一種高效的細(xì)胞融合方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及細(xì)胞或原生質(zhì)體的融合方法。 技術(shù)背景
[0002] 細(xì)胞間或者原生質(zhì)體與細(xì)胞間的融合是現(xiàn)代細(xì)胞工程常用的技術(shù)，經(jīng)過融合，一 種細(xì)胞或原生質(zhì)體中基因片段轉(zhuǎn)入另一種細(xì)胞中，并整合細(xì)胞基因組，從而得到所需的具 有特定遺傳特性的細(xì)胞。該技術(shù)在單克隆抗體制備、動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因、抗癌疫苗的研發(fā)中有 關(guān)鍵作用。如Li和zou等利用酵母原生質(zhì)體與胚胎干細(xì)胞融合的方法，出生了帶有兆級別 喊基的超大基因片段轉(zhuǎn)基因小鼠 （Nature protocols，2013,8 :1567-1582 ;Patent title: SPHEROPLAST FUSION :Inventors :Marianne Bruggemann，XiangangZou ;Publication date :14/05/2004 ；Patent number ：W0/2004/101802) 〇
[0003] 現(xiàn)有的細(xì)胞融合技術(shù)效率較低，特別是與胚胎干細(xì)胞相比，酵母原生質(zhì)體與體細(xì) 胞的融合效率極低。細(xì)胞之間的相互接觸是細(xì)胞融合的基礎(chǔ)，為提高融合效率，本發(fā)明對細(xì) 胞表面進(jìn)行化學(xué)修飾，將兩種具有相互結(jié)合特性的物質(zhì)分別連接到A細(xì)胞和B細(xì)胞的表面， 從而促進(jìn)A細(xì)胞和B細(xì)胞的粘合，提高細(xì)胞融合的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了 一種高效的細(xì)胞融合方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種細(xì)胞融合方法，其特征在于：將具有相互結(jié)合特性的物質(zhì)分別連接到A細(xì)胞 (或原生質(zhì)體）和B細(xì)胞（或原生質(zhì)體）的表面，促進(jìn)A細(xì)胞和B細(xì)胞的粘合，提高細(xì)胞融 合的效率。
[0007] 上述具有相互結(jié)合特性的物質(zhì)可以是生物素（biotin)和親和素（avidin)，也可 以是白蛋白（albumin)與 PEG-NHS，4 臂 PEG-NHS 酯（PEG4-NHS ester)與 4 臂聚乙二醇-硫 醇（PEG4-thiol)等。
[0008] 上述相互結(jié)合特性的物質(zhì)通過多巴胺的介導(dǎo)分別結(jié)合到A細(xì)胞和B細(xì)胞的表面。 例如，一種細(xì)胞融合方法，原生質(zhì)體或細(xì)胞帶有生物素（biotin)或親和素（avidin)。通過 多巴胺的介導(dǎo)，使生物素或親和素分別結(jié)合到A細(xì)胞和B細(xì)胞的表面。
[0009] 上述具有相互結(jié)合特性的物質(zhì)與多巴胺溶解于Tris-HCl緩沖液，使具有相互結(jié) 合特性的物質(zhì)在多巴胺介導(dǎo)下在Tris-HCl緩沖液體系中結(jié)合到細(xì)胞（或原生質(zhì)體）表面。 其中，多巴胺優(yōu)選濃度為l_3g/L，更優(yōu)選為2g/L。Tris-HCl緩沖液中優(yōu)選NaCl濃度6-12g/ 1，KC1 濃度 0· l-0.3g/l，pH = 8-9。更優(yōu)選地，NaCl 濃度 9g/l，KCl 濃度 0.2g/l，pH = 8.5。 多巴胺溶解液中，改良Tris-HCl緩沖液中Na、K離子可提供與細(xì)胞生理水平接近的滲透壓， 減少對細(xì)胞的損傷。
[0010] 例如，具有相互結(jié)合特性的物質(zhì)為生物素和親和素，生物素或親和素與多巴胺溶 解于Tris-HCl緩沖液中，再添加至細(xì)胞中，通過多巴胺的作用，使生物素或親和素結(jié)合到 細(xì)胞表面。
[0011] 一種細(xì)胞融合方法，包括以下步驟：
[0012] (1)細(xì)胞或原生質(zhì)體用多巴胺介導(dǎo)biotin附著在細(xì)胞膜上；
[0013] (2)另一種細(xì)胞或原生質(zhì)體用多巴胺介導(dǎo)avitin附著在細(xì)胞膜上；
[0014] (3)將處理后的兩種細(xì)胞或與原生質(zhì)體混合，通過常規(guī)細(xì)胞融合方法進(jìn)行處理；
[0015] (4)經(jīng)培養(yǎng)和篩選，獲得融合細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明的融合方法可用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株或抗體分泌的雜交瘤等等。
[0017] 上述常規(guī)的細(xì)胞融合方法，如PEG介導(dǎo)融合或電刺激介導(dǎo)融合等。
[0018] 上述細(xì)胞或原生質(zhì)體為無細(xì)胞壁或去細(xì)胞壁的生物形態(tài)結(jié)構(gòu)，可以是原核細(xì)胞， 也可以是真核細(xì)胞。如酵母、細(xì)菌、植物細(xì)胞等。
[0019] 有益效果
[0020] 1.本發(fā)明的細(xì)胞融合效率為常規(guī)融合方法的10~20倍以上，且對細(xì)胞損傷小，細(xì) 胞具有尚生命活性。
[0021] 2.本發(fā)明方法巧妙，操作簡單，無論是實(shí)驗(yàn)室或是大規(guī)模生產(chǎn)中都可實(shí)現(xiàn)有效融 合，且融合穩(wěn)定，即使細(xì)胞攜帶超大片段重組核酸分子仍可進(jìn)行有效而穩(wěn)定的融合，并保持 生物活性。
【附圖說明】
[0022] 圖1實(shí)施例1利用本發(fā)明方法進(jìn)行細(xì)胞融合后篩選的細(xì)胞克隆照片（吉姆薩染 色）
[0023] 圖2圖1中單個(gè)細(xì)胞克隆的局部放大圖片
[0024] 圖3實(shí)施例1融合后細(xì)胞基因檢測圖（1-7泳道為HIgKV2. 30擴(kuò)增產(chǎn)物；9-12， 14-16 為 HIgKV3. 15 擴(kuò)增條帶；13 為 marker ; 18-24 為 HIgKDe 擴(kuò)增產(chǎn)物）
[0025] 圖4實(shí)施例2中human Ig Kappa的mRNA的檢測
[0026] 圖5實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因豬中人免疫球蛋白Kappa的蛋白表達(dá)檢測圖
[0027] 圖6【具體實(shí)施方式】中轉(zhuǎn)入細(xì)胞的人免疫球蛋白Kappa輕鏈基因簇結(jié)構(gòu)圖
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不僅限于此。
[0029] 實(shí)施例1酵母細(xì)胞與胎豬成纖維細(xì)胞的融合
[0030] L試劑準(zhǔn)備
[0031] l)Yro 培養(yǎng)基（1000ml):酵母提取物（Yeast extract，Y1625-250G) 10g，細(xì)菌蛋白 胨（Bacto Peptone，P0431-250G)20g，高壓滅菌，室溫保存。
[0032] 配制40%的葡萄糖溶液，過0. 22 μ m濾膜除菌，室溫保存。
[0033] 使用YH)培養(yǎng)基時(shí)，加入葡萄糖溶液，終濃度為2 %。
[0034] 2) STE (現(xiàn)用現(xiàn)配置）150 ml :

[0036] 3) SPEM 溶液 500ml
[0038] 4)STDC 溶液（10ml):
[0040] 5) Tris-HCl 改良緩沖液 pH = 8. 5 :
[0041] 取 0· lMTris 溶液 25ml，0· 1MHC1 溶液 7. 35ml，再加入 NaCl (終濃度 9g/l)，KC1 (終 濃度0· 2g/l)，加水定容至50毫升，即得到pH = 8. 5的Tris-HCl。
[0042] 5) Tris-HCl-Dopamine (2mg/ml) 10ml :稱取多巴胺（Dopamine) 20mg，溶解于改良 的Tris-HCl緩沖液中（pH = 8· 5)中。
[0043] 2、酵母菌的準(zhǔn)備和處理
[0044] 1)將酵母菌菌液（帶有人免疫球蛋白Kappa輕鏈基因簇，其結(jié)構(gòu)見圖6,且含有 neomycin篩選基因）加入到Y(jié)PD中，