本發(fā)明涉及一種提取液及其制備方法，具體涉及一種茶提取液及其制備方法。

背景技術：

如今，茶已經(jīng)成為世上廣受歡迎的軟飲料之一。隨著人們生活水平的提高和生活節(jié)奏的加快，茶飲料以天然、健康和方便等特點而廣受消費者的歡迎，發(fā)展非常迅速。茶飲料主要是以茶葉通過濃縮、浸泡、干燥工藝制成的速溶茶粉為原材料，再經(jīng)加工、調配等工藝制成的飲料。隨著茶飲料的市場不斷擴大，速溶茶也迅速發(fā)展起來。

茶葉提取方式主要有浸出式、澆滲式、逆流式、煎煮法、浸漬法、滲溉法、回流法和水蒸氣蒸館法。此外，有許多研究表明茶葉提取的方式還有微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界流體提取等。在以上這些茶葉提取方法出現(xiàn)前，一般使用熱水直接進行浸提的傳統(tǒng)方法來的制備茶葉提取液。但是這個方法浸提時間太長，導致了很多營養(yǎng)成分在高溫處理下流失了，同時，許多風味物質在高溫下十分容易揮發(fā)。這些缺點都極大地影響了茶湯的風味和品質。茶葉中的多酚、氨基酸、咖啡堿等有效成分在干茶中由于被纖維素、半纖維素和果膠為主體的細胞壁所包裹，難以釋放。且茶葉中蛋白質則由于水溶性較差，主要存在于茶渣中，不能夠被有效利用。如今現(xiàn)代生物技術逐步發(fā)展起來，外源生物酶開始應用到工藝生產(chǎn)中來，因此，現(xiàn)在外源生物酶在茶葉提取加工技術中逐步得到良好應用?，F(xiàn)茶葉加工中應用較多的外源酶主要有單寧酶、多酚氧化酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等。酶法提取的原理是纖維素酶、果膠酶、半纖維素等外源酶用于破壞細胞的結構、破壞茶葉細胞壁，從而使茶葉中的有效成分的盡量大的得到擴散和浸出。多酚氧化酶能促進兒茶素類的氧化，主要是使速溶茶綠轉紅，使綠茶能轉成具有紅茶的特點，或者是應用在紅茶方面。使用蛋白酶能夠水解茶葉中的蛋白質，從而提高茶湯中的氨基酸含量。茶湯中游離氨基酸含量的增加，可增添茶湯的香氣，同時也能增強茶湯鮮爽的口感。單寧酶水解茶葉中的酯型兒茶素，從而獲得冷溶性好且苦澀味弱的茶產(chǎn)品。此外，酶技術在茶飲料中的應用可以實現(xiàn)茶汁的低溫浸提，促進茶汁的澄清，從而改善茶湯感官品質。

姜紹通等^[24]利用酶制劑研究了提取速溶綠茶的條件。其結果表明，當纖維素酶添加量為每克茶葉400U時，茶多酚含量增加12％，氨基酸的含量變化并不顯著。同時復配使用蛋白酶后，茶湯氨基酸含量增多且茶湯滋味好。Jae HunKim等也進行過類似的研究。他們在經(jīng)熱水提取后的綠茶渣中加入纖維素酶后，發(fā)現(xiàn)其總茶多酚、總兒茶素、蛋白質含量、咖啡堿含量都有不同程度提高，對還原糖的測定也表明了纖維素酶的水解活性。

到目前為止，國外有過一些研究。例如，Chandini S K等的研究。其研究表明在提高可溶性固形物含量和茶湯品質方面，若單獨使用單寧酶比果膠酶和單寧酶的復配使用會更加有優(yōu)勢。而且單寧酶水解酯型兒茶素的特點不僅有效地減少了茶乳酪的形成，還使茶湯的苦澀味減淡，口感較好。這是因為單寧酶有效地降低了非酯型兒茶素苦味閾值。此外，Min JerLu等做了此方面的研究。研究表明單寧酶處理后的綠茶茶湯抑制亞硝酸鹽的效果比未處理組好。

目前雖然單寧酶、纖維素酶和蛋白酶在茶飲料中都有過研究應用的報道。但是，關于單寧酶的應用研究多集中于紅茶飲料的除“冷后渾”及提高速溶茶的冷容性，在烏龍茶茶飲料中應用比較少。而且如今，對烏龍茶茶飲料的除“冷后渾”和除苦澀味的可行性尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種具有高含量茶多酚、游離氨基酸和固形物的茶提取液及其制備方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：一種茶提取液的制備方法，其包括以下步驟：

(1)水浴浸提：向茶葉中加入水，于70～95℃的溫度下水浴浸提10～30分鐘，得到水浸提物；

(2)酶解：冷卻步驟(1)所得的水浸提物，再向水浸提物中加入酶，于30～50℃酶解1～6小時；其中所述酶由蛋白酶、纖維素酶和單寧酶組成，所述蛋白酶與茶葉的質量百分比大于0且小于或等于1.3％，纖維素酶與茶葉的質量百分比大于0且小于或等于1.7％，單寧酶與茶葉的質量百分比大于0且小于或等于1.7％；

(3)滅酶：將步驟(2)酶解所得產(chǎn)物進行滅酶處理，再過濾，得到茶提取液。

本發(fā)明采用的酶中，蛋白酶催化反應條件溫和、作用高度專一、催化效率高、活性可調控和無毒；纖維素酶主要作用于茶葉細胞壁中的纖維素，對細胞壁起破壞作用，利于茶葉內含物的釋放，在茶葉提取過程中，纖維素酶能提高可溶性糖和水浸出物的含量，促進茶多酚、氨基酸和咖啡堿的溶出，利于芳香性物質的釋放，具有增效的效果；單寧酶可以水解苦澀味的酯型兒茶素，釋放出沒食子酸，解離后的沒食子酸與咖啡堿作用，形成分子量較小的水溶物，此反應能有效地降低沉淀的形成，使茶湯保持澄清狀態(tài)。

本發(fā)明制備茶提取液時，采用了由蛋白酶、纖維素酶和單寧酶組成的復合酶進行酶解，在各種的酶共同作用和相互影響下，本發(fā)明得到的茶提取液的品質有了很大改善，茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量明顯提高。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述蛋白酶與茶葉的質量百分比為1.1～1.3％，纖維素酶與茶葉的質量百分為1.5～1.7％，單寧酶與茶葉的質量百分比為1.5～1.7％。研究表明，采用所述用量的各種酶時，得到的茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量更高。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的更優(yōu)選實施方式，所述蛋白酶與茶葉的質量百分比為1.1％，纖維素酶與茶葉的質量百分為1.5％，單寧酶與茶葉的質量百分比為1.5％。采用由所述特定含量的各種酶組成的復合酶時，不僅酶用量較少，且得到的茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量最高。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述蛋白酶為ProteAX蛋白酶。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(2)中，酶解溫度為40～50℃；更優(yōu)選地，所述步驟(2)中，酶解溫度為40℃。酶解的溫度影響酶的活性，當溫度高于50℃時，單寧酶的活性明顯下降甚至喪失；綜合考慮各種酶的活性以及不同溫度下的酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)40℃為最佳的酶解溫度。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(2)中，先向水浸提物中加入單寧酶，酶解1小時，再加入蛋白酶和纖維素酶，繼續(xù)酶解2小時。蛋白酶與纖維素酶的酶解時間為2小時且單寧酶的酶解時間為3小時時，茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量最較高。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(1)之前還包括步驟(1a)：將茶葉粉碎。將茶葉粉碎，有利于浸提過程中，茶葉中物質充分浸泡到水中。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的優(yōu)選實施方式，如下(a)～(d)中的至少一項：(a)所述茶葉為烏龍茶；(b)所述步驟(1)中，茶葉與水的質量比為1:10；(c)所述步驟(1)中，于80℃的溫度下水浴浸提15分鐘，得到水浸提物；(d)所述步驟(3)中，于100℃水浴中滅酶5分鐘。

作為本發(fā)明所述茶提取液的制備方法的更優(yōu)選實施方式，所述茶葉為鳳凰單叢茶。鳳凰單叢茶屬于烏龍茶類，其茶香濃厚且口感醇厚。

本發(fā)明還提供了一種采用上述方法制得的茶提取液。本發(fā)明得到的茶提取液的品質有了很大改善，茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量明顯提高。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明制備茶提取液時，采用了由蛋白酶、纖維素酶和單寧酶組成的復合酶進行酶解，在各種的酶共同作用和相互影響下，本發(fā)明得到的茶提取液的品質有了很大改善，茶提取液中茶多酚、游離氨基酸和固形物的含量明顯提高。并且，本發(fā)明選擇了適宜的酶解溫度和酶解時間，這些適宜的條件也有利于改善茶提取液的品質。

本發(fā)明制備茶提取液的方法可用于各種茶葉，尤其是選擇烏龍茶中的鳳凰單叢茶時，茶的品質更佳。

附圖說明

圖1為茶多酚濃度標準曲線圖；

圖2為游離氨基酸濃度標準曲線圖；

圖3為ProteAX蛋白酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響結果圖；

圖4為纖維素酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響結果圖；

圖5為單寧酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響結果圖；

圖6為不同酶酶解時間對茶提取液中茶多酚含量的影響結果圖；

圖7為不同酶酶解時間對茶提取液中游離氨基酸含量的影響結果圖；

圖8為不同酶酶解時間對茶提取液中可溶性固形物含量的影響結果圖；

圖9為不同酶酶解溫度對茶提取液中茶多酚含量的影響結果圖；

圖10為不同酶酶解溫度對茶提取液中游離氨基酸含量的影響結果圖；

圖11為不同酶酶解溫度對茶提取液中可溶性固形物的影響結果圖；

圖12為不同酶處理對茶提取液中茶多酚含量的影響結果圖；

圖13為不同酶處理對茶提取液中游離氨基酸含量的影響結果圖；

圖14為不同酶處理對茶提取液中可溶性固形物含量的影響結果圖；

圖15為不同茶提取液樣品的雷達圖；

圖16為不同茶提取液樣品的判別函數(shù)分析圖。

具體實施方式

為更好地說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。

下述實施例中，ProtectAX蛋白酶、纖維素酶、單寧酶，均購自阿瑪諾天野酶制劑商貿(上海)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水合茚三酮、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、茶氨酸、茶多酚，均為市售分析純；所用到的儀器為：精密電子天平(型號為JJ500，蘇制)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號為HH，廠家為金壇市金成國勝試驗儀器廠)，紫外分光光度計(型號為UV759，廠家為上海精科)，電子鼻(型號為iNose，廠家為上海瑞玢國際貿易有限公司)，阿貝折光儀(型號為WYT-2W，廠家為上海精科)，電熱恒溫鼓風干燥箱(型號為SFG-02.300，廠家為黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)。

實施例中，茶多酚、游離氨基酸和可溶性固形物的測定方法分別如下：

茶多酚的測定：參考GB/T 8313-2008茶中茶多酚檢測方法：酒石酸亞鐵比色法，具體方法為：(1)標準曲線的繪制：分別吸取濃度為0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2.0mg/mL的茶多酚標準溶液1.0mL于25mL具塞比色管中，加入水4mL和酒石酸亞鐵溶液5mL，補加pH值為7.5的磷酸鹽緩沖溶液至刻度線，混勻，用10mm比色皿，在波長540nm處，以試劑空白溶液作為參比，測定吸光度(A)，繪制標準曲線；(2)樣品的測定：準確吸取1mL樣品茶湯于25mL具塞比色管中，加入水4mL和酒石酸亞鐵溶液5mL，補加pH值為7.5的磷酸鹽緩沖溶液至刻度線，混勻，用10mm比色皿，在波長540nm處，以試劑空白溶液作為參比，測定吸光度(A)，從茶多酚濃度標準曲線中求得溶液中茶多酚的含量。其中，茶多酚濃度標準曲線如圖1所示，該標準曲線的決定系數(shù)(R²)大于0.99，這說明其所得回歸方程具有很高的擬合精度，即模型的模擬值和實測值具有高度的一致性。

游離氨基酸的測定：參考GB/T 8314-2013游離氨基酸的測定方法：茚三酮比色法，具體方法為：(1)茶氨酸標準工作液的制備：稱取250mg茶氨酸(純度不低于99％)溶于適量水中，轉移定容至25mL，搖勻。該標準儲備液、液1mL含有10mg的茶氨酸。移取0.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL標準儲備液，分別加水定容至50mL，搖勻，該系列標準工作液1mL分別含有0mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg茶氨酸；(2)標準曲線的繪制：分別吸取1mL茶氨酸系列標準液于一組25mL具塞比色管中，分別加入pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液0.5mL和2％茚三酮溶液0.5mL，在沸水浴中加熱15min。冷卻后加水定容至刻度線，放置10min后，混勻，用10nm比色皿，在波長570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)，繪制標準曲線，如圖2所示；(3)樣品的測定：準確吸取0.5mL樣品茶湯于25mL具塞比色管中，加入pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液0.5mL和2％茚三酮溶液0.5mL，在沸水浴中加熱15min。冷卻后加水定容至刻度線，放置10min后，混勻，用10nm比色皿，在波長570nm處，以試劑空白溶液作參比，測定吸光度(A)。從游離氨基酸標準曲線中求得溶液中游離氨基酸的含量。其中，游離氨基酸濃度標準曲線如圖2所示，該標準曲線的決定系數(shù)(R²)大于0.99，這說明其所得回歸方程具有很高的擬合精度。即模型的模擬值和實測值具有高度的一致性。

可溶性固形物的測定：滴數(shù)滴樣品茶湯于阿貝折光儀的下棱鏡上，迅速將上下兩塊棱鏡閉合，調整反射鏡，使光纖射入棱鏡中，達到視野最亮。從目鏡觀察，旋動棱鏡旋鈕，使視野出現(xiàn)明暗兩部分，再旋動色散補償器，使視野中除了黑白兩色外，無其他顏色。最后再旋動棱鏡旋鈕，使明暗分界線在十字交叉點。通過放大鏡在讀數(shù)鏡筒里的刻度尺上進行讀數(shù)，讀取并記錄百分濃度。測定完成后，用脫脂棉蘸水、乙醇擦凈棱鏡表面和鏡身各個部分。

下述實施例中，所述酶的用量均以酶于茶葉的質量百分比來表示，實施例中CK表示空白對照組。

實施例1

本發(fā)明茶提取液及其制備方法的一種實施例，本實施例所述的茶提取液，其制備方法包括以下步驟：

(1)稱取鳳凰單叢茶，將其粉碎，得到粉碎的茶葉；

(2)水浴浸提：向步驟(1)所得粉碎的茶葉中加入水，茶葉與水的質量比為1:10，于80℃的溫度下水浴浸提15分鐘，得到水浸提物；

(3)酶解：冷卻步驟(2)所得的水浸提物，再向水浸提物中加入單寧酶，酶解1小時，再加入ProteAX蛋白酶和纖維素酶，繼續(xù)酶解2小時，酶解溫度為40℃；其中，ProteAX蛋白酶與茶葉的質量百分比為1.1％，纖維素酶與茶葉的質量百分為1.5％，單寧酶與茶葉的質量百分比為1.5％；

(4)滅酶：將步驟(3)酶解所得產(chǎn)物于100℃水浴中滅酶5分鐘，再過濾，得到茶提取液。

實施例2

本發(fā)明茶提取液及其制備方法的一種實施例，本實施例所述的茶提取液，其制備方法包括以下步驟：

(1)稱取鳳凰單叢茶，將其粉碎，得到粉碎的茶葉；

(2)水浴浸提：向步驟(1)所得粉碎的茶葉中加入水，茶葉與水的質量比為1:10，于95℃的溫度下水浴浸提10分鐘，得到水浸提物；

(3)酶解：冷卻步驟(2)所得的水浸提物，再向水浸提物中加入單寧酶、ProteAX蛋白酶和纖維素酶，酶解1小時，酶解溫度為50℃；其中，ProteAX蛋白酶與茶葉的質量百分比為1.3％，纖維素酶與茶葉的質量百分為1.7％，單寧酶與茶葉的質量百分比為1.7％；

(4)滅酶：將步驟(3)酶解所得產(chǎn)物于100℃水浴中滅酶5分鐘，再過濾，得到茶提取液。

實施例3

本發(fā)明茶提取液及其制備方法的一種實施例，本實施例所述的茶提取液，其制備方法包括以下步驟：

(1)稱取鳳凰單叢茶，將其粉碎，得到粉碎的茶葉；

(2)水浴浸提：向步驟(1)所得粉碎的茶葉中加入水，茶葉與水的質量比為1:10，于70℃的溫度下水浴浸提30分鐘，得到水浸提物；

(3)酶解：冷卻步驟(2)所得的水浸提物，再向水浸提物中加入單寧酶，酶解4小時，再加入ProteAX蛋白酶和纖維素酶，繼續(xù)酶解2小時，酶解溫度為30℃；其中，ProteAX蛋白酶與茶葉的質量百分比為1.2％，纖維素酶與茶葉的質量百分為1.6％，單寧酶與茶葉的質量百分比為1.6％；

(4)滅酶：將步驟(3)酶解所得產(chǎn)物于100℃水浴中滅酶5分鐘，再過濾，得到茶提取液。

實施例4

本實施例考察了ProteAX蛋白酶、纖維素酶和單寧酶加酶量對酶解效果的影響，具體的考察方法如下：

ProteAX蛋白酶加酶量的考察方法：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入ProteAX蛋白加酶量按照樣品茶葉質量的0.0％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％計算，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解1h后，把樣品置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。

纖維素酶加酶量的考察方法：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入纖維素加酶量按照樣品茶葉質量的0.0％、1.0％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％計算，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解1h后，把樣品置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。

單寧酶加酶量的考察方法：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入單寧酶加酶量按照樣品茶葉質量的0.0％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％計算，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解1h后，把樣品置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。

ProteAX蛋白酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響如圖3所示，纖維素酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響如圖4所示，單寧酶加酶量對茶提取液中茶多酚、游離氨基酸、可溶性固形物含量的影響如圖5所示。

在茶葉中添加蛋白酶可促進茶葉中蛋白質的水解，從而提高茶提取液中氨基酸的含量，可增添茶提取液的香味。由圖3可知，加入ProteAX蛋白酶處理所得的茶提取液中的茶多酚含量、游離氨基酸含量、可溶性固形物含量明顯比空白對照組(即并沒有進行加酶處理的樣品)的含量要高(p<0.05)。在加酶量為0.8％后，隨著加酶量的增加，茶提取液中的茶多酚含量變化平緩，通過數(shù)據(jù)分析，此段茶多酚含量變化并沒有較大差異(p>0.05)。可能因為加入的酶為蛋白酶，對茶葉中茶多酚的釋放作用不太強烈。而蛋白酶的主要作用是分解茶中的蛋白質產(chǎn)生氨基酸。隨著蛋白酶加酶量的增加，茶提取液中的游離氨基酸呈上升趨勢，通過數(shù)據(jù)分析，當加酶量為1.1％時，與加酶量小于1.1％所處理的樣品存在顯著性差異(p<0.05)，而與加酶量大于1.1％所處理的樣品差異開始減小，游離氨基酸含量基本保持平穩(wěn)?？赡苡捎诘孜锏牧恳欢?，加酶量在1.1％已能夠把底物反應完，以致增大加酶量對游離氨基酸釋放的作用不大。由圖3可以看出，加入ProteAX蛋白酶處理的茶提取液中的可溶性固形物含量比空白對照組高，但變化基本趨于平穩(wěn)。得知加酶量的增加對可溶性固形物含量的變化影響并不大。根據(jù)以上結果以及考慮成本問題得，選擇ProteAX蛋白酶的加酶量1.1％為宜。

纖維素酶主要是對茶葉細胞壁中的纖維素起作用，破壞細胞壁，有利于釋放茶葉中的內含物，以促進茶多酚、游離氨基酸等的溶出。由圖4可知，加入纖維素酶處理所得的茶提取液中的茶多酚含量、游離氨基酸含量及可溶性固形物含量比空白對照組(即并沒有進行加酶處理的樣品)的含量要高。在纖維素加酶量為1.5％前，隨著加酶量的增大，茶提取液中的茶多酚含量顯著上升；而在加酶量為1.5％時，茶多酚的含量達到最高值，；隨著加酶量的繼續(xù)增加，茶多酚含量不再增加。這可能由于纖維素酶在加酶量為1.5％時，能較充分地酶解細胞壁，釋放出茶多酚。在游離氨基酸含量變化曲線中，加酶處理的樣品與空白對照組都有顯著性差異(p<0.05)。證實加入纖維素酶對茶葉中游離氨基酸的釋放是有一定作用，但游離氨基酸含量變化基本保持平穩(wěn)，不同的加酶量處理所得的樣品結果差異不大。而纖維素酶也是蛋白質的一種，當加酶量過多時，蛋白質易與茶多酚、咖啡堿、氨基酸相結合成茶乳酪^[29]，這可能是加酶量大于1.5％后茶多酚含量及游離氨基酸含量略有下降的原因。在可溶性固形物含量變化曲線中，加入纖維素酶處理的茶提取液中的可溶性固形物含量比空白對照組高，但變化基本平穩(wěn)。得知酶用量的增加對可溶性固形物含量的變化影響并不大。根據(jù)以上結果以及考慮成本問題得，選擇纖維素酶的加酶量1.5％為宜。

單寧酶在茶飲料中應用廣泛，主要作用是能水解酯型兒茶素從而釋放出沒食子酸，水解出的沒食子酸能與咖啡堿作用使之降低沉淀的形成。由圖5可知，加入單寧酶處理所得的茶提取液中的茶多酚含量、游離氨基酸含量以及可溶性固形物含量都比空白對照組(即并沒有進行加酶處理的樣品)的含量要高。在茶多酚含量變化曲線中可知，在單寧酶加酶量為1.5％前，隨著纖維素酶用量的增大，茶提取液中的茶多酚含量顯著上升；而在加酶量為1.5％時，茶多酚的含量達到最高值，；隨著酶用量的繼續(xù)增加，茶多酚含量不再增加且趨于平緩。在游離氨基酸含量變化曲線中，加酶處理的樣品與空白對照組都有顯著性差異(p<0.05)。證實加入單寧酶對茶葉中游離氨基酸的釋放是有一定作用，但在加酶量大于1.3％后，游離氨基酸含量變化基本保持平穩(wěn)，不同的加酶量處理所得的樣品結果差異不大，可能單寧酶加入量為1.3％時已足以把底物反應完。在可溶性固形物含量變化曲線中看出，加入單寧酶處理的茶提取液中的可溶性固形物含量比空白對照組高，隨著加酶量的增加，可溶性固形物含量隨之緩慢增大，而在酶用量為1.5％之后，可溶性固形物含量變化趨于穩(wěn)定，得出單寧酶對茶葉中可溶性糖含量的溶出作用明顯。根據(jù)以上結果以及考慮成本問題得，選擇單寧酶的加酶量1.5％為宜。

實施例5

本實施例考察了酶解時間對酶解效果的影響，考察的具體方法如下：

酶解時間對ProteAX蛋白酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入1.1％的ProteAX蛋白酶，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解時間分別為1h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

酶解時間對纖維素酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入1.5％的纖維素酶，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解時間分別為1h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

酶解時間對單寧酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，分別加入1.5％的單寧酶，放于設置為40℃的恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解時間分別為1h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

不同酶酶解時間對茶提取液中茶多酚含量的影響如圖6所示，不同酶酶解時間對茶提取液中游離氨基酸含量的影響如圖7所示，不同酶酶解時間對茶提取液中可溶性固形物含量的影響如圖8所示。

由圖6可知，在不同的酶解時間里，經(jīng)過酶處理的茶提取液中茶多酚含量均比空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中茶多酚含量高。且從圖中可看出，經(jīng)過單寧酶酶解的茶提取液中茶多酚含量最高，這說明，相對其他兩種酶，使用單寧酶對茶葉中茶多酚含量的釋放作用更為明顯，可能由于單寧酶水解茶葉中的酯型兒茶素生成的沒食子酸與咖啡堿作用，阻止了咖啡堿與茶多酚等物質結合，使茶多酚能有效釋放。由經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解和經(jīng)纖維素酶酶解樣品的兩條茶多酚含量變化曲線可知，在酶解時間為2h時，兩種酶酶解的樣品當中的茶多酚含量均達到峰值，隨后開始平緩下降。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，經(jīng)ProteAX蛋白酶與經(jīng)纖維素酶處理2h的樣品茶多酚含量相對于酶解時間小于2h的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。而在酶解時間大于2h時，經(jīng)過兩種不同酶處理的樣品中，茶多酚的含量均緩慢下降，這可能由于在2h后，酶解時間過長，茶提取液中的蛋白質與茶多酚、咖啡堿、氨基酸形成復合物，使之其中的茶多酚含量略有下降。由經(jīng)單寧酶酶解樣品的茶多酚含量變化曲線可知，酶解條件為3h時，樣品中茶多酚的含量達到最大值，隨后開始變化趨勢平緩，且與空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)含量相比有明顯差異。而酶解時間為5h時，樣品中茶多酚含量突然下降，這可能由于實驗操作造成的誤差形成。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，經(jīng)單寧酶處理3h的樣品茶多酚含量相對于酶解時間小于3h的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)，且與處理條件為4h的樣品差異較小。

由圖7可知，經(jīng)過酶處理的茶提取液中游離氨基酸含量均比空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中的游離氨基酸含量高。且從圖中可看出，經(jīng)過ProteAX蛋白酶酶解的茶提取液中游離氨基酸含量最高，這說明，相對其他兩種酶，ProteAX蛋白酶對茶葉中游離氨基酸含量的釋放作用更為明顯，可能是由于酶催化的專一性，蛋白酶的催化作用促使茶葉中的蛋白質水解成氨基酸，比纖維素酶和單寧酶的作用更大。由經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解樣品的游離氨基酸含量變化曲線可知，經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解條件為2h時游離氨基酸含量達到最高值，隨后變化略有下降；而在酶解條件為3h時，游離氨基酸含量突然下降，這可能是由于實驗操作造成的誤差；而空白對照組中的游離氨基酸含量先緩慢上升，在2h后趨于平緩，變化不明顯。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，經(jīng)蛋白酶處理2h的樣品茶多酚含量、游離氨基酸含量相對于處理條件小于2h的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。由經(jīng)纖維素酶酶解的樣品游離氨基酸含量變化曲線可知，經(jīng)纖維素酶酶解的樣品中，游離氨基酸含量比空白對照組的含量高，證實纖維素酶對茶葉中的游離氨基酸的釋放還是有一定作用的。而根據(jù)數(shù)據(jù)分析，經(jīng)纖維素酶處理2h的樣品茶多酚含量、游離氨基酸含量相對于其他條件處理的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。而經(jīng)單寧酶酶解的樣品中游離氨基酸含量變化趨勢不明顯，可能是由于單寧酶催化的專一性，未能較好地把茶中的蛋白質水解成氨基酸，但與空白對照組相比，游離氨基酸含量增大，證實單寧酶對茶葉中游離氨基酸的釋放還是有一定作用的。

由圖8可知，空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中可溶性固形物含量變化不明顯，基本趨于平緩狀態(tài)，而經(jīng)過三種不同的酶酶解后的樣品中可溶性固形物含量均比空白對照組高，可見三種酶對茶葉中可溶性固形物含量的釋放均有作用。從圖中看出，經(jīng)過單寧酶酶解的樣品可溶性固形物含量最高，可見單寧酶對茶葉中可溶性物質含量的影響最大，這可能與單寧酶水解酯型兒茶素后釋放的沒食子酸與咖啡堿作用，生成分子量較小的水溶物有一定關系。但在酶解2h后樣品的可溶性固形物含量變化差異不大；在酶解5h時樣品可溶性固形物含量突然下降，可能是由于實驗操作誤差引起的。從數(shù)值上看，經(jīng)ProteAX蛋白酶與經(jīng)纖維素酶酶解的樣品中可溶性固形物含量均在酶解2h時達到最大值，而酶解時間大于2h后，可溶性固形物含量變化幅度不大。根據(jù)以上結果以及考慮成本問題得，選擇ProteAX蛋白酶與纖維素酶的酶解時間2h、單寧酶的酶解時間3h宜。

實施例6

本實施例考察了酶解溫度對酶解效果的影響，考察的具體方法如下：

酶解溫度對ProteAX蛋白酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至所要進行酶解的溫度，分別加入1.1％的ProteAX蛋白酶，放于設置恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃，酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

酶解溫度對纖維素酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至所要進行酶解的溫度，分別加入1.5％的纖維素酶，放于設置恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃，酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

酶解溫度對單寧酶酶解效果的影響：在7個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至所要進行酶解的溫度，分別加入1.5％的單寧酶，放于設置恒溫水浴鍋中進行酶解，酶解溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃，酶解3h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，待測。準備7個錐形瓶除了不加入酶外，其他處理相同，進行空白對照組，待測。

不同酶酶解溫度對茶提取液中茶多酚含量的影響如圖9所示，不同酶酶解溫度對茶提取液中游離氨基酸含量的影響如圖10所示，不同酶酶解溫度對茶提取液中可溶性固形物的影響如圖11所示。

由圖9可知，在不同的酶解溫度里，經(jīng)過酶處理的茶提取液中茶多酚含量均比空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中茶多酚含量高。在30℃到40℃條件中，空白對照組樣品中的茶多酚含量緩慢上升，隨后茶多酚含量變化趨勢平緩。且從圖中可看出，經(jīng)過單寧酶酶解的茶提取液中茶多酚含量最高，這說明，相對其他兩種酶，使用單寧酶對茶葉中茶多酚含量的釋放作用更為明顯。由經(jīng)單寧酶酶解的樣品茶多酚含量變化曲線可知，在低于40℃條件下，樣品中的茶多酚含量緩慢上升，而在40℃條件下，茶多酚含量達到峰值；隨后，在高于40℃條件下，經(jīng)單寧酶酶解的樣品茶多酚含量開始下降，而在高于50℃條件下，明顯下降；且在高于60℃條件下，經(jīng)過酶處理樣品中的茶多酚含量非常接近于空白對照組。說明在高于50℃條件下，單寧酶活性明顯下降甚至喪失酶活性。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，在40℃經(jīng)蛋白酶處理的樣品茶多酚含量相對于其他條件下處理的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。由經(jīng)纖維素酶酶解的樣品茶多酚含量變化曲線可知，在低于40℃條件下，茶多酚含量上升；在40℃下酶解，當中的茶多酚含量達到峰值；而在高于40℃條件下，經(jīng)纖維素酶處理的樣品茶多酚含量開始下降且含量開始接近空白對照，而空白對照組卻變化平緩；在60℃條件下的樣品，茶多酚含量驟然上升，可能是由于實驗操作引起的誤差。由此推斷，纖維素酶反應最適溫度在40℃左右。由經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解的樣品茶多酚含量變化曲線可知，在40℃條件下酶解，當中的茶多酚含量達到峰值。而在高于40℃條件下，經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解的樣品茶多酚含量明顯下降；在高于50℃條件下酶解的樣品，茶多酚含量接近于空白對照組。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，在40℃條件下，樣品中茶多酚含量相對于其他溫度條件下處理的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。

由圖10可知，在不同溫度條件下，經(jīng)過酶處理的茶提取液中游離氨基酸含量均比空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中的游離氨基酸含量高。且從圖中可看出，經(jīng)過ProteAX蛋白酶酶解的茶提取液中游離氨基酸含量最高，這說明，相對其他兩種酶，ProteAX蛋白酶對茶葉中游離氨基酸含量的釋放作用更為明顯。由經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解的樣品游離氨基酸含量變化曲線可知，在40℃條件下酶解經(jīng)蛋白酶處理的樣品游離氨基酸含量達到最高值，隨后變化略有下降，與空白對照組存在的差異也逐漸減小。這是由于反應溫度過高，高于ProteAX蛋白酶的最適溫度，使酶變性而減弱甚至喪失其催化活性，從而導致酶解反應速率下降或者停止；當反應溫度低于其最適溫度時，溫度會抑制酶的活性，酶解反應速率會變慢。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，在40℃條件下酶解樣品中的游離氨基酸含量相對于其他條件下處理的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。由經(jīng)單寧酶酶解的樣品游離氨基酸含量變化曲線可知，在低于50℃條件下游離氨基酸含量緩慢上升；在高于50℃條件經(jīng)酶解處理的樣品游離氨基酸含量開始下降，與空白對照組存在的差異也逐漸減小。說明在高于50℃條件下，單寧酶活性明顯下降甚至喪失酶活性。由經(jīng)纖維素酶酶解的樣品游離氨基酸含量變化曲線可知，在40℃條件下樣品中游離氨基酸含量達到最高值，隨后含量略有下降。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，在40℃經(jīng)纖維素酶處理的樣品茶多酚含量、游離氨基酸含量相對于其他條件下處理的樣品和空白對照組均在顯著性差異(p<0.05)。

由圖11可知，空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)中可溶性固形物含量變化不明顯，基本趨于平緩狀態(tài)，而經(jīng)過三種不同的酶酶解后的樣品中可溶性固形物含量均比空白對照組高。由經(jīng)單寧酶酶解的樣品可溶性固形物含量變化曲線可知，而經(jīng)單寧酶酶解的樣品中可溶性固形物含量與空白組相比存在明顯差異，且在40℃—50℃條件下，可溶性固形物含量變化平緩，而高于在50℃條件下可溶性固形物含量開始明顯下降?？赏茢喑觯诟哂?0℃條件下，單寧酶活性明顯下降甚至喪失酶活性。由經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解和經(jīng)纖維素酶酶解樣品的兩條可溶性固形物含量變化曲線可知，在40℃條件下兩種酶酶解的樣品中可溶性固形物含量均達到最大值，隨后含量略有下降且變化幅度不大。根據(jù)以上結果以及考慮成本問題得，選擇ProteAX蛋白酶、纖維素酶與單寧酶的酶解溫度均以40℃為宜。

實施例7

本實施例考察了復合酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響，同時與ProteAX蛋白酶、纖維素酶和單寧酶加酶量對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響進行了對比。

復合酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法：在1個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，加入1.5％的單寧酶后，放于設置40℃恒溫水浴鍋中進行酶解1h后，在加入1.1％的蛋白酶及1.5％纖維素酶后，繼續(xù)酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，測定茶湯濾液中的茶多酚、游離氨基酸和可溶性固形物的含量。

ProteAX蛋白酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法：在1個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，加入1.1％的蛋白酶酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，測定茶湯濾液中的茶多酚、游離氨基酸和可溶性固形物的含量。

纖維素酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法與ProteAX蛋白酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法的不同之處僅在于：酶解時，采用的酶為1.5％的纖維素酶。

單寧酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法與ProteAX蛋白酶酶解對鳳凰單叢茶提取液主要品質的影響的考察方法的不同之處僅在于：酶解時，采用1.5％的單寧酶酶解3小時。

不同酶處理對茶提取液中茶多酚含量的影響如圖12所示，不同酶處理對茶提取液中游離氨基酸含量的影響如圖13所示，不同酶處理對茶提取液中可溶性固形物含量的影響如圖14所示。

由圖12、圖13和圖14可見，經(jīng)過復合酶處理的茶提取液與空白對照組(即并沒有進行酶處理的樣品)及其他單酶在最優(yōu)條件下處理的樣品中茶多酚含量、游離氨基酸含量及可溶性固形物含量均明顯增大。且根據(jù)數(shù)據(jù)分析，，經(jīng)過復合酶處理的樣品相對于各個單酶在最優(yōu)條件處理的樣品及空白對照組樣品中的各個成分均有明顯的差異(p<0.05)。由此得出，此復合酶組合處理優(yōu)于單酶處理。

實施例8

本實施例考察了復合酶解鳳凰單叢茶提取液的感官評價?？疾斓姆椒椋涸?個100mL錐形瓶中分別加入5g已粉碎的樣品茶葉，加入50mL蒸餾水后，于溫度為80℃水浴鍋中浸提水浴15min，冷卻使之降至40℃，加入1.5％的單寧酶后，放于設置40℃恒溫水浴鍋中進行酶解1h后，在加入1.1％的蛋白酶及1.5％纖維素酶后，繼續(xù)酶解2h，酶解完成后置于沸水浴中5min滅酶處理，冷卻到室溫，過濾取茶湯濾液，得到茶提取液。把所得茶提取液按照與蒸餾水比例為1:250、1:500以及1:1000的比例加入到水中，選定若干人組成感官評價鑒定小組，按照表1分別對其香氣、色澤、茶味進行評分，評分結果為5者之和，總分為10分。評分標準見表1，茶稀釋液感官評價結果見表2。

表1茶稀釋液評分標準

表2茶稀釋液感官評價

由表2可知，把茶提取液在稀釋250倍后，加酶處理的樣品優(yōu)于空白對照樣品，且經(jīng)復合酶處理的樣品具有較濃郁的茶香味和明顯的茶澀味。使用復合酶對茶進行酶解處理所得的提取液在稀釋500倍之后，依然存在較濃郁的茶香味，且較有茶澀味，經(jīng)復合酶處理所得樣品優(yōu)于單酶處理或不加酶處理的樣品。把茶提取液稀釋1000倍之后，基本上不存在茶澀味。

實施例9

本實施例采用電子鼻對3中茶提取液(復合酶酶解的茶提取液、空白對照組茶提取液、ProteAX蛋白酶酶解的茶提取液)進行區(qū)分辨別，通過判別函數(shù)分析法來評價復合酶酶解的效果，以驗證感官評價的準確性。

復合酶酶解的茶提取液、空白對照組茶提取液、ProteAX蛋白酶酶解的茶提取液均同實施例7。不同茶提取液樣品的雷達圖見圖15，不同茶提取液樣品的判別函數(shù)分析圖見圖16。

由圖15可知，3個不同茶提取液樣品的氣味差異主要集中在S2、S5、S11傳感器上。從圖中可得知，空白對照組與經(jīng)ProteAX蛋白酶酶解的樣品在氣味上差異較小，而復合酶酶解的樣品與其他兩個樣品在氣味上差異較大。由圖16可知，2個不同插圖去也樣品分布在圖中不同區(qū)域內，相互之間沒有重疊，且DI值(DI值反映整體區(qū)分效果)為96.6％，說明經(jīng)過復合酶酶解處理的樣品與空白對照組、ProteAX蛋白酶酶解的樣品在氣味上差異上較大。綜合感官評價的結果與電子鼻的結果，看出兩個結果是一致的，證明感官評價是有一定的可靠性與準確性。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。