一種用于pcr擴增的絲狀真菌dna的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法。
【背景技術】
[0002]土壤絲狀真菌廣泛存在于自然界中，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎生物學研究中具有重要作用，多年來一直被廣泛的研究。由于真菌細胞壁成分復雜，難以得到充分裂解，真菌中富含的多糖、色素、核酸酶等物質使得核酸的分離更加困難，因此真菌破壁效率和效果直接影響到真菌DNA提取的效率和效果。已報道的真菌破壁方法有:液氮冷融(ManianS，Sreenivasaprasad S，Mills P R.DNA extract1n method for PCR in mycorrhizalfungi [J].Lett Appl Mierob1l，2001，33 (4):307-310.)、-70 °C 凍融(Griffin D W，Kelogg C A，Peal K K，et al.A rapid and eficientassay for extract1n DNA fromfungi[J].Lett Appl Micmb1l，2002，34(3):210-214.)、酶消解(Williamson E C，Leeming J P，Palmer Η M，et al.Diagnosis of invasive aspergillosis in bonemarrow transplant recipient by polymerase chain react1n[J].Br J Haematol，2000，108(1):132—139)、超生破碎(Haugland R A，Heckman J L，ffymer L J.Evaluat1n ofdifferent methods for the extract1n of DNA from fungal conidia by quantitativecompetitive PCR analysis [J].J Miereb1l Methods，1999，37 (2):165—176.)、高鹽溶液(Danilevich V N，Grishin E V.A new approach to the isolat1n of genomic DNAfrom yeast and fung1-preparat1n of DNA—containing cell envelopes and theiruse in PCR[J].Bicor Khim，2002，28 (2):156-167.)、尿素緩沖液處理(SansinforianoΜ E，Padilla J A，Hermoso de Mendoza J，at al.Rapid and easy method to extractand preserve DNA from Cryptococeus neoformans And other pathogenic yeasts[J].Mycoses,1998，41(5-6):195-198) o
[0003]現(xiàn)有的方法步驟較為繁雜，所需試劑較多，需要較高的時間成本和經(jīng)濟成本，不能滿足高通量的要求，因此，需要簡化操作步驟，以便提高工作效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法，旨在解決現(xiàn)有的方法步驟較為繁雜，所需試劑較多，需要較高的時間成本和經(jīng)濟成本，不能滿足高通量的要求的問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法，所述用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法包括:
[0006]菌種培養(yǎng)，將所篩選的菌種接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)48h ;
[0007]吸取1ml菌液到無菌EP管中，常溫下10000r/min離心5min ；
[0008]棄去上清液，將沉淀重懸于0.8ml生理鹽水中8000r/min離心5min ；
[0009]棄去上清液，向EP管內(nèi)加入6000 μ L2 X CTAB提取緩沖液混合，再加入lg玻璃珠，于振蕩器上震蕩lOmin ;
[0010]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0011 ] 加6000 μ L的氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下lOOOOr離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0012]移取上清液至Eppendorf管中，加等體積的氯仿/異戊醇混合液，常溫下lOOOOr離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0013]取上清液，加入6000 μ L冰凍乙醇，靜置30min ；
[0014]常溫下10000r/min 離心 lOmin ；
[0015]棄上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L ΤΕ緩沖液充分溶解后在-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0016]進一步，所述2XCTAB提取緩沖液含0.7mol/L NaCL, 100mmol/L Tris-HCL ρΗ8.0，20mmol/L EDTA，20g/L CTAB。
[0017]進一步，所述TE 緩沖液含 lOmmol/L Tris-HCl lmmol/LEDTA pH 8.0o
[0018]本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用所述用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法的紫薇內(nèi)生真菌DNA的提取方法，所述紫薇內(nèi)生真菌DNA的提取方法包括:
[0019]菌種培養(yǎng):將所篩選的紫薇內(nèi)生真菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)48h ；
[0020]吸取1ml菌液到無菌EP管中，常溫下10000r/min離心5min ；
[0021]棄去上清液，將沉淀重懸于0.8ml生理鹽水中8000r/min離心5min ；
[0022]棄去上清液，向EP管內(nèi)加入6000 μ L2XCTAB提取緩沖液混合，再加入lg玻璃珠，于振蕩器上震蕩lOmin ;
[0023]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0024]加6000 μ L氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下lOOOOr離心5min ;氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0025]移取上清液至Eppendorf管中，加等體積的氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下10000r離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0026]取上清液，加入6000 μ L冰凍乙醇，靜置30min ；
[0027]常溫下10000r/min 離心 lOmin ；
[0028]棄上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L TE緩沖液溶解后在_20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0029]本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用所述用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法的白酒絲狀真菌DNA的提取方法，所述白酒絲狀真菌DNA的提取方法包括:
[0030]菌種培養(yǎng):將所篩選的白酒絲狀真菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)48h ；
[0031]吸取1ml菌液到無菌EP管中，常溫下10000r/min離心5min ；
[0032]棄去上清液，將沉淀重懸于0.8ml生理鹽水中8000r/min離心5min ；
[0033]棄去上清液，向EP管內(nèi)加入6000 μ L2XCTAB提取緩沖液混合，再加入lg玻璃珠，于振蕩器上震蕩lOmin ;
[0034]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0035]加6000 μ L氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下lOOOOr離心5min ;氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0036]移取上清液至Eppendorf管中，加等體積的的氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下10000r離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0037]取上清液，加入6000 μ L冰凍乙醇，靜置30min ；
[0038]常溫下10000r/min 離心 lOmin ；
[0039]棄上清液，用70%的乙醇洗2-3次，晾干，加6000 μ L TE緩沖液溶解后在_20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0040]本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用所述用于PCR擴增的絲狀真菌DNA的提取方法的泡菜絲狀真菌DNA的提取方法，所述泡菜絲狀真菌DNA的提取方法包括:
[0041]菌種培養(yǎng):將所篩選的泡菜絲狀真菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)48h ；
[0042]吸取1ml菌液到無菌EP管中，常溫下10000r/min離心5min ；
[0043]棄去上清液，將沉淀重懸于0.8ml生理鹽水中8000r/min離心5min ；
[0044]棄去上清液，向EP管內(nèi)加入6000 μ L2 X CTAB提取緩沖液混合，再加入lg玻璃珠，于振蕩器上震蕩lOmin ;
[0045]65°C 下水浴 30min_40min ;
[0046]加6000 μ L氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下lOOOOr離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0047]移取上清液至Eppendorf管中，加等體積的的氯仿/異戊醇混合液搖勻，常溫下10000r離心5min，氯仿/異戊醇混合液體積比為24:1 ;
[0048]取上清液，加入6000 μ L冰凍乙醇，靜置30min ；
[0049]常溫下10000r/min 離心 lOmin ；
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