本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用多克隆抗體親和柱純化眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)生長因子(nevergrowthfactor,ngf)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，是一種可由多種細(xì)胞產(chǎn)生的能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的多肽類因子。它與周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)的存活及發(fā)育密切相關(guān),在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起重要的作用。ngf生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)是通過ngf與效應(yīng)細(xì)胞表面的ngf受體結(jié)合而介導(dǎo)。它能夠維持并促進(jìn)外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中部分神經(jīng)元的發(fā)育和分化，營養(yǎng)成熟的神經(jīng)元，維持其存活及正常的生理功能，并且在它們受到損傷后，促進(jìn)其修復(fù)和再生。它在外周神經(jīng)系統(tǒng)的病變及一些神經(jīng)元退行性疾病，例如早老年性癡呆癥、帕金森癥的治療方面顯示了良好的應(yīng)用前景。蛇毒是分離ngf的最初來源之一,1956年cohen和levi-montalcini研究干燥的噬魚蝮蛇毒中發(fā)現(xiàn)具有磷酸二酯酶活性,粗蛇毒與肉瘤勻漿同樣能促進(jìn)脊髓神經(jīng)節(jié)的生長。后來,從蛇毒中發(fā)現(xiàn)了ngf，蛇毒ngf常常重組同質(zhì)多聚體或單體形式,與其它已知的ngf有類似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子作為藥物的主要活性成分，療效好、起效快、毒副作用小，是預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想藥物?，F(xiàn)在眼鏡蛇毒ngf作為藥物的難點(diǎn)包括天然分離純化步驟繁多且ngf純度達(dá)不到臨床用藥要求?，F(xiàn)有的眼鏡蛇毒ngf分離純化主要采用凝膠柱層析法與離子交換層析法的組合，不僅柱效的影響因素繁多，很難加以控制、重復(fù)性差，而且純化步驟較多、得到的ngf的活性較低，純度一般在90％以下?，F(xiàn)有報(bào)道也有用單克隆抗體進(jìn)行免疫柱層析進(jìn)行分離純化，即使該方法純化得到的ngf純度能達(dá)到要求但該方法的弊端是單克隆抗體制作成本高，程序復(fù)雜且抗體制備量少、周期長。雖然基因重組的技術(shù)使眼鏡蛇毒ngf的來源更為方便和廣泛，但是重組型的神經(jīng)生長因子只能復(fù)制蛇毒神經(jīng)因子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，在立體結(jié)構(gòu)上與天然神經(jīng)生長因子存在較大差異。而蛋白質(zhì)在發(fā)揮活性是通過空間結(jié)構(gòu)與受體之間的結(jié)合，因此造成了重組型的神經(jīng)生長因子的活性較差,達(dá)不到臨床用藥要求。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，使用產(chǎn)量較高的重組神經(jīng)生長因子，激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生能有效吸附天然蛇毒ngf的多克隆抗體，進(jìn)而利用免疫親和的特異性及高效性；對(duì)天然蛇毒神經(jīng)生長因子純化，得到高純度、高活性的蛇毒神經(jīng)因子。減少純化步驟和過程，減少生產(chǎn)成本，適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)。目前，尚未有相關(guān)的文獻(xiàn)和報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用多克隆抗體親和柱純化眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的方法，能夠得到天然的、高活性的蛇毒神經(jīng)因子，減少純化步驟和過程，有效控制生產(chǎn)成本，適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案：應(yīng)用多克隆抗體親和柱純化眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的方法，包括以下步驟：將眼鏡蛇毒預(yù)處理后，通過ngf-多克隆抗體親和柱進(jìn)行吸附、洗脫和進(jìn)一步純化，得到眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子；所述ngf-多克隆抗體親和柱為：通過眼鏡蛇毒ngf基因原核表達(dá)，純化分離得到重組眼鏡蛇毒ngf；將重組眼鏡蛇毒ngf作為免疫原，免疫動(dòng)物得到抗血清，并分離純化得到ngf多克隆抗體；將ngf多克隆抗體與載體結(jié)合交聯(lián)所得。進(jìn)一步的，所述眼鏡蛇毒ngf基因原核表達(dá)的菌株為大腸桿菌jm101。進(jìn)一步的，所述眼鏡蛇毒ngf基因原核表達(dá)的方法為：將眼鏡蛇毒ngf基因用核酸內(nèi)切酶ecori和hindiii酶切合成基因，用凝膠回收試劑盒回收ngf基因片段酶切產(chǎn)物，同時(shí)用ecori和hindiii酶切原核表達(dá)載體pet-32a，將酶切后的基因片段和載體通過t4dna連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-ngf；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet-32a-ngf轉(zhuǎn)化入大腸桿菌jm101，構(gòu)建表達(dá)ngf蛋白的重組菌株。進(jìn)一步的，所述的眼鏡蛇毒ngf基因，由seqidno:1所示的核苷酸序列組成。進(jìn)一步的，所述眼鏡蛇毒預(yù)處理的方法為：將蛇毒溶液加入緩沖液中，調(diào)節(jié)ph值為6.8～7.2，加40-50％硫酸銨，在0～4℃的環(huán)境中放置10～15小時(shí)，離心取沉淀，加超純水復(fù)溶。進(jìn)一步的，所述的ngf多克隆抗體的純化方法為：將抗血清通過重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱進(jìn)行吸附、洗脫和純化，得到眼鏡蛇毒ngf多克隆抗體；所述的重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱為：將重組眼鏡蛇毒ngf與載體結(jié)合交聯(lián)得到的重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱。進(jìn)一步的，所述的載體為瓊脂糖凝膠、纖維素、殼聚糖、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠、蛋白質(zhì)a-瓊脂糖凝膠、蛋白質(zhì)g-瓊脂糖凝膠、中的一種或多種。進(jìn)一步的，所述的重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱或ngf-多克隆抗體親和柱的制作方法為：將重組眼鏡蛇毒ngf抗原或ngf-多克隆抗體與生物素進(jìn)行結(jié)合得到結(jié)合生物素，再將結(jié)合生物素與鏈親和素瓊脂糖凝膠進(jìn)行結(jié)合交聯(lián)；即得到所述的重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱或ngf-多克隆抗體親和柱。生物素可以與抗原及抗體分別進(jìn)行結(jié)合且不影響抗原及抗體之間的結(jié)合及生物活性，能快速結(jié)合，具有高度肥特異性和穩(wěn)定性。兩者的親和常數(shù)比抗原-抗體高10-100萬倍。一個(gè)抗原或抗體可以偶聯(lián)十個(gè)生物素或親和素分子；而生物素與親和素分子的結(jié)合雖不屬于免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定，由于1個(gè)親和素有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位點(diǎn)，因此可以連接更多的生物素化的抗原或抗體，且也能間接的提高抗原或抗體與免疫親和柱的結(jié)合力，有效的增強(qiáng)免疫親和柱的靈敏度和結(jié)合力。且生物素與親和素結(jié)合快，且呈不可逆反應(yīng)，而且在ph，溫度，有機(jī)溶劑或變性劑較大的變化范圍內(nèi)均能穩(wěn)定存在。進(jìn)一步的，所述重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱或ngf-多克隆抗體親和柱的制備方法為：(1)鏈親和素與活化的瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)用偶聯(lián)緩沖液分別溶解瓊脂糖凝膠及鏈親和素，在瓊脂糖凝膠溶液中加入鏈親和素溶液；在室溫下偶聯(lián)4h；用pbs洗滌，得到鏈親和素瓊脂糖凝膠；所述的偶聯(lián)緩沖液為0.1mm碳酸氫鈉，0.8mm氯化鈉，ph8.9；(2)結(jié)合生物素的制備將重組眼鏡蛇毒ngf抗原或ngf-多克隆抗體用0.1mmph8.0碳酸氫鈉緩沖液溶解后，添加生物素進(jìn)行混合、攪拌，保溫2～4h后，再加入1mm氯化銨溶液，在室溫下攪拌10min，并用pbs透析，得到結(jié)合生物素；(3)重組眼鏡蛇毒ngf抗原免疫親和柱或ngf-多克隆抗體親和柱的制備用結(jié)合緩沖液分別溶解鏈親和素瓊脂糖凝膠及結(jié)合生物素；在室溫的條件下，不斷攪拌鏈親和素瓊脂糖凝膠，逐滴加入結(jié)合生物素溶液；攪拌反應(yīng)20～22h后填充于萃取柱中加入結(jié)合緩沖液進(jìn)行沉淀和洗滌；所述的結(jié)合緩沖液為：20-50mm磷酸二氫鈉，100-150mm氯化鈉，ph7.4-8.0。進(jìn)一步的，所述重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱或ngf-多克隆抗體親和柱的純化方法為：(1)使用結(jié)合緩沖液進(jìn)行平衡；(2)將抗血清或蛇毒緩慢上樣；(3)使用結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗脫；(4)使用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫并收集；所述的結(jié)合緩沖液為20-50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph7.4-8.0；所述的洗脫緩沖液為80-100mm甘氨酸并用鹽酸調(diào)節(jié)ph為2.5-3.0。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，使用產(chǎn)量較高的重組神經(jīng)生長因子，激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生能蛇毒ngf的多克隆抗體，進(jìn)而規(guī)?；苽鋘gf-多克隆抗體親和柱，利用免疫親和的特異性及高效性；對(duì)天然蛇毒神經(jīng)生長因子純化，得到高純度、高活性的蛇毒神經(jīng)因子。減少純化步驟和過程，減少生產(chǎn)成本，適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)。本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)之一：(1)本發(fā)明利用ngf多克隆抗體免疫親和柱從蛇毒中提取天然蛇毒神經(jīng)生長因子，純化周期較短、生物活性強(qiáng)，且純度較高。避免了傳統(tǒng)方方法周期長、步驟多、試劑多對(duì)蛇毒神經(jīng)生長因子造成的損失和影響。(2)本發(fā)明采用原料方便、易生產(chǎn)規(guī)?；闹亟M蛇毒神經(jīng)生長因子作為免疫原制備多克隆抗體的抗血清；得到的多克隆抗體及多克隆抗體免疫親和柱能有效的吸附天然蛇毒神經(jīng)生長因子，特異性好，結(jié)合性高。(3)本發(fā)明利用原料方便、易生產(chǎn)規(guī)?；闹亟M蛇毒神經(jīng)生長因子作為原料制備重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱分離多克隆抗體，特異性好，結(jié)合性高，操作方便，成本低，有利于規(guī)?；吧a(chǎn)化。(4)本發(fā)明利用生物素與親和素系統(tǒng)，提高抗原或抗體與免疫親和柱的結(jié)合力，有效的增強(qiáng)免疫親和柱的靈敏度和結(jié)合力。(5)本發(fā)明提供的ngf多克隆抗體免疫親和柱和重組蛇毒ngf抗原免疫親和柱的柱容量高、特異性好、回收率較高。具體實(shí)施方式粗毒制備中華眼鏡蛇(najaatra)，產(chǎn)地為云南、廣東、廣西、湖南、海南、江西、浙江、安徽。采用咬皿法取眼鏡蛇蛇毒后，用1000轉(zhuǎn)/分離心10min，除去雜質(zhì)，并冰凍干燥，保存在-4℃的冰凍環(huán)境中。蛇毒神經(jīng)因子的原核表達(dá)(1)眼鏡蛇ngf基因改造及合成眼鏡蛇ngf基因原始序列來源于申請(qǐng)人自己克隆，對(duì)原始序列進(jìn)行去信號(hào)肽并在成熟肽前端加入起始密碼子(atg)，并在序列兩端各加一個(gè)上酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出段，用于構(gòu)建表達(dá)載體)，5’端酶切位點(diǎn)為ecori(序列為gaattc),3’端酶切位點(diǎn)為hindiii(序列為aagctt)。改造后具體序列如下：cggaattcatggaagatcatcctgtgcataacctaggggaacattctgtgtgtgacagtgtcagtgcctgggttaccaaaactaccgcaacagacatcaaaggcaatacggtgactgtgatggaaaatgtaaatcttgataacaaagtctacaagcagtacttctttgaaaccaagtgcaaaaatccaaatccagaaccgagtggttgcaggggcattgattccagccattggaattcttattgtaccacaacagacacatttatcaaggcattaaccatggaaggcaatcaggcatcctggcgcttcatccggattgaaactgcctgtgtgtgtgtaatcactaaaaaaaaaggaaaaagcttgg并將上述序列合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。(2)原核表達(dá)載體的構(gòu)建：用核酸內(nèi)切酶ecori和hindiii酶切合成基因，用凝膠回收試劑盒回收ngf基因片段酶切產(chǎn)物，同時(shí)用ecori和hindiii酶切原核表達(dá)載體pet-32a，將酶切后的基因片段和載體通過t4dna連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-ngf；(3)重組表達(dá)菌株的構(gòu)建：將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet-32a-ngf轉(zhuǎn)化入大腸桿菌jm101，構(gòu)建表達(dá)ngf蛋白的重組菌株；(4)ngf蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將pet-32a-ngf陽性單菌落接種于5mlkana抗性lb培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物按1％體積接種于2管250ml新鮮lb培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至od600nm為0.6后，加iptg至終濃度為0.4mmm，培養(yǎng)5h，離心收集菌體。重組眼鏡蛇毒ngf抗原的純化(1)將收集的ngf蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)菌體重懸于5ml裂解緩沖液中，超聲波破碎，條件為功率200-300w，超聲3s停5s，總計(jì)20min，至菌懸液變澄清后12000r/min離心15min，重復(fù)3次，去除不溶性細(xì)胞碎片，獲得含有ngf蛋白的上清液。(2)鎳柱層析：菌體裂解液的上清液用0.45μm濾膜過濾確保澄清，用鎳親和層析柱純化，同時(shí)樣品及bindingbuffer中加適量nacl。相關(guān)操作過程參照ge公司提供的操作指南進(jìn)行：轉(zhuǎn)移樹脂到柱子，待完全沉降后，用雙蒸水洗滌5個(gè)柱體積，加3個(gè)柱體積ni2+溶液；用ddh2o洗滌，除盡未掛柱的ni2+；10×柱體積的bindingbuffer平衡→上樣→10×柱體積的bindingbuffer洗滌，收集流出液→elutionbuffer洗脫→得到重組蛋白ngf(由seqidno:2所示的氨基酸序列組成)。重組眼鏡蛇毒ngf抗體親和柱的制備(1)瓊脂糖凝膠sepharose2b的活化取2％的瓊脂糖凝膠sepharose2b，用20倍體積的蒸餾水充分沖洗，洗去殘存的乙醇。用漏斗過濾掉水分。稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入0.8mm的氫氧化鈉7.5ml，30％的環(huán)氧氯丙烷2ml，2mg/ml的硼氫化鈉5ml，在25℃下?lián)u床反應(yīng)8h。反應(yīng)后，用50ml蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。(2)鏈親和素與活化的瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)取1克活化后的瓊脂糖凝膠，用偶聯(lián)緩沖液(0.1mm碳酸氫鈉，0.8mm氯化鈉，ph8.9)洗滌3次。加入2mg/ml的鏈親和素20ml，室溫下偶聯(lián)4h。將偶聯(lián)好的瓊脂糖載體用20mmm、ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次，得到鏈親和素瓊脂糖凝膠。(3)重組眼鏡蛇毒ngf抗原與生物素的偶聯(lián)將重組眼鏡蛇毒ngf抗原用0.1mmph8.0的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到1mg/ml，用0.1mmph8.0碳酸氫鈉緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)充分透析。用1ml二甲基亞砜溶解生物素1mg。取1mlngf抗原溶液與120μl生物素溶液混合；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2～4h。再加入9.6μl1mm氯化銨溶液，在室溫下攪拌10min。用pbs充分透析，以除去游離的生物素；得到重組眼鏡蛇毒ngf抗原-生物素?？蓪⑸鲜鲋频脴悠芳尤?.5g/l疊氮鈉及1.0g/lbsa。將結(jié)合產(chǎn)物置4℃，避光保存。(4)重組眼鏡蛇毒ngf抗原免疫親和柱的制備稱取1.0g鏈親和素瓊脂糖凝膠，放入錐型瓶中，量取5ml結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)溶解鏈親和素瓊脂糖凝膠；室溫25℃攪拌混勻10min，逐滴加入用1ml結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)溶解的重組眼鏡蛇毒ngf抗原-生物素溶液(濃度為2mg/ml)進(jìn)行結(jié)合，攪拌反應(yīng)20～22h后，得到重組眼鏡蛇毒ngf抗原-生物素-鏈親和素瓊脂糖凝膠。將上述制備的重組眼鏡蛇毒ngf抗原-生物素-鏈親和素瓊脂糖凝膠(0.2ml)填充于固相萃取柱中，加入結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)進(jìn)行自然沉淀和洗滌，并保存于含0.02％疊氮鈉結(jié)合緩沖液中，得到ngf多克隆抗體免疫親和柱，于4℃保存待用。多克隆抗體抗血清的制備用1ml的弗氏完全佐劑(sigma–aldrichinc.)分別溶解500μg純化的重組眼鏡蛇毒ngf，充分混合后通過背部皮下多點(diǎn)注射的方法分別注射到新西蘭大白兔的皮下。在上述兔子首次免疫后的第14、28、42天時(shí)再分別用同樣的方式給兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫，此三次加強(qiáng)免疫抗原用弗氏不完全佐劑(sigma–aldrichinc.)溶解，且抗原的劑量減半。在最后一次加強(qiáng)免疫結(jié)束后的第七天將兔子麻醉后(3％戊巴比妥，靜脈注射1ml/kg)通過頸靜脈插管的方法獲取兔子血液，新鮮血液4℃過夜靜置后2000g離心30min得到含有ngf多克隆抗體的抗血清。采用間接酶聯(lián)免疫方法測定抗血清效價(jià)，抗血清效價(jià)達(dá)到160000以上。ngf多克隆抗體的純化在重組眼鏡蛇毒ngf抗原免疫親和柱中，使用結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)平衡5個(gè)柱體積，流速為80～120cm/h。將含有ngf多克隆抗體的抗血清緩慢上柱，流速為15～50cm/h，為保證抗原與多克隆抗體的充分結(jié)合，上樣后用結(jié)合緩沖液平衡10個(gè)柱體積以上，或平衡至基線，洗去雜質(zhì)，流速為80～120cm/h。使用洗脫緩沖液(80mm甘氨酸-鹽酸，ph2.5)洗10～20個(gè)柱體積，流速為100cm/h。收集的洗脫液調(diào)節(jié)ph值為5.5，在0～4℃的環(huán)境中放置10～15h，離心取沉淀，得到ngf多克隆抗體。洗脫后的柱子用結(jié)合緩沖液平衡，并保存于含0.02％疊氮鈉結(jié)合緩沖液中，或進(jìn)行下一次純化。ngf多克隆抗體免疫親和柱的制備(1)ngf多克隆抗體與生物素的偶聯(lián)將ngf多克隆抗體用0.1mmph8.0的碳酸氫鈉緩沖液稀釋到1mg/ml，用0.1mmph8.0碳酸氫鈉緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)充分透析。用1ml二甲基亞砜溶解生物素1mg。取1mlngf多克隆抗體溶液與120μl生物素溶液混合；在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2～4h。再加入9.6μl1mm氯化銨溶液，在室溫下攪拌10min。用pbs充分透析，以除去游離的生物素；得到ngf多克隆抗體-生物素?？蓪⑸鲜鲋频脴悠芳尤?.5g/l疊氮鈉及1.0g/lbsa。將結(jié)合產(chǎn)物置4℃，避光保存。(2)ngf多克隆抗體免疫親和柱的制備稱取1.0g鏈親和素瓊脂糖凝膠，放入錐型瓶中，量取5ml結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mmm氯化鈉，ph7.4)溶解鏈親和素瓊脂糖凝膠；室溫25℃攪拌混勻10min，逐滴加入用1ml結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)溶解的ngf多克隆抗體-生物素溶液(濃度為2mg/ml)進(jìn)行結(jié)合，攪拌反應(yīng)20-22h后，得到ngf多克隆抗體-生物素-鏈親和素瓊脂糖凝膠。將上述制備的ngf多克隆抗體-生物素-鏈親和素瓊脂糖凝膠(0.2ml)填充于固相萃取柱中，加入結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)進(jìn)行自然沉淀和洗滌，并保存于含0.02％疊氮鈉結(jié)合緩沖液中，得到ngf多克隆抗體免疫親和柱，于4℃保存待用。眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子ngf的純化眼鏡蛇毒預(yù)處理：將蛇毒溶液加入結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉)調(diào)節(jié)ph值為6.8-7.2，加40-50％硫酸銨，在0～4℃的環(huán)境中放置10～15h，離心取沉淀，用超純水復(fù)溶后離心并棄沉淀。將上清用結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)稀釋(v/v1:5)，制得濃度為2mg/ml的眼鏡蛇毒上樣液待用。在ngf多克隆抗體免疫親和柱中，使用結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)平衡5個(gè)柱體積，流速為80～120cm/h。將預(yù)處理后的眼鏡蛇毒上樣液緩慢上柱，流速為15～50cm/h，為保證抗原與多克隆抗體的充分結(jié)合，上樣后用結(jié)合緩沖液平衡10個(gè)柱體積以上，或平衡至基線，洗去雜質(zhì)，流速為80～120cm/h。使用洗脫緩沖液(100mm甘氨酸-鹽酸，ph3.0)洗10～20個(gè)柱體積，流速為100cm/h。收集洗脫液并用50mmtris-hclph8.0緩沖液稀釋5倍，備用。將重組眼鏡蛇毒ngf通過上述的ngf多克隆抗體免疫親和柱，亦能有效的富集純化重組眼鏡蛇毒ngf。洗脫后的柱子用結(jié)合緩沖液平衡，并保存于含0.02％疊氮鈉結(jié)合緩沖液中，或進(jìn)行下一次純化。最后運(yùn)用蛋白全自動(dòng)純化系統(tǒng)進(jìn)行最終純化得到純度≥98％的ngf。具體操作：緩沖液a液為50mmtris-hclph8.0，b液為1mnac、l50mmtris-hclph8.0；純化柱為ge公司的monoq；洗浴程序?yàn)?-30分鐘，nacl濃度變化0-0.6m。ngf洗脫時(shí)間為21.5分鐘。重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱的柱容量的測定：取1g重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱用結(jié)合緩沖液沖洗，將10ml結(jié)合緩沖液溶解的ngf多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為50ng/ml，ngf多克隆抗體的含量總計(jì)為500ng)過柱，用10個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)沖洗柱子去除未結(jié)合的ngf多克隆抗體，最后用10個(gè)柱體積洗脫緩沖液(80mm甘氨酸-鹽酸，ph2.5)，1ml/管分管收集，用hplc檢測洗脫液中ngf多克隆抗體含量。結(jié)果表明，1g重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱的柱容量為220～250ng。hplc的檢測方法：采用waters公司的2695液相色譜系統(tǒng)、2487紫外檢測儀，色譜柱為tosoh的tskg3000swxl(7.8mm×30cm),流動(dòng)相為0.25mol/l磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸氫二鈉54.65g、磷酸二氫鈉15.25g、氯化鈉8.5g溶解于1l水中，ph6.8),流動(dòng)相的流速為0.8ml/min,進(jìn)樣體積20μl,檢測波長214nm。采集后用empower2對(duì)各譜圖進(jìn)行積分及分析。重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱的加標(biāo)回收率的測定：取20ml不含ngf多克隆抗體的血清置于50ml離心管中，分別加入ngf多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度至2、10、20μg/kg，加入20ml結(jié)合緩沖液振蕩10min得到樣品提取液待用。取1g重組眼鏡蛇毒ngf抗原親和柱用10個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液洗脫，分別加入10ml樣品提取液，用10個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液(50mm磷酸二氫鈉，150mm氯化鈉，ph8.0)洗脫，最后用10個(gè)柱體積洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液用hplc上機(jī)檢測ngf多克隆抗體含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，血液中的多克隆抗體ngf的回收率都在92～97％之間，rsd(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)均小于6％，其結(jié)果表明：本發(fā)明的方法滿足抗血清中ngf多克隆抗體的純化。ngf多克隆抗體免疫親和柱的柱容量的測定：取1gngf多克隆抗體免疫親和柱用結(jié)合緩沖液沖洗，將10ml結(jié)合緩沖液溶解的ngf標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為50ng/ml，ngf多克隆抗體的含量總計(jì)為500ng)過柱，用結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)沖洗柱子去除未結(jié)合的ngf，平衡10個(gè)柱體積，最后用10個(gè)柱體積洗脫緩沖液(100mm甘氨酸-鹽酸，ph3.0)，1ml/管分管收集，用hplc檢測洗脫液中ngf的含量。結(jié)果表明，1gngf多克隆抗體免疫親和柱的柱容量為240～260ng。ngf多克隆抗體免疫親和柱的加標(biāo)回收率的測定：取20ml不含ngf的蛇毒置于50ml離心管中，分別加入ngf多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度至2、10、20μg/kg，加入20ml結(jié)合緩沖液振蕩10min得到樣品提取液待用。將1gngf多克隆抗體免疫親和柱用10ml結(jié)合緩沖液洗脫，分別加入10ml樣品提取液，用10個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液(20mm磷酸二氫鈉，100mm氯化鈉，ph7.4)洗脫，最后用10個(gè)柱體積洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液用hplc上機(jī)檢測ngf含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行5次，蛇毒中的ngf的回收率都在94～99％之間，rsd(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)均小于4％，其結(jié)果表明：本發(fā)明的方法滿足蛇毒中ngf的純化。純化眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子ngf的生物學(xué)活性測試(1)測試樣品：將眼鏡蛇ngf基因(seqidno:1所示的核苷酸序列，用核酸內(nèi)切酶ecori和hindiii酶切，用凝膠回收試劑盒回收ngf基因片段酶切產(chǎn)物，同時(shí)用ecori和hindiii酶切原核表達(dá)載體pet-32a，將酶切后的基因片段和載體通過t4dna連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-32a-ngf；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pet-32a-ngf分別轉(zhuǎn)化入①大腸桿菌jm101、②大腸桿菌bl21、③大腸桿菌jm83、④大腸桿菌ed8767構(gòu)建表達(dá)ngf蛋白的重組菌株；并將上述重組菌株獲得的重組眼鏡蛇毒純化后作為免疫原，免疫家兔獲得ngf多克隆抗體并按上述方法分別制作多克隆抗體免疫柱。蛇毒預(yù)處理后，分別通過以上的多克隆抗體柱，進(jìn)行眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子ngf的富集和蛋白全自動(dòng)純化系統(tǒng)純化，得到測試樣品。(2)活性測試的方法：用1ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的rpmi1640)溶解各測試樣品，使測試樣品的起始濃度為250u/ml,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至起始濃度，在96空板中倍比稀釋，完成稀釋后50ul/孔轉(zhuǎn)移至新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。tf1細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基假加入10ng/mlgm-csf)培養(yǎng)24-48h，收獲細(xì)胞，1000rpm離心5min，細(xì)胞沉淀用rpmi1640清洗，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，50ul/孔加入已加有不同濃度ngf的96孔板中,37℃、5％co2條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入mtt染色液20ul/孔，37℃放置5h后，加入mtt裂解液(異丙醇450ml，sds2.5mg,濃鹽酸25μmol/l，補(bǔ)水至500ml)100ul/孔，吹打使其完全溶解，放入酶標(biāo)儀，以630nm為參比波長，記錄測定結(jié)果，結(jié)果取2個(gè)復(fù)孔的平取值，并進(jìn)行樣品活性測試。其中樣品的生物學(xué)活性與其蛋白濃度之比為其比活性。(3)純度檢測方法：ngf標(biāo)準(zhǔn)品為本公司純化備用，采用waters公司的2695液相色譜系統(tǒng)、2487紫外檢測儀，色譜柱為tosoh的tskg3000swxl(7.8mm×30cm),流動(dòng)相為0.25mol/l磷酸鹽緩沖液,流動(dòng)相的流速為0.8ml/min,進(jìn)樣體積20μl,檢測波長214nm。采集后用empower2對(duì)各譜圖進(jìn)行積分及分析。表1.不同菌株表達(dá)蛋白獲得的多克隆抗體免疫親和柱得到的蛇毒ngf的活性測試測試樣品比活性(103u/mg)純度①大腸桿菌jm10114.898％②大腸桿菌bl216.260％③大腸桿菌jm838.671％④大腸桿菌ed87675.056％ngf標(biāo)準(zhǔn)品15.0100％通過上表說明，菌株選擇對(duì)眼鏡蛇毒ngf基因的重組表達(dá)具有關(guān)鍵性作用，眼鏡蛇毒ngf蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)主要通過菌種內(nèi)部的生物化學(xué)修飾，使其獲得不同的立體構(gòu)型，從而具有不同的生物活性。本申請(qǐng)中通過大腸桿菌菌株jm101表達(dá)獲得與天然結(jié)構(gòu)相似的重組蛋白,同時(shí)免疫動(dòng)物獲得的多克隆抗體能與天然眼鏡蛇毒ngf有效的進(jìn)行結(jié)合，特異性高。將其制備的多克隆抗體免疫親和柱與蛇毒進(jìn)行分離，能對(duì)眼鏡蛇毒ngf高效結(jié)合，使其得到高純度、高活性的眼鏡蛇毒ngf。sequencelisting<110>奔馳生物科技（云南）有限公司<120>應(yīng)用多克隆抗體親和柱純化眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的方法<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>366<212>dna<213>najaatra<220><221>ngf-conding-dna<222>(12)..(355)<400>1cggaattcatggaagatcatcctgtgcataacctaggggaacattctgtg50tgtgacagtgtcagtgcctgggttaccaaaactaccgcaacagacatcaa100aggcaatacggtgactgtgatggaaaatgtaaatcttgataacaaagtct150acaagcagtacttctttgaaaccaagtgcaaaaatccaaatccagaaccg200agtggttgcaggggcattgattccagccattggaattcttattgtaccac250aacagacacatttatcaaggcattaaccatggaaggcaatcaggcatcct300ggcgcttcatccggattgaaactgcctgtgtgtgtgtaatcactaaaaaa350aaaggaaaaagcttgg366<210>2<211>117<212>prt<213>najaatra<220><221>ngf-protein<222>(1)..(117)<400>1edhpvhnlgehsvcdsvsawvtkttatdik30gentvtvmenvnldnkvykeyffetkcknp60npepsgcrgidsshwnsyctetdtfikalt90megnqaswrfiridtacvcvitkktgn117當(dāng)前第1頁12