本發(fā)明涉及一種補骨脂素胺類衍生物及用途，該類化合物經(jīng)過抗白癜風活性篩選，4c-4h、4j-4p和4s-4t共15個化合物均可用于臨床上制備治療白癜風的藥物。

背景技術：

白癜風是一種常見的自發(fā)或特發(fā)性的色素脫失性皮膚病，被稱為世界皮膚病三大頑癥之一，困擾全世界5000萬以上的患者。在世界不同地域、不同種族間發(fā)病率從0.1％-8％不等，我國一般人群患病率為0.56％左右，大約一半患者于20周歲以前發(fā)病，男性和女性的患病率相等。白癜風主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜的白斑及灰/白色毛發(fā)等。西醫(yī)認為白癜風是由于皮膚和毛囊的黑素細胞內酪氨酸酶系統(tǒng)的功能減退、喪失而引起的。

補骨脂為豆科一年生草本植物補骨脂(psoraleacorylifolial.)的干燥成熟果實，收載于《中國藥典》、《維吾爾藥志》、《中華本草-維吾爾分卷》等，是歷代傳統(tǒng)維吾爾醫(yī)治療白癜風的主要經(jīng)典藥物。維吾爾醫(yī)學認為白癜風主要由異常粘液質引起，治療時主張清除異常體液，糾正異常氣質，從而恢復機體自然力。補骨脂具有生干生熱、清除異常黏液質、凈血解毒、增加色素、殺驅腸蟲等功效。此外，補骨脂還具有抗菌、雌激素樣作用、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)和抗抑郁等多種生物活性。

目前以植物補骨脂為主要成分的藥物和制劑，臨床上主要用于治療白癜風：如復方補骨脂顆粒、補骨脂注射液、復方補骨脂酊、驅白巴布斯片、復方卡力孜然酊(維藥名維阿露)等。盡管維藥治療白癜風效果顯著，優(yōu)勢明顯，但是其物質基礎研究薄弱，作用機制和體內外代謝過程亦不明晰，嚴重的制約了其二次開發(fā)。

經(jīng)過多年研究，國內外研究人員已經(jīng)從補骨脂(psoraleacorylifolial.)中分離出補骨脂素類化合物(呋喃香豆素類化合物)、黃酮類、萜類、以及少量脂類和揮發(fā)油。其中補骨脂素類化合物(呋喃香豆素類化合物)作為其中的主要化學成分，研究范圍最廣。

補骨脂素類化合物(psoralen)是目前臨床上治療白癜風最常用的光敏性藥物，但是必須配合日光或長波紫外線(uva)照射治療，所以此種治療方法稱為puva(psoralen+uva)。常用的有8-甲氧基補骨脂素(8-mop)和5-甲氧補骨脂素(5-mop)，后來又人工合成了三甲基補骨脂素(tmp)，如結構所示。在白癜風的治療中，puva能夠激活酪氨酸酶活性，催化黑素合成，促進黑素細胞的分裂及移動，最終使黑色素合成增加，白斑顏色逐漸恢復。

三種常用補骨脂素類化合物的結構

經(jīng)檢索，有關文獻為：

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本發(fā)明在國內外有關專利、文獻的綜合分析和本課題組前期研究工作的基礎上，對該植物中的活性化合物—補骨脂素進行進一步的改造和修飾，通過胺化反應將不同的仲胺引入到補骨脂素分子中，提高其成藥性，并研究了這些胺類衍生物對小鼠b16細胞中黑素生成及酪氨酸酶活性的影響，其結果表明了療效顯著、靶點明確、作用機理清晰的抗白癜風新藥。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種補骨脂素胺類衍生物及用途，該類衍生物以間苯二酚為起始原料，在硫酸的作用下，首先與氯乙酰乙酸乙酯縮合得到4-氯甲基-7-羥基香豆素(中間體1)；然后，中間體1再與五種不同的仲胺反應得到4-取代胺基甲基-7-羥基香豆素2(中間體2a-2e)；接下來，在中間體2的7-位引入四種不同的側鏈，得到中間體3(3a-3t)；最后，中間體3在氫氧化鉀乙醇溶液中關環(huán)形成補骨脂素，最終得到補骨脂素胺類衍生物4(4a-4t)。并將得到的20個補骨脂素胺類衍生物進行了小鼠b16細胞中黑素生成及酪氨酸酶活性的作用試驗，其結果：化合物4c-4h、4j-4p和4s-4t共15個補骨脂素胺類衍生物均可用于臨床上制備治療白癜風的藥物。

本發(fā)明所述的一種補骨脂素胺類衍生物，該類衍生物結構為：

其中：

化合物4a為3-甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4b為3,4-二甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4c為4-哌啶甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4d為3-苯基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4e為3-甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4f為3,4-二甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4g為4-嗎啉甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4h為3-苯基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4i為3-甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4j為3,4-二甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4k為4-(4-甲基哌嗪)甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4l為3-苯基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4m為3-甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4n為3,4-二甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4o為4-二乙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4p為3-苯基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4q為3-甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4r為3,4-二甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4s為4-二丙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

化合物4t為3-苯基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮。

所述補骨脂素胺類衍生物中，4c-4h、4j-4p和4s-4t共15個化合物用于臨床上制備治療白癜風的藥物中的用途。

本發(fā)明所述的一種補骨脂素酯類衍生物，其結構如通式(i)所示：

本發(fā)明所述的一種補骨脂素胺類衍生物，將得到的20個補骨脂素胺類衍生物進行了小鼠b16細胞中黑素生成及酪氨酸酶活性的作用試驗，促進黑素合成的結果顯示：與陰性對照相比，所有20個衍生物均能夠促進b16細胞中黑素的生成，且促進作用從119.96％-200.85％不等；與陽性對照相比，化合物4c-4h、4j-4p、4s-4t共15個化合物對黑素生成的促進作用均優(yōu)于陽性對照，其中化合物4h、4l和4p對黑素生成的促進作用是陽性對照的1.4倍以上；

激活酪氨酸酶活性的結果顯示：與陰性對照相比，除4b、4p、4q和4r以外的所有化合物均能夠激活酪氨酸酶的活性，且激活作用從114.78％-178.88％不等；與陽性對照相比，化合物4g和4j-4m共6個化合物對酪氨酸酶活性的激活作用均優(yōu)于陽性對照，其中化合物4j對酪氨酸酶活性的激活作用超過陽性對照的1.3倍。

綜上所述，化合物4c-4h、4j-4p和4s-4t共15個補骨脂素胺類衍生物均可用于臨床上制備治療白癜風的藥物。

本發(fā)明所述的新型補骨脂素胺類衍生物及用途，其中補骨脂素胺類衍生物的制備方法，按下列步驟進行：

中間體1的制備：

a、在冰浴條件下，將間苯二酚溶解在適量的干燥濃硫酸中，攪拌至全部溶解后，緩慢滴加4-氯乙酰乙酸乙酯，使其溫度為0℃，滴加完畢后，移至室溫反應，攪拌過夜，將反應液傾倒入冰水中，充分攪拌，待固體充分沉淀后，抽濾干燥，得4-氯甲基-7-羥基香豆素(中間體1)；

中間體2的制備：

b、將哌啶/或嗎啉、4-甲基哌嗪/或二乙胺或二丙胺和步驟a得到的中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1-10:1的氯仿∶甲醇，依次得中間體2；

中間體3的制備：

c、將碳酸鉀和步驟b得到的中間體2溶解在20ml的丙酮中，并加入氯丙酮、3-氯-2-丁酮、溴代環(huán)己烷或α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比40:1-15:1的氯仿∶甲醇，依次得中間體3；

化合物4的制備：

將步驟c得到的中間體3溶解在無水乙醇中，加入濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比50:1-10:1的氯仿∶甲醇，最終得到化合物4。

化學反應式為：

3a-3d,4a-4d:r1,r2＝(ch2)53a,4a:r＝ch3,r'＝h；3b,4b:r＝ch3,r'＝ch3；3c,4c:r,r'＝(ch2)5；3d,4d:r＝ph,r'＝h

3e-3h,4e-4h:r1,r2＝(ch2ch2)2o3e,4e:r＝ch3,r'＝h；3f,4f:r＝ch3,r'＝ch3；3g,4g:r,r'＝(ch2)5；3h,4h:r＝ph,r'＝h

3i-3l,4i-4l:r1,r2＝n(ch2ch2)2nch33i,4i:r＝ch3,r'＝h；3j,4j:r＝ch3,r'＝ch3；3k,4k:r,r'＝(ch2)5；3l,4l:r＝ph,r'＝h

3m-3p,4m-4p:r1＝r2＝ch2ch33m,4m:r＝ch3,r'＝h；3n,4n:r＝ch3,r'＝ch3；3o,4o:r,r'＝(ch2)5；3p,4p:r＝ph,r'＝h

3q-3t,4q-4t:r1＝r2＝ch2ch2ch33q,4q:r＝ch3,r'＝h；3r,4r:r＝ch3,r'＝ch3；3s,4s:r,r'＝(ch2)5；3t,4t:r＝ph,r'＝h

(i)氯乙酰乙酸乙酯,濃硫酸,0℃-室溫(ii)對于2a:哌啶，四氫呋喃，回流；對于2b:嗎啡啉，四氫呋喃，回流；對于2c:n-甲基哌嗪，四氫呋喃，回流；對于2d:二乙胺，四氫呋喃，回流；對于2e:二丙胺，四氫呋喃，回流；(iii)對于3a，3e，3i，3m，3q:氯丙酮，碳酸鉀，丙酮回流；對于3b，3f，3j，3n，3r:2-氯丁酮，碳酸鉀，丙酮，回流；對于3c，3g，3k，3o，3s:溴代環(huán)己烷，碳酸鉀，丙酮，回流；對于3d，3h，3l，3p，3t:溴代苯乙酮，碳酸鉀，丙酮，回流(iv)4％氫氧化鉀乙醇溶液，乙醇，回流。

其中r1和r2分別為哌啶基、嗎啉基、4-甲基哌嗪基、二乙胺基、二丙胺基；r和r’分別為甲基、氫；甲基、甲基；環(huán)己基；苯基、氫。

附圖說明

圖1為本發(fā)明補骨脂素胺類衍生物4a-4t對b16細胞中黑素合成做用圖；

圖2為本發(fā)明補骨脂素胺類衍生物4a-4t對b16細胞中酪氨酸酶活性的作用圖。

具體實施方式

依據(jù)實施例對本發(fā)明進一步說明，但本發(fā)明不僅限于這些實施例；

試劑：所有試劑均為市售的分析純；

實施例1(中間體1-中間體3的制備)

中間體1的制備：

在冰浴條件下，將1.10g間苯二酚溶解在適量的干燥濃硫酸中，攪拌至全部溶解后，緩慢滴加1.62ml的4-氯乙酰乙酸乙酯，使其溫度為0℃，滴加完畢后，移至室溫反應，攪拌過夜，將反應液傾倒入冰水中，充分攪拌，待固體充分沉淀后，抽濾干燥，得到0.188g中間體1，名稱為4-氯甲基-7-羥基香豆素；

中間體2的制備：

將0.50ml的哌啶和0.21g中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.233g中間體2a，4-哌啶甲基-7-羥基香豆素；

將0.44ml的嗎啉和0.21g中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，得0.240g中間體2b，4-嗎啉甲基-7-羥基香豆素；

將0.55ml的4-甲基哌嗪和0.21g中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.252g中間體2c，4-(4-甲基哌嗪)甲基-7-羥基香豆素；

將0.51ml的二乙胺和0.21g中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.211g中間體2d，4-二乙胺基甲基-7-羥基香豆素；

將0.68ml的二正丙胺和0.21g中間體1溶解在干燥的四氫呋喃中，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.254g中間體2e，4-二丙胺基甲基-7-羥基香豆素；

中間體3的制備：

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2a溶解在20ml的丙酮中，并加入0.10ml的氯丙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.29g中間體3a，4-哌啶甲基-7-(2-氧代丙氧基)香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2a溶解在20ml的丙酮中，并加入0.12ml的3-氯-2-丁酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.303g中間體3b，4-哌啶甲基-7-(3-氧代丁烷-2-基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2a溶解在20ml的丙酮中，并加入0.14ml的2-溴環(huán)己酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.328g中間體3c，4-哌啶甲基-7-(2-氧代環(huán)己基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2a溶解在20ml的丙酮中，并加入0.24g的α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.350g中間體3d，4-哌啶甲基-7-(2-氧代苯乙基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2b溶解在20ml的丙酮中，并加入10ml的氯丙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.289g中間體3e，4-嗎啉甲基-7-(2-氧代丙氧基)香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2b溶解在20ml的丙酮中，并加入0.12ml的3-氯-2-丁酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.300g中間體3f，4-嗎啉甲基-7-(3-氧代丁烷-2-基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2b溶解在20ml的丙酮中，并加入0.14ml的2-溴環(huán)己酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.325g中間體3g，4-嗎啉甲基-7-(2-氧代環(huán)己基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2b溶解在20ml的丙酮中，并加入0.24g的α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.361g中間體3h，4-嗎啉甲基-7-(2-氧代苯乙基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.27g中間體2c溶解在20ml的丙酮中，并加入10ml的氯丙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.297g中間體3i，4-(4-甲基哌嗪)-7-(2-氧代丙氧基)香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.27g中間體2c溶解在20ml的丙酮中，并加入0.12ml的3-氯-2-丁酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.312g中間體3j，4-(4-甲基哌嗪)-7-(3-氧代丁烷-2-基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2c溶解在20ml的丙酮中，并加入0.14ml的2-溴環(huán)己酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.355g中間體3k，4-(4-甲基哌嗪)-7-(2-氧代環(huán)己基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.26g中間體2c溶解在20ml的丙酮中，并加入0.24g的α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.365g中間體3l，4-(4-甲基哌嗪)-7-(2-氧代苯乙基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.25g中間體2d溶解在20ml的丙酮中，并加入0.10ml的氯丙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.286g中間體3m，4-二乙胺基甲基-7-(2-氧代丙氧基)香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.25g中間體2d溶解在20ml的丙酮中，并加入0.12ml的3-氯-2-丁酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.293g中間體3n，4-二乙胺基甲基-7-(3-氧代丁烷-2-基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.25g中間體2d溶解在20ml的丙酮中，并加入0.14ml的2-溴環(huán)己酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.314g中間體3o，4-二乙胺基甲基-7-(2-氧代環(huán)己基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.25g中間體2d溶解在20ml的丙酮中，并加入0.24g的α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，得0.333g中間體3p，4-二乙胺基甲基-7-(2-氧代苯乙基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.28g中間體2e溶解在20ml的丙酮中，并加入0.10ml的氯丙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，得0.296g中間體3q，4-二丙胺基甲基-7-(2-氧代丙氧基)香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.28g中間體2e溶解在20ml的丙酮中，并加入0.12ml的3-氯-2-丁酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.315g中間體3r，4-二丙胺基甲基-7-(3-氧代丁烷-2-基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.28g中間體2e溶解在20ml的丙酮中，并加入0.14ml的2-溴環(huán)己酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，得0.343g中間體3s，4-二丙胺基甲基-7-(2-氧代環(huán)己基)氧基香豆素；

將0.69g碳酸鉀和0.28g中間體2e溶解在20ml的丙酮中，并加入0.24g的α-溴代苯乙酮，回流反應至原料全部消失，反應液過濾，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比25:1的氯仿∶甲醇，得0.367g中間體3t，4-二丙胺基甲基-7-(2-氧代苯乙基)氧基香豆素。

實施例2

制備化合物4a：

將實施例1得到的0.315g中間體3a溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.267g化合物4a，3-甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4a)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.98(s,1h),7.46(s,1h),7.42(s,1h),6.54(s,1h),3.69(s,2h),2.59-2,46(m,4h),2.29(s,3h),1.68-1.58(m,4h),1.54-1.45(s,2h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.55,156.69,152.11,143.18,126.44,115.88,115.17,110.18,99.91,60.13,55.17,26.13,24.19,8.01。

實施例3

制備化合物4b：

將實施例1得到的0.329g中間體3b溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.280g化合物4b，3,4-二甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3,4-二甲基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4b)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.82(s,1h),7.33(s,1h),6.52(s,1h),3.68(s,2h),2.60-2.46(m,4h),2.40(s,3h),2.19(s,3h),1.70-1.58(m,4h),1.54-1.45(m,2h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.90,155.42,152.76,151.60,127.96,114.80,113.80,112.56,109.81,99.16,60.02,55.19,26.15,24.23,12.10,8.04。

實施例4

制備化合物4c：

將實施例1得到的0.355g中間體3c溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.305g化合物4c，4-哌啶甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

4-哌啶甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4c)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(s,1h),7.36(s,1h),6.52(s,1h),3.66(s,2h),2.79-2.71(m,2h),2.69-2.61(m,2h),2.57-2.46(m,4h),2.00-1.83(m,4h),1.67-1.57(m,4h),1.52-1.43(m,2h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.63,156.22,155.82,151.29,126.23,114.60,113.39,112.76,99.41,59.69,54.96,25.83,23.93,23.39,22.68,22.42,20.33。

實施例5

制備化合物4d：

將實施例1得到的0.377g中間體3d溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.327g化合物4d，3-苯基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-苯基-5-哌啶甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4d)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.48(s,1h),7.84(s,1h),7.67(d,j＝7.8hz,2h),7.56-7.47(m,3h),7.43(t,j＝7.3hz,1h),6.49(s,1h),3.65(s,2h),2.55-2.45(m,4h),1.68-1.59(m,5h),1.54-1.45(m,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.47,157.10,153.14,152.20,142.81,131.33,129.30,128.11,127.60,123.74,122.41,117.06,115.83,113.46,100.10,60.80,54.98,26.30,24.27。

實施例6

制備化合物4e：

將實施例1得到的0.317g中間體3e溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比50:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.260g化合物4e，3-甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4e)的核磁數(shù)據(jù):

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.92(s,1h),7.47(s,1h),7.42(s,1h),6.54(s,1h),3.76(t,(t,j＝4.3hz,4h),3.74(s,2h),2.61(t,j＝4.3hz,4h),2.29(s,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.48,156.71,152.00,143.30,126.49,115.78,114.91,113.09,99.99,67.10,59.68,54.03,7.98。

實施例7

制備化合物4f：

將實施例1得到的0.331g中間體3f溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比50:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.284g化合物4f，3,4-二甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3,4-二甲基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4f)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.77(s,1h),7.34(s,1h),6.53(s,1h),3.77(t,j＝4.2hz,4h),3.74(s,2h),2.61(t,j＝4.2hz,4h),2.40(s,3h),2.19(s,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.68,155.50,152.94,151.60,128.05,114.52,113.60,112.76,109.75,99.28,67.10,59.64,54.05,12.10,8.04。

實施例8

制備化合物4g：

將實施例1得到的0.357g中間體3g溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比50:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.302g化合物4g，4-嗎啉甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

4-嗎啉甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4g)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.76(s,1h),7.37(s,1h),6.53(s,1h),3.76(t,j＝4.2hz,4h),3.71(s,2h),2.78-2.72(m,2h),2.67-2.62(m,2h),2.59(t,j＝4.2hz,4h),2.00-1.89(m,4h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.68,155.50,152.94,151.60,128.05,114.52,113.60,112.76,109.75,99.28,67.10,59.64,54.05,31.07,29.98,12.10,8.04。

實施例9

制備化合物4h：

將實施例1得到的0.379g中間體3h溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比50:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.323g化合物4h，3-苯基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-苯基-5-嗎啉甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4h)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.39(s,1h),7.85(s,1h),7.66(d,j＝7.1hz,2h),7.57-7.50(m,3h),7.45(t,j＝7.3hz,1h),6.53(s,1h),3.76(t,j＝4.0hz,4h),3.71(s,2h),2.59(t,j＝4.0hz,4h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.24,157.18,152.21,142.99,131.22,129.83,129.34,128.23),127.64,123.95,122.42,116.68,115.53,113.81,100.31,67.14,60.15,53.87。

實施例11

制備化合物4i：

將實施例1得到的0.330g中間體3i溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.276g化合物4i，3-甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4i)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.90(s,1h),7.46(s,1h),7.42(s,1h),6.55(s,1h),3.74(s,2h),2.74-2.45(m,8h),2.34(s,3h),2.29(s,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.56,156.71,152.39,152.11,143.26,126.48,115.83,114.86,112.86,99.99,59.06,55.19,53.34,45.93,8.01。

實施例11

制備化合物4j：

將實施例1得到的0.344g中間體3j溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比30:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.291g化合物4j，3,4-二甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3,4-二甲基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4j)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.75(s,1h),7.33(s,1h),6.53(s,1h),3.72(s,2h),2.72-2.42(m,8h),2.40(s,3h),2.31(s,3h),2.19(s,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.81,155.46,152.85,152.63,151.59,127.99,114.61,113.57,112.47,109.77,99.22,59.09,55.26,53.52,46.06,12.09,8.05。

實施例12

制備化合物4k：

將實施例1得到的0.370g中間體3k溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.320g化合物4k，4-(4-甲基哌嗪)甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

4-(4-甲基哌嗪)甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4k)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.72(s,1h),7.37(s,1h),6.53(s,1h),3.72(s,2h),2.80-2.48(m,12h),2.35(s,3h),2.01-1.83(m,4h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.81,156.46,156.00,152.59,151.47,126.41,114.62,113.26,112.88,112.50,99.63,59.00,55.17,53.36,45.93,23.57,22.84,22.58,20.49。

實施例13

制備化合物4l：

將實施例1得到的0.392g中間體3l溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比20:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.351g化合物4l，3-苯基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-苯基-5-(4-甲基哌嗪)甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4l)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.40(s,1h),7.87(s,1h),7.67(d,j＝7.2hz,2h),7.58-7.51(m,3h),7.47(t,j＝7.2hz,1h),6.54(s,1h),3.72(s,2h),2.73-2.44(m,8h),2.36(s,3h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.34,158.07,151.89,143.20,131.16,130.03,129.42,128.50,127.73,124.21,122.70,117.13,115.43,114.17,99.87,59.17,56.01,54.53,46.08。

實施例14

制備化合物4m：

將實施例1得到的0.303g中間體3m溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.252g化合物4m，3-甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4m)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.99(s,1h),7.46(s,1h),7.42(s,1h),6.61(s,1h),3.80(s,2h),2.65(q,j＝7.1hz,4h),2.29(s,3h),1.11(t,j＝7.1hz,6h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ156.48,151.86,142.99,140.24,128.84,126.24,115.69,114.83,110.67,99.73,54.76,47.72,11.92,7.82。

實施例15

制備化合物4n：

將實施例1得到的0.317g中間體3n溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.270g化合物4n，3,4-二甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3,4-二甲基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4n)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.81(s,1h),7.32(s,1h),6.59(s,1h),3.77(s,2h),2.62(q,j＝7.1hz,4h),2.39(s,3h),2.18(s,3h),1.09(t,j＝7.1hz,6h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ162.04,155.35,154.74,152.69,151.51,131.03,128.97,127.87,113.61,112.46,99.10,55.03,47.91,12.22.12.07,8.00。

實施例16

制備化合物4o：

將實施例1得到的0.343g中間體3o溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.298g化合物4o，4-二乙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

4-二乙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4o)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(s,1h),7.35(s,1h),6.59(s,1h),3.76(s,2h),2.78-2.71(m,2h),2.68-2.56(m,6h),2.02-1.81(m,4h),1.08(t,j＝7.1hz,6h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ162.05,156.29,155.90,154.71,151.40,126.28,114.82,113.28,112.89,112.52,99.52,54.97,47.90,23.56,22.86,22.59,20.47,12.18。

實施例17

制備化合物4p：

將實施例1得到的0.365g中間體3p溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.317g化合物4p，3-苯基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-苯基-5-二乙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4p)的核磁數(shù)據(jù):

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.42(s,1h),7.84(s,1h),7.66(d,j＝7.4hz,2h),7.55-7.48(m,3h),7.42(t,j＝7.2hz,1h),6.58(s,1h),3.77(s,2h),2.61(q,j＝7.0hz,4h),1.09(t,j＝7.0hz,6h).

¹³cnmr(101mhz,ccdcl3)δ161.50,157.12,152.18,142.87,131.30,129.31,128.14,127.67,123.82,122.47,116.67,115.79,113.77,100.22,55.36,47.79,12.08。

實施例18

制備化合物4q：

將實施例1得到的0.331g中間體3q溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.277g化合物4q，3-甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4q)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.02(s,1h),7.45(s,1h),7.40(s,1h),6.59(s,1h),3.79(s,2h),2.49(t,j＝7.2hz,4h),2.27(s,3h),1.53(h,j＝7.3hz,4h),0.89(t,j＝7.3hz,7h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.78,156.63,152.03,143.12,131.04,128.97,126.33,115.85,115.26,113.03,99.81,56.77,56.58,20.42,12.04,7.98。

實施例19

制備化合物4r：

將實施例1得到的0.345g中間體3r溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.302g化合物4r，3,4-二甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3,4-二甲基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4r)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.86(s,1h),7.33(s,1h),6.57(s,1h),3.77(s,2h),2.48(t,j＝7.3hz,4h),2.40(s,3h),2.18(s,3h),1.52(h,j＝7.3hz,4h),0.89(t,j＝7.3hz,7h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ162.03,155.39,152.69,151.53,131.05,128.99,113.95,112.60,109.81,99.10,56.81,56.61,19.31,12.09,12.06,8.04。

實施例20

制備化合物4s：

將實施例1得到的0.371g中間體3s溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比10:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.328g化合物4s，4-二丙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

4-二丙胺基甲基-6,7,8,9-四氫-2h-苯并呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4s)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.78(s,1h),7.34(s,1h),6.57(s,1h),3.75(s,2h),2.76-2.69(m,2h),2.62-2.55(m,2h),2.47(t,j＝7.2hz,4h),2.00-1.80(m,4h),1.50(h,j＝7.1hz,4h),0.87(t,j＝7.2hz,7h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ162.20,156.43,156.10,155.01,151.69,126.37,115.08,113.28,113.00,112.33,100.21,56.79,56.54,23.56,22.86,22.59,20.47,12.15。

實施例21

制備化合物4t：

將實施例1得到的0.393g中間體3t溶解在無水乙醇中，加入7ml的濃度為4％氫氧化鉀的乙醇溶液，加熱至回流反應，待原料全部消失后，減壓濃縮，將殘渣采用柱層析梯度洗脫，洗脫劑為體積比15:1的氯仿∶甲醇，最終得到0.342g化合物4t，3-苯基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮；

3-苯基-5-二丙胺基甲基-7h-呋喃[3,2-g]苯并吡喃-7-酮(化合物4t)的核磁數(shù)據(jù)：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.36(s,1h),7.83(s,1h),7.65(d,j＝7.4hz,2h),7.56-7.47(m,3h),7.43(t,j＝7.3hz,1h),6.59(s,1h),3.77(s,2h),2.48(t,j＝7.2hz,4h),1.52(h,j＝7.3hz,4h),0.85(t,j＝7.3hz,7h).

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ161.61,156.40,151.78,143.07,130.85,129.42,127.95,127.80,124.15,122.67,116.77,115.75,113.78,99.70,56.80,56.57,19.28,12.17。

實施例22

本發(fā)明所述的如結構式所示的補骨脂素胺類衍生物(4a-4t)對b16細胞中黑素合成及酪氨酸酶活性的作用測定：

篩選模型：小鼠b16黑素瘤細胞、人a375黑素瘤細胞；

細胞來源：中科院細胞庫提供；

(1)細胞毒性試驗(mtt法)：

將正處于對數(shù)生長期的黑素細胞接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)為5×103/孔，每個濃度設8復孔，24h后(細胞貼壁后)、加入不同濃度的樣品，48h后處理細胞、每孔加入10μl的mtt(濃度為5mg/ml)后在溫度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，取出96孔板后每孔加入150μl的dmso并震蕩10min，等到結晶全部溶解后用酶標儀在570nm處測定吸光度(a570)，未加藥的孔作為對照組、細胞活性按100％計算，而加藥組實驗數(shù)據(jù)最少重復三遍；

(2)蛋白定量用bradford法測定：

完全溶解蛋白標準品(5mg/mlbsa)，取10μl稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋，但是為了簡便起見，也可以用0.9％nacl或pbs稀釋標準品；將稀釋后標準品(0.5mg/mlbsa)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分別加到96孔板中，加標準品稀釋液將所有標準品補足到20μl；加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液補足到20μl；各孔加入200μlbradford染色液，用加樣槍輕輕吹打混勻(注意不要弄出氣泡影響讀數(shù))室溫放置3-5min；用酶標儀測定a595；根據(jù)標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度；

(3)黑素含量用堿消化法進行測定：

將處于對數(shù)生長期的黑素細胞接種于6cm培養(yǎng)皿中、濃度為5×105個/ml，各孔加5ml細胞懸浮液；接種12h后、待細胞完全貼壁后用藥，用藥濃度分別為1、5、10、20、50和100μg/ml；在72h后收集細胞；在不破碎細胞的情況下加入200μl的1mnaoh溶液，置溫度80℃水浴中2h后，測定波長470nm處的吸光度(a470值)，未用藥組作為對照組與用藥組進行對比；

(4)酪氨酸酶活性用l-dopa染色法進行測定：

正處于對數(shù)生長期的黑素細胞接種于12孔板中、濃度為2×105個/ml，各孔加1ml細胞懸浮液；接種12h后、待細胞完全貼壁后用藥，用藥濃度分別為1、5、10、20、50和100μg/ml；在48h后收集細胞；處理完細胞后每個ep管中加tris-0.1％triton-100溶液200μl，放入溫度-20℃冰箱中30min-1h進行裂解；用bradford法進行蛋白含量測定；將樣品蛋白含量調到統(tǒng)一濃度；各反應體系加入100μl的0.1％l-dopa后放到溫度37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2h后在475nm處測定吸光度(a475)，未用藥的組作為對照組與用藥組進行對比。

結果：化合物4c-4h、4j-4p和4s-4t共15個補骨脂素胺類衍生物均可用于臨床上制備治療白癜風的藥物。