本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，涉及乳酸片球菌及其用途，更具體，涉及乳酸片球菌及其用途，更具體地，涉及乳酸片球菌及其在制備食品或藥物中的用途、食品及藥物。
背景技術(shù)：
：高膽固醇血癥也稱高低密度脂蛋白膽固醇血癥，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心血管病的首要危險因素。最新研究顯示，各種心血管病風(fēng)險人群低密度脂蛋白每降低1mmol/L，主要血管事件可降低21％。據(jù)2013年的統(tǒng)計顯示，我國約有2億臨界高膽固醇血癥人群以及8800萬高膽固醇血癥患者。而我國成人中高膽固醇的知曉率、治療率、控制率僅為11％、5.1％和2.8％。在第四屆中國慢病管理大會心腦血管疾病防治論壇上，多位專家呼吁，政策制定者、醫(yī)務(wù)人員以及公眾都應(yīng)認識到控制血脂在心腦血管疾病防治中的重要作用，真正做到危險因素的綜合管理。當前針對預(yù)防心血管疾病，提倡遵守低脂或低飽和脂肪食物的膳食原則。大量的實驗證明，低脂食物能有效減少血清中膽固醇的含量，但低脂食物的口感和風(fēng)味比較簡單，這個膳食建議仍未被大眾接受或長期堅持，因此人群血清膽固醇水平呈逐年增高趨勢。由于低脂膳食主張的低接受性，人們愿望開發(fā)出其他可以降低血清膽固醇及血脂的膳食補充品。最早發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠降低機體內(nèi)膽固醇含量源于上世紀七十年代Mann的發(fā)現(xiàn)，他發(fā)現(xiàn)飲用發(fā)酵乳制品人的體內(nèi)具有較低的膽固醇含量，在1985年，研究者Gilliland等開展了嗜酸乳桿菌進行體外降膽固醇的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌能夠降低發(fā)酵液中的膽固醇含量。Grill等給血清總膽固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌制劑，8個月后發(fā)現(xiàn)被測人群血清膽固醇含量均顯著下降。目前國內(nèi)針對降膽固醇功能研究比較深入的兩個菌株同屬于植物乳桿菌，分別為L.plantarumP8和植物乳桿菌ST-III。L.plantarumP8來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的張和平領(lǐng)導(dǎo)的團隊，動物試驗表明，L.plantarumP8具有顯著的降血脂作用。曾任東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院副院長，現(xiàn)任光明乳業(yè)股份有限公司總經(jīng)理郭本恒領(lǐng)導(dǎo)的團隊和江南大學(xué)合作研發(fā)的植物乳桿菌ST-III，在大量基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，成功通過動物實驗和人群臨床試驗的證實其降膽固醇的效果，并已產(chǎn)業(yè)化，成為光明公司的一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的益生菌產(chǎn)品。這也充分表明了具有降膽固醇的乳酸菌在發(fā)酵食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是緩解國內(nèi)高血脂人群日益增長的嚴峻趨勢，提供一種具有降膽固醇、降甘油三酯功能的乳酸片球菌JQII-5，及其在制備食品或藥物等方面的用途。本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明公開了一種乳酸片球菌，其于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo.10512，保藏名稱為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)JQII-5。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的乳酸片球菌JQII-5不僅具有優(yōu)異的益生作用，還有耐酸和耐膽鹽能力，能夠長期保存，并能有效用于降低血脂，具體地，可有效降低血液中膽固醇和甘油三酯。本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了所述乳酸片球菌在制備食品或藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，對動物提供本發(fā)明的乳酸片球菌，能夠有效降低血脂，尤其是膽固醇和甘油三酯。因而，所述食品或藥物用于降低血脂。本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種組合物。所述組合物包含上述所述的乳酸片球菌，能夠有效降低血脂，尤其是膽固醇和甘油三酯。因而，所述組合物用于降低血脂。本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種藥物。所述藥物包含：前面所述的乳酸片球菌；以及醫(yī)藥用無毒載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述已用無毒載體不受特別限制，只要能夠使所述藥物形成容易給藥的劑型即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體情況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述醫(yī)藥用無毒載體為選自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理食鹽水的至少一種。由此，本發(fā)明的藥物能夠有效形成容易給藥的劑型，便于給藥。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的藥物進一步包括：穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑的至少一種。具體地，該藥物為復(fù)合益生菌片。所述復(fù)合益生菌片包括：前面所述的乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌、菊粉、膳食纖維(抗性糊精)、山梨糖醇、微晶纖維素、硬脂酸鎂，將其混合均勻后，壓片制成片劑。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物的給藥劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)給藥對象的健康狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，將所述藥物以2.0×109CFU活菌/天的劑量對動物進行給藥。由此，被給藥動物的膽固醇含量和甘油三酯含量明顯降低。本發(fā)明的第五方面，還提供了一種食品。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品包含：前面所述的乳酸片球菌；以及食品學(xué)上可接受的添加劑。具體地，所述食品為酸豆乳飲品。所述的酸豆乳飲品包含：豆粉、菊粉、白砂糖、保加利亞乳桿菌和嗜熱乳桿菌，在42℃發(fā)酵10h，然后加入0.1％前面所述的乳酸片球菌和0.1％的戊糖片球菌。具有將低血脂的作用，尤其是降低膽固醇和甘油三酯。需要說明的是，本文中所使用的術(shù)語“食品”應(yīng)作廣義理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常規(guī)的食品形式外，本發(fā)明的食品還可以為保健品、飲品、發(fā)酵食品等，并且，發(fā)酵食品也包括動物的飼料。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述食品的攝取劑量不受特別限制，實際應(yīng)用中，可以根據(jù)實際狀況靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，將所述食品以2.0×109CFU活菌/天的劑量提供給動物。由此，服用過了本發(fā)明食品的動物的膽固醇含量和甘油三酯含量明顯降低。另外，需要說明的是，本發(fā)明的乳酸片球菌可以與通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷類及薯類：谷類包括米、面、雜糧，薯類包括馬鈴薯、紅薯等；動物性食物，包括肉、禽、魚、奶、蛋等；豆類及其制品，包括大豆及其他干豆類；蔬菜水果類，包括鮮豆、根莖、葉菜、茄果等；純熱能食物，包括動植物油、淀粉、食用糖和酒類等。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得更加容易理解：圖1：乳酸片球菌JQII-5的光鏡下的形態(tài)圖；圖2：乳酸片球菌JQII-5的10000倍電鏡下的形態(tài)圖；圖3：乳酸片球菌JQII-5體外去除膽固醇的結(jié)果圖。其中：縱坐標表示膽固醇降解率，橫坐標表示組別。圖4：乳酸片球菌JQII-5體外酸耐受結(jié)果圖。圖5：乳酸片球菌JQII-5體外膽鹽耐受結(jié)果圖。圖6：乳酸片球菌JQII-5在動物體內(nèi)降甘油三酯(Triglyceride，TG)結(jié)果圖。其中：縱坐標表示甘油三酯(TG)的含量(mmol/L)；橫坐標表示不同的組別。圖7：乳酸片球菌JQII-5在動物體內(nèi)降膽固醇(totalcholesterol，TC)結(jié)果圖。其中：縱坐標表示膽固醇(TC)的含量(mmol/L)；橫坐標表示不同組別。圖8：酸豆乳喂食高脂模型大鼠，大鼠體內(nèi)膽固醇(TC)的含量變化圖。圖9：酸豆乳喂食高脂模型大鼠，大鼠體內(nèi)甘油三酯(TG)的含量變化圖。具體實施方式益生菌定植于人體腸道、生殖道內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用。人體、動物體內(nèi)的益生菌主要有：乳酸菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、放線菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最強大的產(chǎn)品主要是以上各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。本發(fā)明的乳酸片球菌JQII-5是一種乳酸菌，能夠有效的降低膽固醇和甘油三酯，可作為食品及藥物的成分，改善人體高血脂癥狀。本發(fā)明的新菌株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)JQII-5已經(jīng)于2015年2月2日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，保藏單位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCCNo.10512。光學(xué)顯微鏡下，乳酸片球菌JQII-5在MRS培養(yǎng)基中呈球狀。一般細胞成對或四聯(lián)生，不成鏈狀排列。直徑為0-1μm，無芽孢，胞壁結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)均勻，如圖1、圖2所示。不含質(zhì)粒，代謝物不產(chǎn)生D-乳酸、吲哚等有毒物質(zhì)，不表達硝基還原酶、也不具備產(chǎn)生物胺的能力，9種抗生素MIC(Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin、Vancomycin)均符合EFSA(歐洲食品藥品監(jiān)督局)規(guī)定。乳酸片球菌JQII-5菌株體外降低膽固醇試驗中發(fā)現(xiàn)，與對照相比，加入了乳酸片球菌JQII-5的高膽固醇溶液，在細菌加入24小時后，膽固醇的去除率達到74.49％，表明乳酸片球菌JQII-5體外確有降低膽固醇功能(圖3)。進一步將乳酸片球菌JQII-5菌株接種到pH為3.0的酸性環(huán)境與接種到pH6.8的中性環(huán)境中，2小時后進行活菌計數(shù)，發(fā)現(xiàn)pH3.0中與pH6.8相比，活菌數(shù)保持在一個數(shù)量級；同時，乳酸片球菌JQII-5菌株在含0.3％的膽汁鹽的MRS液體培養(yǎng)基的生產(chǎn)曲線穩(wěn)定，表明乳酸片球菌JQII-5對酸和膽汁都有良好的耐受性(圖4，5)。動物實驗中，將乳酸片球菌JQII-5喂食高膽固醇、高脂模型小鼠，在喂食28天以后，小鼠血液中甘油三酯及膽固醇含量與喂食生理鹽水的對照組小鼠相比，分別降低了19.8％和26.5％以上(圖6,7)，表明乳酸片球菌JQII-5能夠有效降低小鼠的高甘油三脂，高膽固醇癥狀。將乳酸片球菌JQII-5用于制備復(fù)合益生菌片和酸豆乳飲品，并用酸豆乳飲品和高脂飼料喂食大鼠，在喂食28天以后，小鼠血液中甘油三酯及膽固醇含量分別降低了12％及15.5％以上(圖8，9)，表明乳酸片球菌JQII-5能夠有效降低小鼠的高甘油三脂，高膽固醇癥狀。以上研究表明，乳酸片球菌JQII-5菌株對模擬胃液和人工腸液環(huán)境抗性良好，體外、體內(nèi)可明顯降低膽固醇及甘油三酯。表明本文發(fā)明的乳酸片球菌JQII-5菌株已經(jīng)具備成為藥用菌的必備條件，可用于開發(fā)成應(yīng)為新藥、食品、保健品以及食品添加劑等。下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：乳酸片球菌JQII-5的分離鑒定(1)培養(yǎng)基配方優(yōu)化分組進行優(yōu)化培養(yǎng)基實驗，最后得到乳酸菌培養(yǎng)基最佳配方：MRS固體培養(yǎng)基1L配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，吐溫801.0g/L，檸檬酸三銨2.0g/L，醋酸鈉5.0g/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸錳0.05g/L，瓊脂17.5g；MRS肉湯培養(yǎng)基配方較MRS瓊脂培養(yǎng)基僅無瓊脂。調(diào)整pH至6.5，121℃滅菌20min。培養(yǎng)基制備完成，4℃冷藏備用。(2)乳酸片球菌JQII-5菌種的分離篩選本實施例以各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品為樣品，如酸奶、泡菜等，用無菌生理鹽水，10倍梯度稀釋樣品后至10-3倍，將其涂布于MRS固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，觀察菌落形態(tài)特征，并挑取MRS固體培養(yǎng)基上乳酸菌的疑似菌落，分別轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)。共分離出若干株菌，對每株菌進行編號。對分離純化得到的這若干株菌進行酸及膽鹽耐受力及降膽固醇能力的測定，詳細實驗步驟見實施例2和實施例3，從中篩選得到酸及膽鹽耐受力較強，降膽固醇能力較強的JQII-5。JQII-5來源于酸奶。(3)16srDNA菌種鑒定對JQII-5抽提細菌總DNA，進行16srDNA擴增，引物為：sgF:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(SEQIDNO：1)sgR:5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQIDNO：2)利用上述引物進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收、測序。分離獲得的菌株16sDNA測序結(jié)果如SEQIDNO:3所示(1264bp)：5'-GCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAG-3’(SEQIDNO：3)測序結(jié)果利用BLAST工具在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，分離獲得的菌株16srDNA堿基序列與乳酸片球菌顯示出99％的同源性，表明分離獲得的菌株為乳酸片球菌。將該菌株命名為乳酸片球菌JQII-5，其于2015年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.10512。。(3)菌落特征JQII-5細胞革蘭氏染色呈陽性，形態(tài)為球狀。一般細胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列，不運動，不產(chǎn)芽孢，無莢膜，過氧化氫酶實驗陰性，是兼性厭氧的細菌。在MRS固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18h，菌落直徑為0.8～1.4mm，乳白色，有光澤，不透明，邊緣整齊，扁平。(見圖1,2)(4)生化鑒定對JQII-5進行API-50生化鑒定，鑒定方法參考API-50鑒定試劑盒中廠商配備的說明書(API50CHL，法國生物梅里埃)。用途及原理：API50CH采用50個生化試驗用來對微生物的碳水化合物的代謝進行研究。API50CH試條由50個微量孔組成，用以研究碳水化合物及其衍生物底物的發(fā)酵。用API50CHL培養(yǎng)基接種試條，使底物水解，然后檢測發(fā)酵試驗。試條孵育過程中，試條上的小管內(nèi)在厭氧環(huán)境下產(chǎn)酸，pH改變而使培養(yǎng)基中指示劑顏色變化，由此可觀察到發(fā)酵作用。試條上第一孔中不含任何活性成分，以此作為陰性控制。結(jié)果見表1(+表示陽性，可以利用此底物發(fā)酵；-表示陰性)。表1：API-50生化鑒定結(jié)果(+表示陽性，可疑利用此底物發(fā)酵；-表示陰性)碳源JQII-5碳源JQII-5空白對照﹣七葉靈﹢甘油﹣柳醇±赤癬醇﹣纖維二糖﹢D-阿拉伯糖﹣麥芽糖﹣L-阿拉伯糖﹢乳糖﹣核糖﹢蜜二糖﹣D-木糖﹢蔗糖﹣L-木糖﹣海藻糖﹢阿東醇﹣菊糖﹣β-甲基-D-木糖苷﹣松叁糖﹣半乳糖﹢棉子糖﹣葡萄糖﹢淀粉﹣果糖﹢肝糖﹣甘露糖﹢木糖醇﹣山梨糖﹣龍膽二糖±鼠李糖±D-松二糖﹣衛(wèi)茅醇﹣D-來蘇糖﹣肌醇﹣D-塔格糖±甘露醇﹣D-巖糖﹣山梨醇﹣L-巖糖﹣α-甲基-D-甘露糖苷﹣D-阿拉伯糖醇﹣α-甲基-D-葡萄糖苷﹣L-阿拉伯糖醇﹣N-乙酰-葡糖胺±葡萄糖酸鹽﹣苦杏仁苷±2-酮基葡糖糖酸鹽﹣熊果苷﹣5-酮基葡糖糖酸鹽﹣將表1的結(jié)果輸入API50CHL數(shù)據(jù)庫得出JQII-5為乳酸片球菌。(5)細菌安全性a、抗生素敏感性測試采用微量稀釋法檢測JQII-5抗生素抗性。將測試抗菌藥物(Gentamicin,Kanamycin,Streptomycin,Tetracycline,Erythromycin,Clindamycin,Chloramphenicol,Amplicilin，起始濃度分別為256ug/ml，1024ug/ml，256ug/ml，64ug/ml，8ug/ml，16ug/ml，64ug/ml，16ug/ml)作一系列2倍比稀釋共12次并分別加入96孔板對應(yīng)孔，然后對應(yīng)孔加入2ml稀釋的試驗菌液，經(jīng)48h培養(yǎng)后觀察，以抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)孔，即為試驗菌株的敏感度。實驗結(jié)果(見表2)表明，抗生素MIC都在安全范圍內(nèi)。并將菌株進行抽提質(zhì)粒，未發(fā)現(xiàn)JQII-5攜帶任何質(zhì)粒，表明其無基因水平轉(zhuǎn)移可能性。表2：9種抗生素敏感性測定結(jié)果b、代謝物毒性檢測乳酸旋光性檢測：使用愛爾蘭Megazyme公司的D-/L-乳酸檢測試劑盒。實驗結(jié)果不產(chǎn)生D-乳酸。硝酸鹽還原酶活性檢測：在無菌條件下，將活化好的菌株按3％的接菌量接入到硝酸鹽培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)5d后，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液各10滴，觀察實驗結(jié)果。同時做空白實驗。實驗結(jié)果顯示所有菌液均未變藍，為陰性反應(yīng)。吲哚實驗：在無菌條件下，將活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)72h，加入吲哚試劑8～10滴，觀察實驗結(jié)果。同時做空白實驗。實驗結(jié)果未出現(xiàn)紅色圓環(huán)，表明其代謝不產(chǎn)生吲哚。氨基脫羧酶活性檢測：具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿性，滴加指示劑(溴甲酚紫)，呈黃色為陰性，呈紫色為陽性。實驗結(jié)果顯示測定管呈黃色，為陰性。c、細胞粘附能力的測定將6孔板中的細胞單層培養(yǎng)物用不完全DMEM(不添加血清和雙抗)換液37℃恒溫培養(yǎng)1h；將培養(yǎng)液吸出，用無菌PBS洗滌3次,將洗滌液吸干；取500μL108CFU/mL的實驗菌株與500μL不完全DMEM混勻后，加入到6孔培養(yǎng)板中，同時設(shè)無細胞僅有菌液的空白對照，37℃，恒溫培養(yǎng)1.5h；取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)液吸干，用無菌PBS洗滌5次，吸干洗滌液；每孔加入10％甲醛,室溫固定2h；吸干固定液，用無菌PBS洗滌3遍，吸干洗滌液，室溫干燥；革蘭氏染色后鏡檢，隨機選取20個視野進行計數(shù)，并計算粘附指數(shù)：粘附指數(shù)＝細菌/細胞數(shù)(即平均每個細胞粘附的細菌個數(shù))菌株隨機選取20個視野，對視野中的細胞上粘附的細菌的總數(shù)和細胞數(shù)進行計數(shù)并測定粘附率，實驗結(jié)果JQII-5對人結(jié)腸癌細胞系HT-29粘附指數(shù)為5.9，與對照干酪乳桿菌334菌株相當，具有一定的細胞粘附能力。實施例2：乳酸片球菌JQII-5降膽固醇體外功能試驗按照以下步驟檢測實施例1分離獲得的菌株體外膽固醇去除率，具體如下：(1)菌株的活化：將供試菌株轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，以1％的接種量傳代2次后，于37℃培養(yǎng)15h，待用；(2)配制MRS培養(yǎng)基，滅菌待用；(3)配制含有膽固醇的MRS培養(yǎng)基(培養(yǎng)液MRSO-CHOL)：由MRS液體培養(yǎng)基、巰基乙酸鈉、膽鹽和膽固醇組成，其中，巰基乙酸鈉在培養(yǎng)液MRSO-CHOL中的濃度為2g/L，膽鹽在培養(yǎng)液MRSO-CHOL中的濃度為0.3％，膽固醇終濃度為120ug/ml。(4)降膽固醇能力的測定實驗組：活化菌液按1％接種量接種于10ml培養(yǎng)液MRSO-CHOL中。對照組：10ml沒有接種菌株的培養(yǎng)液MRSO-CHOL。將這兩組樣品放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出搖勻，4000r/m離心15min，取上清液，用鄰苯二甲醛顯色劑測定上清中膽固醇含量，并計算膽固醇的去除率，其中，膽固醇去除率＝對照組膽固醇與實驗組膽固醇的差值/對照組膽固醇含量。實驗結(jié)果見圖3，乳酸片球菌JQII-5降膽固醇降低率為74.49％，表明乳酸片球菌JQII-5有較強體外降低膽固醇能力。實施例3：乳酸片球菌JQII-5體外酸及膽鹽耐受力試驗配制模擬胃液SGF(2.0gNaCl+3.2g胃蛋白酶(pepsin)+適量濃鹽酸調(diào)PH值3.0)，用0.2μm微孔濾膜過濾后待用。挑取斜面菌種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～18h。將菌懸液4000r/min離心15min，去上清，稱量菌體濕重，按照0.1g/ml的比列重新懸浮菌體于生理鹽水中，在按照1：10的比列加入到SGF液中，充分混勻后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，進行細胞計數(shù)。實驗結(jié)果見圖4，活菌數(shù)保持在一個數(shù)量級，表明乳酸片球菌JQII-5體外有較強的耐酸能力。將活化兩次的菌液按1％量接入滅菌的含有0.3％膽鹽的10mLMRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進行生長曲線測定，實驗結(jié)果見圖5，表明乳酸片球菌JQII-5體外有較強的抗膽汁能力。實施例4：乳酸片球菌JQII-5的體內(nèi)有效性研究(動物實驗)1、實驗菌株的制備：將活化兩次的乳酸片球菌JQII-5接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)18h，6000r/m離心10min，用滅菌生理鹽水洗滌后收集菌體。然后，加入0.85％生理鹽水，調(diào)整菌數(shù)約1.0×109CFU/ml，然后將活菌按每日使用量分裝于15ml離心管(服用劑量為每天2ml/只，每組10只，共4組，需灌胃28天。2、實驗動物分組及飼養(yǎng)方式：Sprague-Dawley系5周齡雄性大鼠，40只，自由飼喂至第28天，平均分為4組，每組10只：JQII-5組：灌胃活菌懸液，飼喂高脂飼料；模型組：灌胃0.85％生理鹽水，飼喂高脂飼料；正常組：灌胃0.85％生理鹽水，飼喂標準飼料；血脂康組：灌胃標準劑量血脂康，飼喂高脂飼料。每天每只2ml灌胃，持續(xù)28天，然后停止灌胃，各組飼料、水不變持續(xù)28天。3、樣品采集與分析測試：正式試驗前、第28天以及時間段進行采血。采血方法為絕食一夜后，于大鼠股靜脈采血，凝血后4000r/m離心10min分離血清，利用試劑盒(試劑盒名稱：總膽固醇測定試劑盒，公司：浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)和變色酸顯色法，標儀(公司：MolecularDevices，型號：SpectraMAX190)分別檢測膽固醇及甘油三酯。4、實驗結(jié)果實驗結(jié)果見圖6、7。用含JQII-5菌株菌懸液喂養(yǎng)高脂小鼠28天后股靜脈抽血檢測，發(fā)現(xiàn)與對照相比小鼠血液中甘油三酯(TG)及膽固醇(TC)分別下降19.8％及26.5％，表明乳酸片球菌JQII-5在小鼠體內(nèi)確有降低膽固醇及甘油三酯功效。實施例5：藥物及食品的制備(1)復(fù)合益生菌片：配料：復(fù)合益生菌(嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌)、菊粉、膳食纖維(抗性糊精)、山梨糖醇、微晶纖維素、硬脂酸鎂。將其混合均勻后，壓片制成片劑。(2)酸豆乳飲品(原味)豆粉，菊粉，白砂糖，水按重量比18:3:6:73進行混料，均質(zhì)，以121℃超高溫滅菌300s殺菌，冷卻到42℃，接入活化好的發(fā)酵劑:保加利亞乳桿菌和嗜熱乳桿菌菌粉共0.4％。在42℃下發(fā)酵10h。發(fā)酵后產(chǎn)物進行調(diào)配，冷卻至37℃加入0.1％的乳酸片球菌JQII-5和0.1％的戊糖片球菌JQI-7，兩種菌均為108CFU/ml。凝乳，灌裝即可。(3)酸豆乳飲品(無糖型)豆粉，菊粉，赤蘚糖醇，水按重量比18:3:6:73進行混料，均質(zhì)，以121℃超高溫滅菌300s殺菌，冷卻到42℃，接入活化好的發(fā)酵劑:保加利亞乳桿菌和嗜熱乳桿菌菌粉共0.4％。在42℃下發(fā)酵10h。發(fā)酵后產(chǎn)物進行調(diào)配，冷卻至37℃加入0.1％的乳酸片球菌JQII-5和0.1％的戊糖片球菌JQI-7，兩種菌均為108CFU/ml。凝乳，灌裝即可。(4)藥效試驗Sprague-Dawley系5周齡雄性大鼠，30只，分為3組，每組10只：酸豆乳組：每日喂食50ml酸豆乳+高脂飼料；模型組：每日喂食50ml普通牛奶+飼喂高脂飼料；正常組：每日喂食50ml普通牛奶+飼喂標準飼料；持續(xù)28天，正式試驗前、第28天以及時間段進行采血。采血方法為絕食一夜后，于大鼠股靜脈采血，凝血后4000r/m離心10min分離血清，利用試劑盒(試劑盒名稱：總膽固醇測定試劑盒，公司：浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)和變色酸顯色法，標儀(公司：MolecularDevices，型號：SpectraMAX190)分別檢測膽固醇及甘油三酯。實驗結(jié)果見圖8和圖9，用無糖型酸豆乳喂養(yǎng)的高脂大鼠28天后股靜脈抽血檢測，發(fā)現(xiàn)與對照相比，血液中甘油三酯及膽固醇分別下降12％及15.5％，本品酸豆乳在小鼠體內(nèi)確有降低膽固醇及甘油三酯功效。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當前第1頁1 2 3