本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體的說，涉及一種玉米發(fā)育調(diào)控蛋白zmbhlh-4、編碼基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)錄因子在高等植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及響應(yīng)生物和非生物脅迫等環(huán)境反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。植物轉(zhuǎn)錄因子家族眾多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且數(shù)目也在不斷的增加，表明了高等植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性同時(shí)也體現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子研究的重要性。研究植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)功能，為作物性狀的改良提供了重要的理論基礎(chǔ)。以此利用這些轉(zhuǎn)錄因子在遺傳改良過程中改進(jìn)作物的性狀。

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，可以直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，從而參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)，廣泛參與植物低溫、干旱、高鹽、抗病等逆境的應(yīng)答以及植物生長發(fā)育。目前對(duì)植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能的研究已成為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。根據(jù)planttranscriptionfactordatabase(planttfdb)，玉米中有56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。

其中bhlh(basic/helix-loop-helix)家族是一類大家族，都包含bhlh結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)不同的保守區(qū)域組成，n端的堿性區(qū)域與下游啟動(dòng)子區(qū)核心序列e-box(canntg)結(jié)合，c端的螺旋環(huán)螺旋區(qū)域負(fù)責(zé)形成同源或者異源二聚體，bhlh家族成員主要以二聚體的形式來行使功能。目前，玉米中共有308個(gè)bhlh家族成員。

bhlh類轉(zhuǎn)錄因子在真核生物的整個(gè)生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，如毛狀體的發(fā)生、種子的發(fā)育、光形態(tài)建成和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花器官發(fā)育、 氣孔開關(guān)、激素應(yīng)答、金屬離子體內(nèi)平衡、類黃酮和花青素合成等，該家族成員還參與植物響應(yīng)逆境脅迫。例如玉米bhlh家族r1蛋白既能促進(jìn)葉片毛狀體以及根毛的分化又是花青素合成所必須的，r1蛋白連接r2r3-myb蛋白和wd40蛋白，并通過myb-bhlh的相互作用招募未知因子，共同啟動(dòng)花青素合成基因的轉(zhuǎn)錄(ramsayandglover2005)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從玉米中分離一種參與植物生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其編碼基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究，表明該基因參與種子萌發(fā)，葉片生長及分枝發(fā)育，在調(diào)控植物生長發(fā)育方面具有重要應(yīng)用前景。

本發(fā)明所提供的蛋白，名稱為zmbhlh-4，來源于玉米b73，屬bhlh類轉(zhuǎn)錄因子。

本發(fā)明采用cdna文庫pcr擴(kuò)增的方法，獲得了zmbhlh-4基因的cds序列。zmbhlh-4基因的全長cdna序列包含1642bp，cds序列1080bp(序列1)，編碼359個(gè)氨基酸的蛋白(序列2)。

本發(fā)明所克隆的zmbhlh-4基因產(chǎn)物在細(xì)胞核中表達(dá)(圖1)。

本發(fā)明把zmbhlh-4基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，啟動(dòng)子為ubiqutin，得到過表達(dá)載體質(zhì)粒(圖2)，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105中，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。把轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因的野生型植株在正常生長條件下進(jìn)行比較，結(jié)果表明，zmbhlh-4的過表達(dá)可促進(jìn)植物種子的萌發(fā)、早期葉片生長及分枝形成(圖3，圖4，圖5，圖6，圖7)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。附圖中：

圖1為zmbhlh-4蛋白的亞細(xì)胞定位圖；

圖2為zmbhlh-4過表達(dá)載體圖譜；

圖3為zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)圖；

圖4為zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表型圖；

圖5為zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型圖；

圖6為擬南芥植株分支數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；

圖7為擬南芥植株株高統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

實(shí)施例1玉米zmbhlh-4基因cdna的克隆

以玉米b73的cdna文庫為模板進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，pcr引物如下：

zmbhlh-4fw：

5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatatggcgccactctcc-3'；

zmsoc1rv：

5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaaagctccgtctttagcttg-3'。

擴(kuò)增條件是：

擴(kuò)增出dna片段從瓊脂糖膠中回收，利用gateway重組系統(tǒng)的bp反應(yīng)將pcr產(chǎn)物重組到pdonr221載體，轉(zhuǎn)化e.coli，酶切鑒定后測(cè)序。得到cds為序列1所示的基因，將該基因命名為zmbhlh-4，全長1080bp，具體序列如下：

atggcgccactctcccctacccccgcctccgcctctgctcccgtgtcctcctcccctc gttccctcgtcccggacgcctccgccgcgccgatgcgccccgcctcgccgccgcaggagctccccgccgccgggggcgagatccaggcggcgctggcccctgccaatgcctccaccgcgggcgcccgcggaggcggaggctccttcacggcgctgctgggactccccacctcgcaggccatggagctgctcctcccccgcacgacgccccccgccctagccacagcgcccgcgccaaccttcccctccgacccgcacctcgtggaccgcgccgcgcgcttatccacgttcgcgcccccgtccccgtccccatcctccacgtccccggcccggcccctccccgccgccgctaacgccggcaagcgcaaggccgaccccgtcgaccgtgcctccaaggggaaggcggcgaagaaggggaagacggcggaggagaagctcgcgggcggcgacggcgacgacgagaagccggcgtacgtgcacgtgcgggccaggcggggccaggccacggacagccacagcctcgccgagcgggcgagacgcgagaagatcaatgcgaggatggagctgctcaaggagctggtccccggctgcagtaaggtatcaggaacagcattggtgctagatgagatcatcaatcatgttcagtctctccaaaggcaagttgagtacttgtcaatgaggctcgcagctgtaaacccaagggtcgattttggtgggctagacagctttctgaccacagagtgtggaaggatagcaggcttcaactgcaagaacggaatcgacttggagcaggtaacctggccagaaatgggtgttcatggagcaaggcagctgatgcaacttcaacagcagttctggcatggcgatttaacacatccacaccaagtggcttcacagtgggaaaagcgtggggatggccatcctcccgtctttagcaactccagtccctctctcttcggctatgatctaacaagctctggagcccagcaaaccccggcgagcaagctaaagacggagctttga

其編碼的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，編碼359個(gè)氨基酸(末端終止子未計(jì)入，即序列中***號(hào)未計(jì)入)，其編碼的蛋白的氨基酸序列如下：

實(shí)施例2玉米中zmbhlh-4亞細(xì)胞定位分析

轉(zhuǎn)錄因子的特征之一是定位于細(xì)胞核中，并在細(xì)胞核中執(zhí)行其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。為此，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法在原生質(zhì)體中對(duì)玉米zmbhlh-4蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。

2.1載體構(gòu)建：

利用gateway的lr反應(yīng)將pdonr221載體上的zmbhlh-4重組到pk7wfg2載體，與gfp形成融合蛋白，由35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。

2.2玉米葉片原生質(zhì)體的制備：

取三葉一芯期b73玉米的黃化苗，用刀片切成0.5mm寬的葉條。將切好的葉條放入預(yù)先配置好的酶解液(1.5％cellulaser10,0.4％macerozymer10,0.4mmannitol,20mmkcl,20mmmes,ph5.7,10mmcacl2,and0.1％bsa)中。用鑷子幫助使葉子完全浸入酶解液，50轉(zhuǎn)/分鐘條件下酶解5h。

2.3原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：

1)100g離心10分鐘使原生質(zhì)體沉淀在管底，然后用適量mmg溶液(0.4mmannitol,15mmmgcl2,and4mmmes,ph5.7)重懸原生質(zhì)體，使之最終濃度在2×10⁵個(gè)/ml；

2)每100μl原生質(zhì)體加入10μldna(10微克約5-10kb的質(zhì)粒dna)至2ml離心管中，輕柔混合；

3)加入等體積110μlpeg溶液(30％peg[v/v],0.2mmannitol,and0.1mcacl2)，輕柔拍打離心管完全混合。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物10分鐘；

4)100g離心2分鐘去上清后，用1mlwi溶液(0.5mmannitol,20mmkcl，4mmmes,ph5.7)輕柔重懸原生質(zhì)體；

5)室溫下(20-25℃)誘導(dǎo)原生質(zhì)體14小時(shí)以上。以上所有操作在室溫下進(jìn)行。

2.4gfp表達(dá)情況觀察：

在激光共聚焦顯微鏡下觀察gfp表達(dá)，圖1示出了zmbhlh-4蛋白的亞細(xì)胞定位圖，pcambia1302為空載體對(duì)照；zmbhlh-4為zmbhlh-4:gfp融合蛋白。結(jié)果表明zmbhlh-4:gfp(綠色熒光蛋白)的顯示位置與細(xì)胞核染料hochest的染色結(jié)果重疊，說明zmbhlh-4定位于細(xì)胞核中。

實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

3.1載體構(gòu)建：

利用gateway的lr反應(yīng)直接將pdonr221載體上的zmbhlh-4重組到植物表達(dá)載體pgwcvp64。轉(zhuǎn)化e.coli，酶切鑒定后測(cè)序。獲得pgwcvp64-zmbhlh-4質(zhì)粒如圖2所示，該質(zhì)粒中，lb、rb為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的左右邊界序列；bar為抗草銨膦基因；camv35s為啟動(dòng)子；pubi為玉米泛素啟動(dòng)子；attb1、attb2為重組位點(diǎn)；zmbhlh-4為目的基因；vp64為激活標(biāo)簽。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌eha105中。

3.2擬南芥轉(zhuǎn)化：

1)挑取陽性的農(nóng)桿菌單菌落，接種于5ml的lb液體培養(yǎng)基(kan50mg/l，rif50mg/l)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約20h；

2)將活化的菌液1:500轉(zhuǎn)接入含200ml的yep培養(yǎng)基(kan50mg/l，rif50mg/l)的500ml錐形瓶中，28℃，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)約14h；至od600＝1.5～3.0時(shí)即可。

3)4℃，5000rpm離心10min，收集菌體，棄上清；

4)加入2倍體積10％蔗糖(含0.02％silwetl-77)，將菌體充 分懸浮。

5)轉(zhuǎn)化前剪去擬南芥中已經(jīng)長出的小果莢，將菌液置于于大培養(yǎng)皿中，花浸泡在菌液中約40s后取出，用吸水紙將殘余菌液吸去，將浸染后的擬南芥倒置避光培養(yǎng)24h后正常培養(yǎng)，收集種子。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選和pcr檢測(cè)

4.1轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選和pcr檢測(cè)：

將收集到的t0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子消毒后，播種在1/2ms培養(yǎng)基上(含bar20mg/l)，春化3天,放置于培養(yǎng)箱(22℃，光照16小時(shí)；18℃，暗8小時(shí))中培養(yǎng)。約7天后在bar抗性培養(yǎng)板上出現(xiàn)黃化苗和綠苗，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為bar抗性，呈正常綠色，非轉(zhuǎn)基因植株呈黃色。將綠苗移至1/2ms培養(yǎng)板上5天恢復(fù)生長后，轉(zhuǎn)移至土中。當(dāng)轉(zhuǎn)移至土中的苗長至10-12片葉子時(shí)，提取基因組dna，進(jìn)行pcr鑒定。

4.2擬南芥基因組的提?。?/p>

1)擬南芥苗生長到10-12片葉子時(shí)可剪取葉片，置于1.5ml離心管中，加入適量液氮，用預(yù)冷的玻璃研磨棒將其研磨成粉末，加入700μl的dna提取液(100mmnacl,100mmtris-hcl,ph8.5,50mmedta,1％sds)，60℃水浴30min；

2)加入200μl酚:氯仿(1:1)混勻后，4℃，12000rpm離心10min。

3)轉(zhuǎn)移上清600μl，加入600μl異丙醇后混勻充分，-20℃放置15-20min。

4)4℃，12000rpm，15min離心后棄上清，75％乙醇洗滌dna。

5)加入30μl超純水(內(nèi)含無dna酶的20μg/ml胰rna酶)，37℃放置30min去除rna后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.3pcr鑒定：

1)引物序列：

zmbhlh-4-704fw:5'–cacagagtgtggaaggatagc-3'；

rvvp64-104：5'-agcatcagatcccaacatg-3'。

2)反應(yīng)體系如下：

加水到20μl。

3)pcr擴(kuò)增條件：

共獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系20株，取其中具有代表性的3個(gè)株系(zmbhlh-4-1、zmbhlh-4-2、zmbhlh-4-3)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例5過表達(dá)zmbhlh-4基因的擬南芥株系表型分析

5.1過表達(dá)zmbhlh-4擬南芥種子的萌發(fā)：

將過表達(dá)zmbhlh-4擬南芥的種子消毒后播種在1/2ms培養(yǎng)基上，4℃暗處理三天后，光照培養(yǎng)，并在不同時(shí)間點(diǎn)統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。以種子露白為萌發(fā)標(biāo)志，每次每株系使用30顆種子，重復(fù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖3示出了zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)結(jié)果；如圖3所示，三個(gè)過表達(dá)zmbhlh-4擬南芥株系正常生長條件下種子萌發(fā)均早于野生型，說明在擬南芥中過表達(dá)zmbhlh-4可以促進(jìn)種子的萌發(fā)。

5.2轉(zhuǎn)zmbhlh-4擬南芥的蓮座葉片：

選取三個(gè)過表達(dá)zmbhlh-4擬南芥株系，觀察它們與野生型植株在生長 4周和8周時(shí)的蓮座葉形態(tài)。圖4示出了zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表型結(jié)果圖，結(jié)果表明過表達(dá)zmbhlh-4的三個(gè)株系葉片長寬比顯著增大。

5.3過表達(dá)bhlh-4擬南芥的株型觀察：

統(tǒng)計(jì)正常生長八周的過表達(dá)zmbhlh-4蓮座上的花莖分支數(shù)及株高。每個(gè)株系統(tǒng)計(jì)20株。圖5為zmbhlh-4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型圖；圖6為擬南芥植株分支數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，圖7為擬南芥植株株高統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果表明與野生型相比過表達(dá)zmbhlh-4植株矮化明顯，分支數(shù)增多，花莖出現(xiàn)二次或者多次分支，葉片數(shù)也顯著增加。

顯然，上面描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。