本發(fā)明涉及微生物肥料制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種微生物多功能肥的制備方法與發(fā)酵培養(yǎng)基組成。
背景技術(shù)：
：我國(guó)人口多，人均耕地面積少，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。土壤施肥是一種常用的增產(chǎn)途徑。目前，農(nóng)業(yè)上使用的肥料包括微生物肥料和化學(xué)肥料。長(zhǎng)期施用化學(xué)肥料會(huì)造成土壤板結(jié)；且當(dāng)前基于“綠色”、“環(huán)?！钡慕】道砟?，人們對(duì)無(wú)污染、安全、衛(wèi)生的綠色食品的需求日益增加，使得微生物肥料備受青睞。另外，施用微生物肥料可減少化學(xué)肥料的施用，改善土壤，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)；而且微生物肥料具有長(zhǎng)效、無(wú)毒、無(wú)污染、節(jié)約資源、成本低等特點(diǎn)，可彌補(bǔ)化學(xué)肥料的缺點(diǎn)和不足。地面肥是植物吸收營(yíng)養(yǎng)成分的重要途徑，葉面肥是植物吸收營(yíng)養(yǎng)成分的重要補(bǔ)充。隨著植物生長(zhǎng)過(guò)程中各種病蟲(chóng)害影響的加劇，如果施用既能促進(jìn)植物生長(zhǎng)又能拮抗植物病害的微生物肥料，將有利于植物、作物的增產(chǎn)增收，提高農(nóng)戶(hù)經(jīng)濟(jì)利益。因此，可以利用研發(fā)的優(yōu)良菌株，進(jìn)行發(fā)酵，獲得的發(fā)酵產(chǎn)物，制備成地面肥、葉面肥、拌種肥等多功能微生物肥。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種應(yīng)用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）BS501a制備微生物肥的方法和發(fā)酵生產(chǎn)微生物肥的培養(yǎng)基配方，制得的微生物多功能肥既能防治植物病害，又能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種微生物多功能肥的制備方法，包括如下操作步驟：（1）培養(yǎng)基配制：分別配制菌種活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫滅菌后備用；所述菌種活化培養(yǎng)基為：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，加水至1L，pH7.0-7.5；所述種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，加水至1L，pH7.0-7.5；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖15000g，蛋白胨10000g，酵母膏5000g，KH2PO41300g，K2HPO41000g，MgSO4·7H2O500g，MnSO4·H2O100g，F(xiàn)eSO4·7H2O100g，CaC12·2H2O1500g，加水至1000L，pH7.0-7.5；（2）菌種活化：挑取斜面保藏的BacillussubtilisBS501a接種于步驟（1）制得的菌種活化培養(yǎng)基中，于35-37℃，180-220r/min搖床振蕩培養(yǎng)16-24h，得活化枯草芽孢桿菌菌液；（3）液體種子制備：按5％-10％（體積百分?jǐn)?shù)）的接種量將步驟（2）活化的枯草芽孢桿菌菌液接種于步驟（1）制得的種子培養(yǎng)基中，于35-37℃，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)16-24h，得到液體種子；（4）液態(tài)發(fā)酵：按5％-10％（體積百分?jǐn)?shù)）的接種量將步驟（3）制得的液體種子接種于步驟（1）制得的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，通無(wú)菌空氣培養(yǎng)48h，經(jīng)平板細(xì)菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)達(dá)1×109-9×109CFU/mL，即得活菌體培養(yǎng)物；（5）葉面肥和拌種肥制備：將步驟（4）制得的活菌體培養(yǎng)物靜置，菌體沉淀。除去菌體，即得微生物葉面肥和拌種肥；（6）地面肥的制備：將步驟（4）獲得的活菌體培養(yǎng)物通風(fēng)干燥，即獲得地面肥。上述微生物多功能肥的使用方法：拌種使用時(shí)，拌種肥用水100倍稀釋?zhuān)璺N使用；葉面噴灑使用時(shí)，葉面肥用水100倍稀釋?zhuān)谵r(nóng)作物苗期葉面噴施、果實(shí)期噴灑；地面肥于耕種時(shí)地面播撒。本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明枯草芽孢桿菌兼具促進(jìn)植物生長(zhǎng)和拮抗植物病原菌功能，經(jīng)其發(fā)酵制備所得的微生物多功能肥兼具促進(jìn)作物生長(zhǎng)、防治植物葉面病害和果實(shí)病害的雙重作用，可減少化肥和農(nóng)藥用量，改善土壤，改善農(nóng)田環(huán)境質(zhì)量，提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。本發(fā)明枯草芽孢桿菌可成功定殖于植物根際、體表或體內(nèi)，分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，具有生防效果，對(duì)多種植物、農(nóng)作物病原真菌都有很強(qiáng)的抑制作用；2、在本發(fā)明制備方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基可提升發(fā)酵產(chǎn)物中枯草芽孢桿菌的數(shù)量；通過(guò)微生物代謝，提高拮抗代謝產(chǎn)物的分泌量，在充分發(fā)揮活菌體促植物生長(zhǎng)的同時(shí)，能保證在植物或作物的整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)發(fā)揮有效的生物殺菌劑作用，增強(qiáng)植物或作物抗病能力。培養(yǎng)基中富含氮、磷、鉀，及各種礦物質(zhì)，可增強(qiáng)土壤肥力，減少土壤施肥量。具體實(shí)施方式實(shí)施例1正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化獲得發(fā)酵培養(yǎng)基為提高B.subtilisBS501a發(fā)酵產(chǎn)物的拮抗能力，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，得到最佳培養(yǎng)基組成為：葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，KH2PO40.13%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,MnSO4·H2O0.01%,FeSO4·7H2O0.01%,CaC12·2H2O0.15%,pH7.0；最適發(fā)酵溫度30℃,最適發(fā)酵時(shí)間48h。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液抗菌譜采用對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)枯草芽孢桿菌BS501a的抗菌譜。由于植物病原真菌生長(zhǎng)速度不同，為準(zhǔn)確判斷枯草芽孢桿菌BS501a的拮抗活性，采用枯草芽孢桿菌BS501a與植物病原真菌分期或同期培養(yǎng)的方法。對(duì)生長(zhǎng)速度較快的植物病原真菌，先在新鮮PDA平板上呈對(duì)角線接種枯草芽孢桿菌BS501a，26℃培養(yǎng)24h后，在平板中央移入受試真菌菌餅，而后繼續(xù)培養(yǎng)48h，測(cè)量拮抗帶寬度。對(duì)生長(zhǎng)速度中等的植物病原真菌，采用在新鮮PDA平板中央接種受試真菌菌餅，同時(shí)圍繞菌餅呈對(duì)角線接種枯草芽孢桿菌BS501a菌株，26℃培養(yǎng)72h，測(cè)量拮抗帶寬度。對(duì)生長(zhǎng)速度較慢的植物病原真菌，采用在新鮮PDA平板中央接種受試真菌菌餅，26℃培養(yǎng)24h后，在平板上呈對(duì)角線接種枯草芽孢桿菌BS501a，繼續(xù)培養(yǎng)72h，測(cè)量拮抗帶寬度。結(jié)果如表1所示。表1枯草芽孢桿菌BS501a抗菌譜受試真菌拮抗帶寬度/mm稻瘟病菌（7.4±0.23）a黃瓜鐮刀菌（6.98±0.21）a禾生腐霉（3.06±0.15）b西瓜枯萎病菌（5.25±0.34）c辣椒枯萎病菌（4.73±0.30）c玉米串珠鐮孢（3.50±0.21）d玉米青枯病菌（4.25±0.16）cd小麥根腐病菌（8.58±0.47）a玉米小斑病菌（7.18±0.32）b小麥赤霉病菌（5.38±0.36）c蘋(píng)果腐爛病菌（5.00±0.20）c蘋(píng)果輪紋病菌（4.72±0.38）c黃瓜灰霉病菌（8.03±0.71）ab小麥紋枯病菌（9.10±0.12）a番茄早疫病菌（8.65±0.43）ab棉花枯萎病菌（7.10±0.21）bc棉花黃萎病菌（7.25±0.09）b注：英文字母相同表示差異不顯著，不相同表示差異顯著。以拮抗帶寬度4.25mm為臨界點(diǎn)，拮抗帶寬度大于4.25mm為抑制作用強(qiáng)，拮抗帶寬度小于4.25mm為抑制作用弱。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液對(duì)小麥紋枯病菌、小麥根腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄早疫病菌、黃瓜灰霉病菌、黃瓜鐮刀菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、辣椒枯萎病菌、水稻紋枯病菌、玉米小斑病菌、西瓜枯萎病菌、蘋(píng)果腐爛病菌、蘋(píng)果輪紋病菌的抑制作用強(qiáng)；對(duì)玉米青枯菌、玉米串珠鐮孢菌、禾生腐霉的抑制作用較弱。實(shí)施例3枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液生物安全性測(cè)定根據(jù)藥典，采用急性毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液的生物安全性。將枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液冷凍干燥，制成凍干粉。將凍干粉用生理鹽水依次稀釋至5×10-2g/mL，5×10-3g/mL，5×10-4g/mL，5×10-5g/mL，5×10-6g/mL等不同濃度。將48只3周齡昆明小鼠進(jìn)行7d的喂養(yǎng)觀察，觀察期內(nèi)小鼠自由采食、飲水。觀察期結(jié)束后，將小鼠隨機(jī)分成6組，每組8只。小鼠給藥前禁食，但不禁水。過(guò)夜后，稱(chēng)重。取5組小鼠，根據(jù)體重，每只小鼠經(jīng)口灌胃0.2ml枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液凍干粉溶液，使5組小鼠枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液凍干粉的劑量分別為500mg/kg，50mg/kg，5mg/kg，0.5mg/kg，0.05mg/kg。第6組小鼠設(shè)為空白對(duì)照組，經(jīng)口灌胃0.2ml生理鹽水。給藥后間隔2h進(jìn)食，連續(xù)觀察7d。飼養(yǎng)過(guò)程中觀察小鼠外觀、精神表現(xiàn)、采食情況、體重變化。7d后解剖，觀察內(nèi)臟病理變化。根據(jù)國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局GB15670-1995急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液凍干粉的LD50值>500mg/kg，證明屬于低毒級(jí)，符合綠色生物農(nóng)藥要求。實(shí)施例5枯草芽胞桿菌BS501a發(fā)酵液盆栽防治效果將水稻培養(yǎng)3周左右，待大部分水稻長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，采用噴壺向水稻的葉和莖噴灑稻瘟病菌孢子懸液5mL（加0.5%的吐溫80），噴灑24h后，葉面噴灑枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液（加0.5%的吐溫80）對(duì)水稻進(jìn)行防治，每天1次，每次5mL。對(duì)照用去離子水處理。28℃條件下，100%光照14h、黑暗10h交替培養(yǎng)6d（從噴灑稻瘟病菌孢子懸液開(kāi)始計(jì)時(shí)），調(diào)查水稻染病情況。調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以葉片為單位（IRRI）：0級(jí)為無(wú)病1級(jí)為葉片病斑少于5個(gè)，長(zhǎng)度小于1cm3級(jí)為葉片病斑6-10個(gè)，部分病斑長(zhǎng)度大于1cm5級(jí)為葉片病斑11-25個(gè)，部分連成片，占面積10%-25%7級(jí)為葉片病斑26個(gè)以上，部分連成片，占面積26%-50%9級(jí)為葉片病斑連成片，占葉片面積50%以上或全部枯死。在噴灑稻瘟病菌孢子懸液2-3d后，水稻葉片上就可以看出稻瘟病菌侵染痕跡。未噴灑枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清的水稻葉片受稻瘟病菌侵染顯著，大部分葉片上都有明顯的稻瘟病病斑，且個(gè)數(shù)多，面積大，還有部分病斑已經(jīng)擴(kuò)散至整個(gè)葉片，染病的葉片明顯發(fā)黃，像火燒過(guò)一樣。噴灑了枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清的水稻，大部分葉片保持鮮綠色，少部分被侵染葉片病斑個(gè)數(shù)少、面積小。具體的病情指數(shù)以及防治效率見(jiàn)表2。表2枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清的防治效率注：實(shí)施例6枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液對(duì)水稻的促生長(zhǎng)作用將健康稻種浸泡在100倍稀釋的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中24h后，播種在塑料紗盤(pán)內(nèi)，表面均勻覆蓋細(xì)紗，于多波段培養(yǎng)箱中模擬自然光照，培養(yǎng)育苗，視需要沿紗盤(pán)邊沿加清水。每個(gè)處理100粒。對(duì)照用清水浸種。當(dāng)水稻長(zhǎng)至二葉一心時(shí)測(cè)發(fā)芽率和秧苗的鮮重。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，經(jīng)枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液浸泡處理后秧苗鮮重提高了15.93%，但發(fā)酵液對(duì)水稻種子的發(fā)芽率沒(méi)有影響。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3