本發(fā)明屬于微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及戊糖片球菌的新菌株篩選、功能驗證及該菌株在調(diào)節(jié)血脂方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高膽固醇血癥也稱高低密度脂蛋白膽固醇血癥，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心血管病的首要危險因素。最新研究顯示，各種心血管病風(fēng)險人群低密度脂蛋白每降低1毫摩爾/升，主要血管事件可降低21％。據(jù)2013年的統(tǒng)計顯示，我國約有2億臨界高膽固醇血癥人群以及8800萬高膽固醇血癥患者。而我國成人中高膽固醇的知曉率、治療率、控制率僅為11％、5.1％和2.8％。在第四屆中國慢病管理大會心腦血管疾病防治論壇上，多位專家呼吁，政策制定者、醫(yī)務(wù)人員以及公眾都應(yīng)認(rèn)識到控制血脂在心腦血管疾病防治中的重要作用，真正做到危險因素的綜合管理。

當(dāng)前針對預(yù)防心血管疾病，提倡遵守低脂或低飽和脂肪食物的膳食原則。大量的實驗證明，低脂食物能有效減少血清中膽固醇的含量，但低脂食物的口感和風(fēng)味比較簡單，這個膳食建議仍未被大眾接受或長期堅持，因此人群血清膽固醇水平呈逐年增高趨勢。由于低脂膳食主張的低接受性，人們愿望開發(fā)出其他可以降低血清膽固醇及血脂的膳食補充品。

最早發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠降低機體內(nèi)膽固醇含量源于上世紀(jì)七十年代Mann的發(fā)現(xiàn)，他發(fā)現(xiàn)飲用發(fā)酵乳制品人的體內(nèi)具有較低的膽固醇含量，在1985年，研究者Gilliland等開展了嗜酸乳桿菌進(jìn)行體外降膽固醇的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌能夠降低發(fā)酵液中的膽固醇含量。Grill等給血清總膽固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌制劑，8個月后發(fā)現(xiàn)被測人群血清膽固醇含量均顯著下降。目前國內(nèi)針對降膽固醇功能研究比較深入的兩個菌株同屬于植物乳桿菌，分別為L.plantarum P8和植物乳桿菌ST-III。L.plantarum P8來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的張和平領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊，動物試驗表明，L.plantarum P8具有顯著的降血脂作用。曾任東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院副院長，現(xiàn)任光明乳業(yè)股份有限公司總經(jīng)理郭本恒領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊和江南大學(xué)合作研發(fā)的植物乳桿菌ST-III，在大量基礎(chǔ)研究 的基礎(chǔ)上，成功通過動物實驗和人群臨床試驗的證實其降膽固醇的效果，并已產(chǎn)業(yè)化，成為光明公司的一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的益生菌產(chǎn)品。這也充分表明了具有降膽固醇的乳酸菌在發(fā)酵食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為緩解國內(nèi)高血脂人群日益增長的嚴(yán)峻趨勢，提供一種具有降膽固醇、調(diào)節(jié)血脂功能的菌株和/或組合物，及其在制備食品、保健品、藥品等方面的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方案：

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種戊糖片球菌JQI-7，該戊糖片球菌JQI-7菌株于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.10511。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7，是一種從發(fā)酵食品中分離的全新的菌株，該菌株在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯，且對酸和膽汁都有良好的耐受性。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了所述戊糖片球菌JQI-7在調(diào)節(jié)血脂方面的用途，具體地，是在預(yù)防和改善高膽固醇及高甘油三酯癥狀方面的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7，在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯。因此，本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7能夠用于調(diào)節(jié)血脂，具體地用于降低膽固醇及甘油三酯。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了所述的戊糖片球菌JQI-7在制備用于調(diào)節(jié)血脂，具體用于降低膽固醇和甘油三酯的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物，所述的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物都含有上述的戊糖片球菌JQI-7。本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7，在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯。因而，所述的含有戊糖片球菌JQI-7菌株的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物能夠用于調(diào)節(jié)血脂，具體地，用于降低膽固醇或降甘油三酯。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物。所述藥物包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及醫(yī)藥用無毒載體。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)體外的膽固醇含量和甘油三酯的含量都明顯降低，即本發(fā)明的藥物能夠有效發(fā)揮降低膽固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述藥物用于降低膽固醇、降低甘油三酯，由 此，該藥物用于調(diào)節(jié)血脂。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述醫(yī)藥用無毒載體不受特別限制，只要能夠使所述藥物形成容易給藥的劑型即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述醫(yī)藥用無毒載體為選自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理食鹽水的至少一種。由此，本發(fā)明的藥物能夠有效形成容易給藥的劑型，進(jìn)而便于進(jìn)行給藥，利于后續(xù)實驗步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物的劑型呈選自片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑的至少一種。由此，本發(fā)明的藥物方便給藥，便于后續(xù)實驗步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的藥物進(jìn)一步包括：穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物的給藥劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)給藥對象的健康狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，任選地，該實施例所述的藥物為復(fù)合益生菌片，將所述藥物以2.0×10⁹CFU活菌/天的劑量對動物進(jìn)行給藥。由此，被給藥動物的血中膽固醇含量、甘油三酯含量明顯降低。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提供了一種食品。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及食品學(xué)上可接受的添加劑。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)體外的膽固醇含量和甘油三酯的含量都明顯降低，即本發(fā)明的食品能夠有效發(fā)揮降低膽固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述藥物用于降低膽固醇、降低甘油三酯，由此，該食品用于調(diào)節(jié)血脂。

需要說明的是，本文中所使用的術(shù)語“食品”應(yīng)作廣義理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常規(guī)的食品形式外，本發(fā)明的食品還可以為保健品、飲品、發(fā)酵食品等，并且，發(fā)酵食品也包括動物的飼料。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品的攝取劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)實際狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，任選地，實施例所述的食品為酸豆乳飲品，將所述食品以2.0×10⁹CFU活菌/天的劑量提供給動物。由此，服用過了本發(fā)明的食品的動物的血中膽固醇含量、甘油三酯含量明顯降低。

另外，需要說明的是，本發(fā)明的植物乳桿菌可以與通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷類及薯類：谷類包括米、面、雜糧，薯類包括馬鈴薯、紅薯等；動物性食物，包括肉、禽、魚、奶、蛋等；豆類及其制品，包括大豆及其他干豆類；蔬菜水果類，包括鮮豆、根莖、葉菜、茄果等；純熱能食物，包括動植物油、淀粉、食用糖和酒類等。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1戊糖片球菌JQI-7在光鏡下的形態(tài)圖。

圖2戊糖片球菌JQI-7在10000倍電鏡下的形態(tài)圖。

圖3顯示了本發(fā)明實施例2戊糖片球菌JQI-7在體外降解膽固醇實驗結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表組別，縱坐標(biāo)代表降解率。

圖4顯示了本發(fā)明實施例3戊糖片球菌JQI-7在體外抗酸實驗的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表時間，縱坐標(biāo)代表活菌數(shù)。

圖5顯示了本發(fā)明實施例3戊糖片球菌JQI-7在體外抗膽鹽實驗的生長曲線圖。

圖6顯示了本發(fā)明實施例4戊糖片球菌JQI-7降解甘油三酯動物實驗的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表組別，縱坐標(biāo)代表甘油三脂的濃度。

圖7顯示了本發(fā)明實施例4戊糖片球菌JQI-7降解膽固醇動物實驗的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)代表組別，縱坐標(biāo)代表膽固醇的濃度。

具體實施方式

益生菌定植于人體腸道、生殖道內(nèi)，能產(chǎn)生健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用。人體、動物體內(nèi)的益生菌主要有：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、放線菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最強大的產(chǎn)品主要是以上各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種戊糖片球菌JQI-7，該戊糖片球菌JQI-7菌株于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No.10511。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的戊糖片 球菌JQI-7，是一種從發(fā)酵食品中分離的全新的菌株，該菌株在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯，且對酸和膽汁都有良好的耐受性。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了所述戊糖片球菌JQI-7在調(diào)節(jié)血脂方面的用途，具體地，是在預(yù)防和改善高膽固醇及高甘油三酯癥狀方面的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7，在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯。因此，本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7能夠用于調(diào)節(jié)血脂，具體地用于降低膽固醇及甘油三酯。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了所述的戊糖片球菌JQI-7在制備用于調(diào)節(jié)血脂，具體用于降低膽固醇和甘油三酯的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物，所述的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物都含有上述的戊糖片球菌JQI-7。本發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7，在體內(nèi)、體外均能夠有效降低膽固醇及甘油三酯。因而，所述的含有戊糖片球菌JQI-7菌株的食品、保健品、食品添加劑、藥物及其他組合物能夠用于調(diào)節(jié)血脂，具體地，用于降低膽固醇或降甘油三酯。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物。所述藥物包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及醫(yī)藥用無毒載體。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)體外的膽固醇含量和甘油三酯的含量都明顯降低，即本發(fā)明的藥物能夠有效發(fā)揮降低膽固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述藥物用于降低膽固醇、降低甘油三酯，由此，該藥物用于調(diào)節(jié)血脂。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述醫(yī)藥用無毒載體不受特別限制，只要能夠使所述藥物形成容易給藥的劑型即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述醫(yī)藥用無毒載體為選自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理食鹽水的至少一種。由此，本發(fā)明的藥物能夠有效形成容易給藥的劑型，進(jìn)而便于進(jìn)行給藥，利于后續(xù)實驗步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物的劑型呈選自片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑的至少一種。由此，本發(fā)明的藥物方便給藥，便于后續(xù)實驗步驟的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的藥物進(jìn)一步包括：穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物的給藥劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)給藥對象的健康狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，任選地，該實施例所述的藥物為復(fù)合益生菌片，將所述藥物以2.0×10⁹CFU活菌/天的劑量對動物進(jìn)行給藥。由此，被給藥動物的血中膽固醇含量、甘油三酯含量明顯降低。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提供了一種食品。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品包含：前面所述的戊糖片球菌JQI-7；以及食品學(xué)上可接受的添加劑。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)體外的膽固醇含量和甘油三酯的含量都明顯降低，即本發(fā)明的食品能夠有效發(fā)揮降低膽固醇、降低甘油三酯等功效。由此，所述藥物用于降低膽固醇、降低甘油三酯，由此，該食品用于調(diào)節(jié)血脂。

需要說明的是，本文中所使用的術(shù)語“食品”應(yīng)作廣義理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常規(guī)的食品形式外，本發(fā)明的食品還可以為保健品、飲品、發(fā)酵食品等，并且，發(fā)酵食品也包括動物的飼料。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品的攝取劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)實際狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，任選地，實施例所述的食品為酸豆乳飲品，將所述食品以2.0×10⁹CFU活菌/天的劑量提供給動物。由此，服用過了本發(fā)明的食品的動物的血中膽固醇含量、甘油三酯含量明顯降低。

另外，需要說明的是，本發(fā)明的植物乳桿菌可以與通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷類及薯類：谷類包括米、面、雜糧，薯類包括馬鈴薯、紅薯等；動物性食物，包括肉、禽、魚、奶、蛋等；豆類及其制品，包括大豆及其他干豆類；蔬菜水果類，包括鮮豆、根莖、葉菜、茄果等；純熱能食物，包括動植物油、淀粉、食用糖和酒類等。

戊糖片球菌JQI-7在MRS培養(yǎng)基中在光學(xué)顯微鏡下呈球狀形態(tài)。一般細(xì)胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。直徑約1μm，無芽孢，胞壁結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)均勻，如圖1、圖2所示。不含質(zhì)粒，代謝物不產(chǎn)生D-乳酸、吲哚等有毒物質(zhì)，不表達(dá)硝基還原酶、也不具備產(chǎn)生物胺的能力，9種抗生素(Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Vancomycin)MIC(最小抑菌濃度)均符合EFSA (歐洲食品藥品監(jiān)督局)規(guī)定。

戊糖片球菌JQI-7菌株體外降膽固醇試驗顯示，與對照相比，加入了戊糖片球菌JQI-7的高膽固醇溶液，在細(xì)菌培養(yǎng)24小時后，膽固醇的去除率達(dá)到68.76％，表明戊糖片球菌JQI-7體外確有降低膽固醇功能(圖3)。

進(jìn)一步將戊糖片球菌JQI-7菌株接種到pH為3.0的酸性環(huán)境與接種到pH6.8的中性環(huán)境中，2小時后進(jìn)行活菌計數(shù)，發(fā)現(xiàn)pH3.0中，與pH6.8相比，活菌數(shù)保持在一個數(shù)量級(10⁹CFU/ml)；同時，戊糖片球菌JQI-7菌株在含0.3％的膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基的生長曲線穩(wěn)定，表明戊糖片球菌JQI-7對酸和膽汁都有良好的耐受性(圖4，5)。

動物實驗中，將戊糖片球菌JQI-7喂食高膽固醇、高脂模型小鼠，在喂食28天以后，小鼠血液中甘油三酯及膽固醇含量與喂食生理鹽水的模型組小鼠相比，分別降低了23.8％和32.5％(圖6,7)，表明戊糖片球菌JQI-7能夠有效改善小鼠的高膽固醇、高甘油三酯癥狀。

以上研究表明，戊糖片球菌JQI-7菌株對模擬胃液和人工腸液環(huán)境抗性良好，體外、體內(nèi)可明顯降低膽固醇及甘油三酯。表明本文發(fā)明的戊糖片球菌JQI-7菌株已經(jīng)具備成為藥用菌的必備條件，可用于開發(fā)成為新藥、食品、保健品以及食品添加劑等。

下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實施例1：戊糖片球菌JQI-7的分離鑒定

(1)培養(yǎng)基配方優(yōu)化

分組進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)基實驗，最后得到乳酸菌培養(yǎng)基最佳配方：

MRS固體培養(yǎng)基1L配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，吐溫801.0g/L，檸檬酸三銨2.0g/L，醋酸鈉5.0g/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸錳0.05g/L，瓊脂17.5g，德國Merck公司；

MRS肉湯培養(yǎng)基配方較MRS瓊脂培養(yǎng)基僅無瓊脂，德國Merck公司。

調(diào)整pH至6.5，121℃滅菌20min。培養(yǎng)基制備完成，4℃冷藏備用。

(2)戊糖片球菌JQI-7菌株的分離鑒定

以各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品為樣品，用無菌生理鹽水，10倍梯度稀釋樣品后至10^-3， 將其涂布于MRS固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24—48h，觀察菌落形態(tài)特征，并挑取MRS固體培養(yǎng)基上乳酸菌的疑似菌落，分別轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)。共分離出若干株菌，對每株菌進(jìn)行編號。

對分離純化得到的這若干株菌進(jìn)行酸及膽鹽耐受力及降膽固醇能力的測定，詳細(xì)實驗步驟見實施例2及3，從中篩選得到酸及膽鹽耐受力較強，降膽固醇能力較強的JQI-7。JQI-7來源于農(nóng)家自制酸奶。

對JQI-7抽提細(xì)菌總DNA，進(jìn)行16s rDNA擴(kuò)增，引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

跑膠回收，進(jìn)行測序，根據(jù)16s DNA測序結(jié)果如SEQ ID NO：3所示。

用BLAST工具在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，鑒定為戊糖片球菌，命名為JQI-7。

(3)菌落特征

JQI-7細(xì)胞革蘭氏染色呈陽性，形態(tài)為球狀。一般細(xì)胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列，不運動，不產(chǎn)芽孢，無莢膜，過氧化氫酶實驗陰性，是兼性厭氧的細(xì)菌。在MRS固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18h，菌落直徑為0.8～1.4mm，乳白色，有光澤，不透明，邊緣整齊，扁平。(見圖1,2)

(4)生化鑒定

對JQI-7進(jìn)行API-50生化鑒定，鑒定方法參考API-50鑒定試劑盒中廠商(API 50CHL，法國生物梅里埃)配備的說明書。

用途及原理：API50CH采用50個生化試驗用來對微生物的碳水化合物的代謝進(jìn)行研究。API50CH試條由50個微量孔組成，用以研究碳水化合物及其衍生物底物的發(fā)酵。用API50CHL培養(yǎng)基接種試條，使底物水解，然后檢測發(fā)酵試驗。試條孵育過程中，試條上的小管內(nèi)在厭氧環(huán)境下產(chǎn)酸，pH改變而使培養(yǎng)基中指示劑顏色變化，由此可觀察到發(fā)酵作用。試條上第一孔中不含任何活性成分，以此作為陰性控制。結(jié)果見表1。

表1.：JQI-7API-50試劑盒檢測結(jié)果(+表示陽性可利用此底物發(fā)酵，-表示陰性)

(5)細(xì)菌安全性

1)抗生素敏感性測試

采用微量稀釋法檢測JQI-7抗生素抗性。將測試抗菌藥物作一系列2倍比稀釋共12次并分別加入96孔板對應(yīng)孔(Gentamicin,Kanamycin,Streptomycin,Tetracycline,Erythromycin,Clindamycin,Chloramphenicol,Amplicilin,起始濃度分別為256ug/ml，1024ug/ml，256ug/ml，64ug/ml，8ug/ml，16ug/ml，64ug/ml，16ug/ml)，然后對應(yīng)孔加入適當(dāng)稀釋的試驗菌液，經(jīng)48h培養(yǎng)后觀察，以抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)孔，即為試驗菌株的敏感度。實驗結(jié)果見表2，實驗結(jié)果表明，抗生素MIC都在安全范圍內(nèi)。

并將菌株進(jìn)行抽提質(zhì)粒，未發(fā)現(xiàn)JQI-7攜帶任何質(zhì)粒，表明其無基因水平轉(zhuǎn)移可能性。

表2.：JQI-7對9種抗生素抗性測定結(jié)果

2)代謝物毒性檢測

乳酸旋光性檢測：使用愛爾蘭Megazyme公司的D-/L-乳酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果不產(chǎn)生D-乳酸。

硝酸鹽還原酶活性檢測：在無菌條件下，將活化好的菌株按3％的接菌量接入到硝酸鹽培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)5d后，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液各10滴， 觀察實驗結(jié)果。同時做空白實驗。實驗結(jié)果顯示所有菌液均未變藍(lán)，為陰性反應(yīng)。

吲哚實驗：無菌條件下，將活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)72h，加入吲哚試劑8～10滴，觀察實驗結(jié)果。同時做空白實驗。實驗結(jié)果未出現(xiàn)紅色圓環(huán)，表明其代謝不產(chǎn)生吲哚。

氨基脫羧酶活性檢測：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿性，滴加指示劑(溴甲酚紫)，呈黃色為陰性，呈紫色為陽性。實驗結(jié)果顯示

測定管呈黃色，為陰性。

3)細(xì)胞粘附能力的測定

將6孔板中的細(xì)胞單層培養(yǎng)物用不完全DMEM(不添加血清和雙抗)液37℃恒溫培養(yǎng)1h；將培養(yǎng)液吸出，用無菌PBS洗滌3次,將洗滌液吸干；取500μL10⁸cfu/mL的實驗菌株與500μL不完全DMEM混勻后，加入到6孔培養(yǎng)板中，同時設(shè)無細(xì)胞僅有菌液的空白對照，37℃，恒溫培養(yǎng)1.5h；取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)液吸干，用無菌PBS洗滌5次，吸干洗滌液；每孔加入10％甲醛,室溫固定2h；吸干固定液，用無菌PBS洗滌3遍，吸干洗滌液，室溫干燥；革蘭氏染色后鏡檢，隨機選取20個視野進(jìn)行計數(shù)，并計算粘附指數(shù)：

粘附指數(shù)＝細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)(即平均每個細(xì)胞粘附的細(xì)菌個數(shù))

菌株隨機選取20個視野，對視野中的細(xì)胞上粘附的細(xì)菌的總數(shù)和細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)并測定粘附指數(shù)，實驗結(jié)果JQI-7對人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29粘附指數(shù)為5.4，與對照干酪乳桿菌334菌株相當(dāng)，具有一定的細(xì)胞粘附能力。

實施例2：戊糖片球菌JQI-7降膽固醇體外功能驗證試驗

按照以下步驟檢測菌株體外膽固醇去除率，具體如下：

將供試菌株轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，以1％的接種量傳代2次后，于37℃培養(yǎng)15h，待用。配制液體MRS培養(yǎng)基，滅菌待用；

配制含有膽固醇的MRS培養(yǎng)基(培養(yǎng)液MRSO-CHOL)：由MRS液體培養(yǎng)基、巰基乙酸鈉、膽鹽和膽固醇組成，其中，巰基乙酸鈉在培養(yǎng)液MRSO-CHOL中的濃度為2g/L，膽鹽在培養(yǎng)液MRSO-CHOL中的濃度為0.3％，膽固醇的濃度為120ug/ml。

實驗組：活化菌液按1％接種量接種于10ml培養(yǎng)液MRSO-CHOL中。

對照組：10ml沒有接種菌株的培養(yǎng)液MRSO-CHOL。

將這兩組樣品放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出搖勻，4000r/m離心15min，取上清液，用鄰苯二甲醛顯色劑測定上清中膽固醇含量，并計算膽固醇的去除率，其中，膽固醇去除率＝對照組膽固醇與實驗組膽固醇的差值/對照組膽固醇含量。

實驗結(jié)果見圖3，戊糖片球菌JQI-7降膽固醇降低率為68.76％，表明戊糖片球菌JQI-7有較強體外降低膽固醇能力。

實施例3：戊糖片球菌JQI-7體外耐酸、耐膽汁試驗

配制模擬胃液SGF(2.0g NaCl+3.2g胃蛋白酶(pepsin)+適量濃鹽酸調(diào)PH值3.0)，用0.2μm微孔濾膜過濾后待用。挑取斜面菌種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18h。將菌懸液4000r/min離心15min，去上清，稱量菌體濕重，按照0.1g/ml的比列重新懸浮菌體于生理鹽水中，在按照1：10的比列加入到SGF液中，充分混勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。實驗結(jié)果見圖4，活菌數(shù)保持在一個數(shù)量級，表明戊糖片球菌JQI-7體外有較強的耐酸能力。

將活化兩次的菌液按1％量接入滅菌的含有0.3％膽鹽的10mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進(jìn)行生長曲線測定，實驗結(jié)果見圖5，表明戊糖片球菌JQI-7體外有較強的抗膽汁能力。

實施例4：戊糖片球菌JQI-7的體內(nèi)有效性研究(動物實驗)

1實驗菌株的制備：

將活化兩次的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18h，6000r/m離心10min，用滅菌生理鹽水洗滌后收集菌體。然后，加入0.85％生理鹽水，調(diào)整菌數(shù)約1.0×10⁹CFU/ml，然后將活菌按每日使用量分裝于15ml離心管(服用劑量為每天2ml/只，每組10只，共4組，需灌胃28天。

2實驗動物分組及飼養(yǎng)方式：

Sprague-Dawley系5周齡雄性大鼠，自由飼喂至第28天，平均分為4組，每組10只：

JQI-7組：灌胃活菌懸液，飼喂高脂飼料；

模型組：灌胃0.85％生理鹽水，飼喂高脂飼料；

正常組：灌胃0.85％生理鹽水，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料；

血脂康組：灌胃標(biāo)準(zhǔn)劑量血脂康，飼喂高脂飼料。

每天每只2ml灌胃，持續(xù)28天，然后停止灌胃，各組飼料、水不變持續(xù)28天。

3樣品采集與分析測試：

正式試驗前、第28天以及時間段進(jìn)行采血。采血方法為絕食一夜后，于大鼠股靜脈采血，凝血后4000r/m離心10min分離血清，利用試劑盒(試劑盒名稱：總膽固醇測定試劑盒，公司：浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)和)和變色酸顯色法，酶標(biāo)儀(公司：Molecular Devices，型號：Spectra MAX190)分別檢測膽固醇及甘油三酯。

4實驗結(jié)果

見圖6,7。用含JQI-7菌株菌懸液喂養(yǎng)高脂小鼠28天后股靜脈抽血檢測，發(fā)現(xiàn)與對照相比小鼠血液中甘油三酯及膽固醇分別下降23.8％及32.5％，表明戊糖片球菌JQI-7在小鼠體內(nèi)確有降低膽固醇及甘油三酯功效。

實施例5：藥物及食品的制備

(1)戊糖片球菌片劑：

配方：戊糖片球菌JQI-7的乳酸菌凍干粉(采用凍干機將乳酸菌配制成的菌懸液在無菌環(huán)境下冷凍成固態(tài)，抽真空將水分升華干燥而成的粉狀固體狀態(tài))、膳食纖維、山梨糖醇、微晶纖維素、硬脂酸鎂。將其混合均勻后，壓片制成片劑。

(2)戊糖片球菌發(fā)酵酸豆乳：

將豆粉和水進(jìn)行混合，均質(zhì)，以121℃超高溫滅菌300s殺菌，冷卻到42℃，接入活化好的發(fā)酵劑:保加利亞乳桿菌和嗜熱乳桿菌菌粉共0.4％。在42℃下發(fā)酵10h，冷卻后加入無糖片球菌JQI-7，凝乳，灌裝即可。

(3)以上藥品及食品的藥效試驗

試驗方案：同實施例4，其中灌胃的樣品改為以上三種藥品及食品搗碎后加無菌水制成的懸液，調(diào)整菌數(shù)約,1.0×10⁹CFU/ml

用含JQI-7菌株的藥品或食品喂養(yǎng)高脂小鼠28天后股靜脈抽血檢測，發(fā)現(xiàn)與對照相比小鼠血液中甘油三酯及膽固醇都有明顯下降的情況，戊糖片球菌JQI-7在小鼠體內(nèi)定植并發(fā)揮了作用，表明灌胃活菌在小鼠體內(nèi)確有降低膽固醇及甘油三酯功效。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。