進(jìn)一步需要說(shuō)明的是，所述熒光標(biāo)記為ROX、HEX、FAM、CY3、CY5或LIZ。

本發(fā)明的有益效果在于：利用本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)制備從50bp到500bp共14個(gè)片段的分子量?jī)?nèi)標(biāo)，制備的產(chǎn)物沒(méi)有引物峰等雜峰，且制備工藝適用于規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)獲得的內(nèi)標(biāo)片段進(jìn)行線性化分析，R值＝0.9999，符合線性化要求，可以用作STR分型的分子量?jī)?nèi)標(biāo)。

附圖說(shuō)明

圖1為現(xiàn)有方法的實(shí)施流程示意圖；

圖2為本發(fā)明的實(shí)施流程示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的分子量電泳檢測(cè)圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中的分子量?jī)?nèi)標(biāo)線性分析圖。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，需要說(shuō)明的是，本實(shí)施例以本技術(shù)方案為前提，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于本實(shí)施例。

如圖2所示，一種利用定點(diǎn)突變及酶切技術(shù)制備熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)的方法，包括如下步驟：

S1將目的DNA片段A克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒B；

S2以步驟S1中得到的重組質(zhì)粒B為模板，在DNA片段A的不同長(zhǎng)度位置分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，引入限制性酶切位點(diǎn)，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒C；

S3設(shè)計(jì)DNA片段A的擴(kuò)增引物F1、R1，并分別在引物5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記；

S4利用擴(kuò)增引物F1、R1擴(kuò)增重組質(zhì)粒C，得到擴(kuò)增產(chǎn)物D，將產(chǎn)物D進(jìn)行純化；

S5利用限制性內(nèi)切酶酶切純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物D，得到酶切產(chǎn)物E，即熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)。

需要說(shuō)明的是，步驟S1中，DNA片段A長(zhǎng)度可以為但不限于10bp到5000bp。

需要說(shuō)明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點(diǎn)為黏性末端的酶切位點(diǎn)或者平末端的酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步需要說(shuō)明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點(diǎn)可以為但不限于BamHI、HindIII、EcorV或EcorI。

需要說(shuō)明的是，步驟S3中，熒光標(biāo)記為能與DNA堿基結(jié)合并能被488nm-605nm激光激發(fā)出熒光的物質(zhì)。

進(jìn)一步需要說(shuō)明的是，所述熒光標(biāo)記可以為但不限于ROX、HEX、FAM、CY3、CY5或LIZ。

實(shí)施例1

1)以人類個(gè)體基因組D2S441基因座為模板設(shè)計(jì)引物

F：TTCAAGTCAGGGTTTCCAAG；

R：TTTTAGAGATAAGGTGTGCG；

進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增片段克隆進(jìn)T載體，得到重組質(zhì)粒B。

2)選取重組質(zhì)粒B中D2S441基因的500bp序列A

ATTTAACGTCTGCTGGTTTGTTATAAATAATGTTACAAAGGATAACAATGAAGAGATGGTCAGGCGAGGTATGGGGGAAGGGGCGTGGAGCTTCCATGTCCTCCCTGGGCGCCACCCTCCAGGAACCTCCACGTGTTCAGCTATACAGAAGCTTCCTGAACCCAGTCCTCTTGGGGTTTGAGGGAAGCTTCATGACATCAGCATTCCTTCCTCCAGGGTATTAATGGGACCCTCTCTGAAGAGATTCTTAAGACCCACGGCCAGAAAGTTGGGTAAAGACTAGAGTCCTGCCTTGGGGCAGGTGAAAGGAGTGCAAGAGAAGGTAAGAGAGATTCTGTTCCTGAGCCCTAATGCACCCAACATTCTAACAAAAGGCTGTAACAAGGGCTACAGGAATCATGAGCCAGGAACTGTGGCTCATCTATGAAAACTTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT

CTATCTATCTATATCATAACACCACAGCCAC

在序列A的50bp、75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、490bp位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)克隆，引入EcoRV酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒C；

3)以序列A為模板設(shè)計(jì)引物

F1：ATTTAACGTCTGCTGGTT；

R1：GGAGCTAAGTGGCTGTGG；

并在引物F1、R1的5’端進(jìn)行6-FAM熒光標(biāo)記。以引物F1、R1對(duì)重組質(zhì)粒C進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增采用promega公司Go taq酶及配套bufffer，鎂離子。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃5min；擴(kuò)增循環(huán)95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec循環(huán)數(shù)35；終延伸72℃10min。擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物D采用Qiagen膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

4)將步驟3)中純化后的產(chǎn)物D分別用EcoRV酶(由NEB公司提供)進(jìn)行酶切，酶切體系：DNA 1ug，SmaI酶1ul，10X buffber 2ul，雙蒸水補(bǔ)足10ul。酶切反應(yīng)條件：30℃孵育10min；65℃滅活20min，得到酶切產(chǎn)物E，即熒光分子量?jī)?nèi)標(biāo)；

5)將酶切產(chǎn)物E采用Qiagen膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

取1ul酶切產(chǎn)物E與9ul甲酰胺混合，95℃變性3分鐘，立即置于冰上，在ABI 3130上進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣電壓1kv，進(jìn)樣時(shí)間15s；電泳電壓15kv，電泳時(shí)間1500s，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

對(duì)各個(gè)片段的出峰位置和片段大小進(jìn)行線性分析，R值＝0.99，如圖4所示。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)以上的技術(shù)方案和構(gòu)思，作出各種相應(yīng)的改變和變形，而所有的這些改變和變形都應(yīng)該包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。