本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種逆轉(zhuǎn)錄方法、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

逆轉(zhuǎn)錄又稱(chēng)為反轉(zhuǎn)錄，是以RNA為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA的過(guò)程，是DNA生物合成的一種特殊方式，由逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行催化。美國(guó)科學(xué)家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，并因此獲得了1975年的諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)對(duì)分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用，是構(gòu)建、表達(dá)真核或者原核生物目的基因，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，檢測(cè)基因序列等分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不可或缺的工具，與Taq酶等共同構(gòu)成了現(xiàn)代生物技術(shù)的的基礎(chǔ)工具。

基于逆轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)性作用，在逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)操作中，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多公司和個(gè)人嘗試對(duì)其中的材料和步驟進(jìn)行改良，并且申請(qǐng)專(zhuān)利。例如美國(guó)專(zhuān)利US6,436,677公開(kāi)了一種改良的逆轉(zhuǎn)錄酶，這個(gè)酶參與的逆轉(zhuǎn)錄需要錳參與，反應(yīng)溫度大于50℃，該溫度利于打開(kāi)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而利于逆轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行。美國(guó)專(zhuān)利US8,993,240采用的是另外一個(gè)思路，它采用特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)增加逆轉(zhuǎn)錄的特異性和針對(duì)性。又如株式會(huì)社百奧尼專(zhuān)利CN103348004B，它采用基因突變的方法改變逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的熱穩(wěn)定性，從而也能提高cDNA的轉(zhuǎn)換效率。目前，雖然在逆轉(zhuǎn)錄酶和材料上已經(jīng)進(jìn)行了諸多改良，然而具體的操作方法改進(jìn)很少，仍有很大的改進(jìn)空間。

經(jīng)典的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，先通過(guò)Trizol試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，接著通過(guò)氯仿將DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分層，進(jìn)一步通過(guò)異丙醇、乙醇等對(duì)RNA進(jìn)行分離和純化，檢測(cè)鑒定之后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，整個(gè)操作過(guò)程流程較長(zhǎng)，用時(shí)很多，而且由于RNA容易降解，長(zhǎng)流程的操作極大的增加了RNA的降解風(fēng)險(xiǎn)。為了獲得較好的RNA，操作時(shí)需謹(jǐn)慎小心，并且需要較為專(zhuān)業(yè)的人員進(jìn)行。綜合以上因素，經(jīng)典的方法總體成本較高，具有一定的技術(shù)門(mén)檻，不便于在基層醫(yī)院和小公司中普及。

由此可見(jiàn)，有必要探索和發(fā)明一種方法，嘗試從樣本(如組織、細(xì)胞或血液等)獲得cDNA，在保證較好的效果的基礎(chǔ)上簡(jiǎn)化操作步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種全新的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄方法及應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)錄方法，包括以下步驟：

(1)通過(guò)裂解試劑對(duì)樣本進(jìn)行裂解，

(2)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)裂解后的樣本直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，所述的裂解試劑為NP-40(乙基苯基聚乙二醇)裂解液，所述的NP-40裂解液配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質(zhì)量濃度為0.2％-5％，RNasin的濃度為1-10U。

在該優(yōu)選例中，RNasin為一種特異的RNA酶抑制劑，是一種酸性糖蛋白，可以從人的胎盤(pán)中提取獲得，也可以商業(yè)購(gòu)買(mǎi)。

在該優(yōu)選例中，優(yōu)選的步驟1)的裂解操作具體為：裂解操作在冰上進(jìn)行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10-30min，最優(yōu)為20min。

作為本發(fā)明的另一優(yōu)選例，所述的裂解試劑為堿裂解試劑，所述的堿裂解試劑配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M。

在該優(yōu)選例中，優(yōu)選的步驟1)的裂解操作具體為：裂解操作在冰上進(jìn)行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解5-20min，優(yōu)選10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U的RNasin，最優(yōu)濃度為2U/μl。

作為一種具體實(shí)施方式，所述的樣本可以為細(xì)胞、組織或血液等。

所述的樣本可來(lái)自微生物(如病毒、細(xì)菌、衣原體和真菌等)、人或動(dòng)植物。

本發(fā)明還提供了一種逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，其包含裂解試劑，所述的裂解試劑為NP-40裂解液或堿裂解試劑；所述的NP-40裂解液配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質(zhì)量濃度為0.2％-5％，最優(yōu)濃度為2％，RNasin的濃度為1-10U，最優(yōu)濃度為2U/μl；所述的堿裂解試劑配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M，最優(yōu)濃度為0.001M。

優(yōu)選地，所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄試劑。

更優(yōu)選地，所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑包含逆轉(zhuǎn)錄酶，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

優(yōu)選地，當(dāng)采用所述的兩種裂解液裂解細(xì)胞時(shí)，每1ml的裂解液可以裂解1×10⁴到1×10⁶個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞增多時(shí)，可以適當(dāng)增加裂解液的含量。逆轉(zhuǎn)錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉(zhuǎn)錄試劑。逆轉(zhuǎn)錄的試劑包含：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNasin，逆轉(zhuǎn)錄引物以及dNTPs等。

優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄體系包括：

5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉(zhuǎn)錄酶5U/μl；

20μM逆轉(zhuǎn)錄引物(如oligodT primer或者Random primer)；

RNasin；

總量20μl時(shí)，加入樣本裂解液0.5μl-4μl，最佳為2μl。

本發(fā)明還提供了所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在從樣本中獲得cDNA的過(guò)程中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種全新的從樣本獲得cDNA的方法，并提供了相應(yīng)的試劑盒，其具備以下優(yōu)點(diǎn)：

1、僅包括裂解和逆轉(zhuǎn)錄兩個(gè)步驟，裂解之后可以直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，省去了繁瑣的RNA抽提和分離的環(huán)節(jié)，因此大大降低了操作難度，普通的技術(shù)人員和醫(yī)生也能操作，有利于基因檢測(cè)等技術(shù)在基層的研究單位和醫(yī)院推廣；

2、大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，之前抽提RNA、逆轉(zhuǎn)錄以及定量PCR等過(guò)程需要一天時(shí)間才能完成，本發(fā)明的方法可以在半天之內(nèi)完成；

3、由于省去了繁瑣的RNA抽提過(guò)程，因此實(shí)驗(yàn)的成功率和可重復(fù)性也大大提高，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其效果良好；

4、僅需要裂解試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑，大大節(jié)省了成本；

5、本發(fā)明方法中各參數(shù)設(shè)置合理恰當(dāng)，取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果。

由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方法在基礎(chǔ)研究與臨床檢測(cè)等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：定量PCR溶解峰顯示兩種逆轉(zhuǎn)錄方法之間的比較。

圖2：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉(zhuǎn)錄方法之間的比較。

圖3：定量PCR溶解峰顯示兩種裂解試劑之間的比較。

圖4：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種裂解試劑之間的比較。

圖5：定量PCR溶解峰顯示兩種逆轉(zhuǎn)錄酶試劑之間的比較。

圖6：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉(zhuǎn)錄酶之間的比較。

圖7：定量PCR溶解峰顯示人和鼠基因之間的比較。

圖8：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示人和鼠基因之間的比較。

圖9：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示人血液細(xì)胞組織和口腔細(xì)胞之間的比較。

圖10：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示兩種逆轉(zhuǎn)錄方法在擴(kuò)增全長(zhǎng)基因方面的比較。

圖11：DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示腫瘤組織和正常組織之間的比較。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

在以下各實(shí)施例中：

NP-40裂解液的具體配方為：RNase-Free H₂O，NP-40，RNasin，其中NP-40的質(zhì)量濃度為為2％，RNasin的濃度為2U/μl。采用NP-40裂解液的具體裂解方法為：于1×10⁵個(gè)細(xì)胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解20min，所有操作在冰上進(jìn)行。

堿裂解試劑的具體配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.001M。采用堿裂解試劑的具體裂解方法為：于1×10⁵個(gè)細(xì)胞中加入1ml的裂解液，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10min，之后加入等量的HCl中和，再加入2U/μl的RNasin，所有操作在冰上進(jìn)行。

逆轉(zhuǎn)錄體系如下：

5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉(zhuǎn)錄酶5U/μl；

20μM逆轉(zhuǎn)錄引物；

RNasin；

總量20μl時(shí)，樣本裂解液2μl。

逆轉(zhuǎn)錄操作步驟為：冰上操作，配制20μl總逆轉(zhuǎn)錄體系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μl樣本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl20μM逆轉(zhuǎn)錄引物，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)，1μl 40U/μl RNasin。倘若逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV，則37℃恒溫15-60分鐘，85℃5秒，4℃保存。倘若逆轉(zhuǎn)錄酶為ALV，則42℃恒溫15-60分鐘，85℃5分鐘，4℃保存。

實(shí)施例1采用的是NP-40裂解液；實(shí)施例2采用的是NP-40裂解液和堿裂解試劑；實(shí)施例3采用的是堿裂解試劑；實(shí)施例4采用的是NP-40裂解液；實(shí)施例5采用的是堿裂解試劑；實(shí)施例6采用的是NP-40裂解液實(shí)施例7采用的是NP-40裂解液。

實(shí)施例1 傳統(tǒng)RNA抽提方法與本發(fā)明方法的比較

采用293T細(xì)胞，分別使用傳統(tǒng)的Trizol裂解抽提RNA的方法和本發(fā)明的方法提取RNA，再采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后通過(guò)定量PCR對(duì)內(nèi)參基因Gapdh和Tp53基因定量檢測(cè)，且為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，采用普通PCR方法擴(kuò)增上述兩個(gè)基因片段，然后進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否成功擴(kuò)增上述基因片段。引物序列見(jiàn)表1。

表1引物序列

定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的裂解細(xì)胞后直接逆轉(zhuǎn)錄的方法和傳統(tǒng)的抽提RNA之后再逆轉(zhuǎn)錄的方法其效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例2 兩種細(xì)胞裂解試劑之間的比較

為了檢測(cè)不同的裂解液是否能獲得相同的效果，普通的RNA抽提采用的Trizol裂解液雖然能最大限度地裂解細(xì)胞，然而也會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，因此我們不斷研究嘗試新的裂解方法和裂解試劑。經(jīng)過(guò)摸索，找出了兩種細(xì)胞裂解試劑：NP-40裂解試劑和堿裂解試劑。采用293T細(xì)胞，將堿裂解液KOH，NP-40裂解液和Trizol抽提的RNA進(jìn)行對(duì)比，用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用定量PCR方法對(duì)Tp53的基因定量檢測(cè)，且為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，再采用普通PCR和DNA瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的NP-40裂解試劑和堿裂解試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的方法其效果是相當(dāng)?shù)?，且研究過(guò)程中表明其效果均顯著優(yōu)于其他裂解試劑。

實(shí)施例3 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的比較

采用293T細(xì)胞，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，檢測(cè)內(nèi)參基因Gapdh，分別進(jìn)行試驗(yàn)，產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，同時(shí)經(jīng)普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶其效果相當(dāng)。

實(shí)施例4 人和小鼠細(xì)胞的比較

采用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞分別進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)內(nèi)參基因Gapdh，產(chǎn)物進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，同時(shí)經(jīng)普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果表明，樣本為人或小鼠細(xì)胞其效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例5 人血液組織和人口腔上皮細(xì)胞的比較

采用人血液組織和口腔上皮細(xì)胞分別進(jìn)行試驗(yàn)，產(chǎn)物經(jīng)普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果表明，樣本為人血液組織和人口腔上皮細(xì)胞其效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例6 擴(kuò)增全長(zhǎng)基因比較

擴(kuò)增Kras基因(擴(kuò)增后595bp)以及Tp53基因(擴(kuò)增后1410bp)。通過(guò)在293T細(xì)胞以及人口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行裂解之后采用Trizol方法和本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表2。

表2引物序列

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)的抽提RNA之后再逆轉(zhuǎn)錄的方法相比，在擴(kuò)增全長(zhǎng)基因方面其效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例7 腫瘤組織和正常組織(距離腫瘤組織6cm)的比較

取肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織分別進(jìn)行試驗(yàn)，產(chǎn)物進(jìn)行Gapdh和Tp53基因的檢測(cè)，即經(jīng)普通PCR之后再采用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖11。結(jié)果表明，樣本為腫瘤組織和正常組織其效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

實(shí)施例8 本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(一)

所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒包含裂解試劑，所述的裂解試劑為NP-40裂解試劑，配方為：RNase-Free H₂O，NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，RNasin，其中NP-40的質(zhì)量濃度為0.2％-5％，最適濃度為2％；RNasin的濃度為1-10U/μl，最適濃度為2U/μl。

所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒還包含說(shuō)明書(shū)，且說(shuō)明書(shū)記載以下內(nèi)容：裂解操作在冰上進(jìn)行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解10-30min，最優(yōu)20min，裂解后的樣本即可直接逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉(zhuǎn)錄試劑。

實(shí)施例9 本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(二)

所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒包含裂解試劑，所述的裂解試劑為堿裂解試劑，配方為：RNase-Free H₂O，KOH，其中KOH的濃度為0.00001-0.01M，最適濃度為0.001M。

所述的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒還包含說(shuō)明書(shū)，且說(shuō)明書(shū)記載以下內(nèi)容：裂解操作在冰上進(jìn)行，采用RNase-free槍頭輕輕吹打，裂解5-20min，最優(yōu)10min，之后加入等量的HCl中和，再加入1-10U/μl的RNasin，最佳濃度為2U/μl，裂解后的樣本即可直接逆轉(zhuǎn)錄。

針對(duì)上述兩種試劑盒，當(dāng)采用上述兩種裂解液裂解細(xì)胞時(shí)，每1ml的裂解液可以裂解1×10⁴到1×10⁶個(gè)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞增多時(shí)，可以適當(dāng)增加裂解液的含量。逆轉(zhuǎn)錄的試劑可以采用常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄方法和試劑，如商業(yè)在售的逆轉(zhuǎn)錄試劑。

逆轉(zhuǎn)錄的試劑包含：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNasin，逆轉(zhuǎn)錄引物以及dNTPs等。

逆轉(zhuǎn)錄體系包括：

5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液：250mM Tris-HCl pH8.3；375mM KCl；15mM MgCl₂；50mM DTT；

10mM dNTPs；

逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)；

20μM逆轉(zhuǎn)錄引物(如oligodT primer或者Random primer)；

RNasin；

本發(fā)明方法中，20μl總逆轉(zhuǎn)錄體系中，樣本裂解液的適宜范圍是0.5μl-4μl，最佳的含量為2μl。

逆轉(zhuǎn)錄操作步驟示例如下：

冰上操作，配制20μl總逆轉(zhuǎn)錄體系，RNase-free EP管中依次加入4μl 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2μl樣本裂解液，1μl 10mM dNTPs，1μl 20μM逆轉(zhuǎn)錄引物，1μl逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)，1μl 40U/μl RNasin，13μl RNase-fre H₂O。倘若逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV，則37℃恒溫15-60分鐘(具體時(shí)間由逆轉(zhuǎn)錄cDNA長(zhǎng)度決定)，85℃5秒，4℃保存。倘若逆轉(zhuǎn)錄酶為ALV，則42℃恒溫15-60分鐘(具體時(shí)間由逆轉(zhuǎn)錄cDNA長(zhǎng)度決定)，85℃5分鐘，4℃保存。獲得的cDNA可以用于PCR等下一步實(shí)驗(yàn)或者檢測(cè)。

本技術(shù)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 唐旌生物科技（上海）有限公司

<120> 一種逆轉(zhuǎn)錄方法、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及其應(yīng)用

<130> /

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 3

gaggttggct ctgactgtac c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaacaagaag tggagaatgt ca 22