本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中抗鎘相關(guān)蛋白在調(diào)控植物的抗鎘性及對(duì)鎘的積累中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前重金屬污染日益嚴(yán)重。重金屬具有生物累積性，其污染很難自然降解，如鉛、鎘等重金屬進(jìn)入土壤環(huán)境，會(huì)長(zhǎng)期蓄積并破壞土壤的自凈能力，使土壤成為污染物的“儲(chǔ)存庫(kù)”。自然界中的重金屬通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類(lèi)的生命安全造成威脅。鎘不是生物體的必需元素，對(duì)動(dòng)物和植物的危害都很大。鎘在植物體內(nèi)積累可影響植物的光合作用、呼吸作用、氣體交換、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、抗氧化系統(tǒng)等，從而造成植物葉片皺縮失綠，根部褐化，生長(zhǎng)停滯，最后使植物凋亡。葉綠體是鎘敏感的細(xì)胞器之一。在鎘脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)、光合作用、電子傳遞鏈以及參與光合作用的酶都會(huì)受到傷害，從而產(chǎn)生活性氧反應(yīng)(ros)，光合速率降低等不良反應(yīng)。植物修復(fù)是一種具有成本低，處理設(shè)施簡(jiǎn)單，適合大規(guī)模應(yīng)用，利于土壤生態(tài)系統(tǒng)保持，對(duì)環(huán)境擾動(dòng)小等特點(diǎn)的綠色修復(fù)方式。隨著分子生物學(xué)和應(yīng)用遺傳工程的發(fā)展，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物修復(fù)效率成為植物修復(fù)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高植物的抗鎘性及對(duì)鎘的積累量。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了抗鎘相關(guān)蛋白在下述a1)、a2)、a3)或a4)中的應(yīng)用：a1)調(diào)控植物的抗鎘性；a2)調(diào)控植物對(duì)鎘的積累；a3)培育抗鎘性增強(qiáng)的植物；a4)培育對(duì)鎘的積累量增高的植物；所述抗鎘相關(guān)蛋白，其名稱(chēng)為crrp，是如下a1)、a2)、a3)、a4)、a5)或a6)：a1)氨基酸序列為序列1的第1-227位的蛋白質(zhì)；a2)氨基酸序列為序列1的第81-474位的蛋白質(zhì)；a3)氨基酸序列為序列1的第81-227位的蛋白質(zhì)；a4)氨基酸序列為序列1的蛋白質(zhì)；a5)在a1)、a2)、a3)或a4)的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的具有相同功能的由a1)、a2)、a3)或a4)衍生的蛋白質(zhì)；a6)在a1)、a2)、a3)、a4)或a5)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。其中，序列1由474個(gè)氨基酸殘基組成。序列1的第236-474位為gfp的序列。為了使a1)、a2)、a3)、a4)或a5)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在a1)、a2)、a3)、a4)或a5)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。表、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述crrp可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述crrp的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2的第1-681位、序列2的第241-1425位、序列2的第241-681位或序列2所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上上表所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。其中序列2所示的dna片段編碼序列1所示的蛋白質(zhì)。上述應(yīng)用中，所述植物可為雙子葉植物(如擬南芥)或單子葉植物。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了與crrp相關(guān)的生物材料在所述a1)、所述a2)、所述a3)或所述a4)中的應(yīng)用；所述生物材料為下述b1)至b14)中的任一種：b1)編碼crrp的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體；b4)含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；b5)含有b1)所述核酸分子的重組微生物；b6)含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物；b7)含有b3)所述重組載體的重組微生物；b8)含有b4)所述重組載體的重組微生物；b9)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；b10)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；b11)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；b12)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；b13)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；b14)含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。上述應(yīng)用中，b1)所述核酸分子為如下b1)、b2)、b3)、b4)、b5)或b6)：b1)核苷酸序列是序列2的第1-681位的cdna分子或dna分子；b2)核苷酸序列是序列2的第241-1425位的cdna分子或dna分子；b3)核苷酸序列是序列2的第241-681位的cdna分子或dna分子；b4)核苷酸序列是序列2的cdna分子或dna分子；b5)與b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼crrp的cdna分子或基因組dna分子；b6)在嚴(yán)格條件下與b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼crrp的cdna分子或基因組dna分子。其中，序列2由1425個(gè)核苷酸組成，編碼序列1所示的蛋白質(zhì)。序列2的第1-240位編碼序列1的第1-80位的蛋白質(zhì)(將其命名為tp)，序列2的第241-681位編碼序列1的第81-227位的蛋白質(zhì)，序列2的第682-705位編碼序列1的第228-235位的gfp，序列2的第706-1425位編碼序列1的第236-474位的gfp。上述應(yīng)用中，b2)所述表達(dá)盒中，b1)所述核酸分子的表達(dá)由序列3所示的dna分子或35s啟動(dòng)子啟動(dòng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼crrp的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的crrp的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼crrp且具有crrp功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列1的第1-227位、序列1的第81-474位、序列1的第81-227位或序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述應(yīng)用中，所述嚴(yán)格條件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述應(yīng)用中，b2)所述的含有編碼crrp的核酸分子的表達(dá)盒(crrp基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)crrp的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)crrp基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止crrp基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35s：來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(pr1)(由水楊酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羥酸s-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑ii啟動(dòng)子(pin2)或lap啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pf128(cn101063139b(中國(guó)專(zhuān)利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(nos終止子)、花椰菜花葉病毒camv35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子(參見(jiàn)，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將載體p35s::tp-crrp的hindⅲ和xbai識(shí)別位點(diǎn)間的dna片段替換為序列3所示的dna分子(cab2啟動(dòng)子)，得到重組載體，將該重組載體命名為pcab2::tp-crrp，pcab2::tp-crrp中cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)序列2所示的dna分子的表達(dá)，pcab2::tp-crrp表達(dá)序列1所示的蛋白質(zhì)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述crrp基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂堿合成酶基因nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子， 包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptii基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。所述農(nóng)桿菌可為農(nóng)桿菌c58。上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，crrp的編碼基因(即序列2的第241-681位所示的dna分子)通過(guò)含有crrp的編碼基因的表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌c58中。所述重組載體為用序列2的第241-681位所示的dna分子替換pcambia1301–n–gfp的xbai和kpni識(shí)別序列間的dna片段得到的重組載體p35s::crrp，p35s::crrp中35s啟動(dòng)序列2的第241-1425位所示的dna分子的表達(dá)，p35s::crrp表達(dá)序列1的第81-474位所示的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，crrp的編碼基因(即序列2的第1-681位所示的dna分子)通過(guò)含有crrp的編碼基因的表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌c58中。所述重組載體為用序列2的第1-681位所示的dna分子替換pcambia1301–n–gfp的xbai和kpni識(shí)別序列間的dna片段得到的重組載體p35s::tp-crrp，p35s::tp-crrp中35s啟動(dòng)序列2的第1-681位所示的dna分子的表達(dá)，p35s::tp-crrp表達(dá)序列1所示的蛋白質(zhì)。上述應(yīng)用中，所述植物可為雙子葉植物(如擬南芥)或單子葉植物。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述c1)或c2)的方法：c1)培育抗鎘性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：向受體植物中導(dǎo)入crrp的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗鎘性增強(qiáng)；c2)培育抗鎘性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：向受體植物中導(dǎo)入含有crrp 的編碼基因的表達(dá)盒得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗鎘性增強(qiáng)。上述方法中，所述crrp的編碼基因的編碼序列可為b1)所述核酸分子；所述表達(dá)盒中所述crrp的編碼基因的表達(dá)可由序列3所示的dna分子(cab2啟動(dòng)子)或35s啟動(dòng)子啟動(dòng)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述crrp的編碼基因通過(guò)含有crrp的編碼基因表達(dá)盒的crrp基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。上述方法中，其中所述crrp的編碼基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述crrp的編碼基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的gc含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中g(shù)c含量可為35％、多于45％、多于50％或多于約60％；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于camv的tml，來(lái)源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于tmv,mcmv和amv)。所述crrp基因重組表達(dá)載體可通過(guò)使用ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接dna轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition).)。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述crrp的編碼基因轉(zhuǎn)化目 的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。上述方法中，所述植物可為雙子葉植物(如擬南芥)或單子葉植物。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述d1)或d2)的方法：d1)培育對(duì)鎘的積累量增高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：向受體植物中導(dǎo)入crrp的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比鎘的積累量增高；d2)培育對(duì)鎘的積累量增高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：向受體植物中導(dǎo)入含有crrp的編碼基因的表達(dá)盒得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比鎘的積累量增高。上述方法中，所述crrp的編碼基因的編碼序列可為b1)所述核酸分子；所述表達(dá)盒中所述crrp的編碼基因的表達(dá)可由序列3所示的dna分子(cab2啟動(dòng)子)或35s啟動(dòng)子啟動(dòng)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述crrp的編碼基因通過(guò)含有crrp的編碼基因表達(dá)盒的crrp基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。上述方法中，其中所述crrp的編碼基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本發(fā)明所述crrp的編碼基因的氨基酸序列的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的gc含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中g(shù)c含量可為35％、多于45％、多于50％或多于約60％；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源 于camv的tml，來(lái)源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進(jìn)行連接；5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于tmv,mcmv和amv)。所述crrp基因重組表達(dá)載體可通過(guò)使用ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接dna轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition).)。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述crrp的編碼基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。上述方法中，所述植物可為雙子葉植物(如擬南芥)或單子葉植物。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了crrp或所述生物材料。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的抗鎘相關(guān)蛋白及其編碼基因(crrp基因)可以提高植物的抗鎘性，序列3所示的dna分子在作為啟動(dòng)子時(shí)(即cab2啟動(dòng)子)以及序列1的第1-80位所示的多肽可以進(jìn)一步提高植物對(duì)鎘的抗性：在cdcl2濃度為50μm時(shí)，轉(zhuǎn)crrp基因植株p35s::tp-crrp6和p35s::tp-crrp8以及cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的植株pcab2::tp-crrp1的根長(zhǎng)均顯著高于野生型的根長(zhǎng)，轉(zhuǎn)crrp基因且cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的植株pcab2::tp-crrp4的單株鮮重顯著高于野生型的單株鮮重；在cdcl2濃度為75μm時(shí)，轉(zhuǎn)crrp基因植株p35s::tp-crrp6和p35s::tp-crrp8以及cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的植株pcab2::tp-crrp4的根長(zhǎng)均顯著高于野生型的根長(zhǎng)，轉(zhuǎn)crrp基因植株p35s::crrp2、p35s::crrp8和p35s::tp-crrp8以及cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的植株pcab2::tp-crrp1和pcab2::tp-crrp4的單株鮮重均顯著高于野生型的單株鮮重；在cdcl2濃度為100μm時(shí)，轉(zhuǎn)crrp基因植株p35s::tp-crrp8和cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的植株pcab2::tp-crrp1的根長(zhǎng)均顯著高于野生型的根長(zhǎng)，轉(zhuǎn)crrp基因植株p35s::tp-crrp8的單株鮮重均顯著高于野生型的單株鮮重。在實(shí)際運(yùn)用中可以利用crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)、序列3所示的dna分子以及序列1的第1-80位所示的多肽調(diào)控植物對(duì)鎘的抗性，也可以選育抗鎘的植株。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的抗鎘相關(guān)蛋白及其編碼基因(crrp基因)可以提高植物的對(duì)鎘的積累量，序列3所示的dna分子在作為啟動(dòng)子時(shí)以及序列1的第1-80位所示的多肽可以進(jìn)一步提高植物對(duì)鎘的積累量：在cdcl2處理第7天，轉(zhuǎn)crrp基因植株以及 cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系根的鎘積累量均極顯著高于野生型；在cdcl2處理第16天，轉(zhuǎn)crrp基因植株以及cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株地上部分及根的鎘積累量均顯著高于野生型。而在cdcl2處理的第2天和第7天，轉(zhuǎn)crrp基因植株以及cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)crrp基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中鎘從根轉(zhuǎn)移至地上部分的轉(zhuǎn)移系數(shù)均極顯著小于野生型。在實(shí)際運(yùn)用中可以利用crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)、序列3所示的dna分子以及序列1的第1-80位所示的多肽調(diào)控野生型對(duì)鎘的積累，也可以選育對(duì)鎘的積累量高的植株。本發(fā)明的crrp基因可在葉綠體中表達(dá)，可利用crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)、序列3所示的dna分子以及序列1的第1-80位所示的多肽實(shí)現(xiàn)在重金屬污染的土壤上種植既能夠耐受重金屬脅迫又能夠富集重金屬離子的植物修復(fù)土壤，還可以獲得新型的用于土壤修復(fù)的植物品種。附圖說(shuō)明圖1為轉(zhuǎn)基因擬南芥在dna水平上的鑒定結(jié)果。其中，wt表示擬南芥哥倫比亞生態(tài)型,1-11為相應(yīng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的株系編號(hào)；a為轉(zhuǎn)空載體擬南芥(p35s::gfp)與野生型擬南芥(wt)的檢測(cè)結(jié)果，b為轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)結(jié)果。圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥在蛋白質(zhì)水平上的鑒定結(jié)果。其中，1-9為相應(yīng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的株系編號(hào)；a為轉(zhuǎn)空載體擬南芥(p35s::gfp)與野生型擬南芥(wt)的檢測(cè)結(jié)果，b為轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)結(jié)果。圖3為轉(zhuǎn)基因擬南芥中目的基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。其中a-g為p35s::cadr-gfp擬南芥的結(jié)果，a為整株擬南芥(gfp熒光)，b為葉表皮細(xì)胞(gfp熒光)，c為葉肉細(xì)胞(gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合)，d為下胚軸細(xì)胞(gfp熒光)，e為下胚軸細(xì)胞(gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合)，f為根毛(gfp熒光)，g為根尖(gfp熒光)；h-p為p35s::tp-cadr-gfp擬南芥的結(jié)果，h為整株擬南芥(gfp熒光)，i-k為葉肉細(xì)胞，i為gfp熒光，j為葉綠體自發(fā)熒光，k為gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合后的結(jié)果，l-n為下胚軸細(xì)胞，l為gfp熒光，m為葉綠體自發(fā)熒光，n為gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合后的結(jié)果，o根毛中質(zhì)體的gfp熒光為，p為根中質(zhì)體的gfp熒光；q-y為pcab2::tp-cadr-gfp擬南芥的結(jié)果，q為整株擬南芥(gfp熒光)，r-t為葉肉細(xì)胞，r為gfp熒光，s為葉綠體自發(fā)熒光，t為gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合后的結(jié)果，u-w為下胚軸細(xì)胞，u為gfp熒光，v為葉綠體自發(fā)熒光，w為gfp熒光與葉綠體自發(fā)熒光重合后的結(jié)果，x為gfp熒光通道與明場(chǎng)重合下的根毛，y為gfp熒光通道與明場(chǎng)重合下的根。圖4為不同cdcl2濃度的對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響。其中，wt表示轉(zhuǎn)空載體擬南芥，*表示與wt相比具有顯著性差異，**表示與wt相比具有極顯著差異；a為不同濃度下 各轉(zhuǎn)基因擬南芥株系外觀，b為不同濃度下各轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的根長(zhǎng)與單株鮮重。圖5為cdcl2處理不同時(shí)間各轉(zhuǎn)基因株系地上部分與根的鎘積累量與轉(zhuǎn)移系數(shù)。其中，wt表示轉(zhuǎn)空載體擬南芥，*表示與wt相比具有顯著性差異，**表示與wt相比具有極顯著差異，葉表示地上部分。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌c58(藺曉麗，根癌農(nóng)桿菌c58六型分泌系統(tǒng)關(guān)鍵組分clpv結(jié)構(gòu)和功能的初步研究，海南大學(xué)，2011年)公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(arabidopsisthalianaecotypecolumbia)：記載于“weichi,jinfangma,dongyuanzhang,etal.thepentratricopeptiderepeatproteindelayedgreening1isinvolvedintheregulationofearlychloroplastdevelopmentandchloroplastgeneexpressioninarabidopsis.plantphysiology,june2008,vol.147,pp.573-584.”一文中，公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得。下述實(shí)施例中的yeb液體培養(yǎng)基的配制方法為：將10g蛋白胨、10g酵母提取物和5gnacl用蒸餾水溶解，蒸餾水定容至1l，ph7.0，滅菌。yeb固體培養(yǎng)基為向yeb液體培養(yǎng)基中加入1.5％(1.5g/100ml)的瓊脂得到的無(wú)菌培養(yǎng)基，ph7.0。下述實(shí)施例中的0μm、25μm、50μm、75μm和100μmcdcl2固體培養(yǎng)基為向固體培養(yǎng)基中添加cdcl2得到的cdcl2濃度分別為0μm、25μm、50μm、75μm和100μm的培養(yǎng)基，其中，固體培養(yǎng)基為向1/2ms液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉和蔗糖得到的瓊脂粉和蔗糖的濃度均為1g/100ml的培養(yǎng)基。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建本發(fā)明提供了來(lái)源于惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)的抗鎘相關(guān)蛋白(crrp)，其氨基酸序列為序列1的第81-227位，crrp由序列2的第241-681位所示的抗鎘相關(guān)蛋白基因(crrp基因)編碼。一、重組載體及重組菌的制備將載體pcambia1301–n–gfp的xbai和kpni識(shí)別位點(diǎn)間的dna片段替換為序列2的第241-681位所示的crrp基因，得到重組載體，將該重組載體命名為 p35s::crrp，p35s::crrp中35s啟動(dòng)crrp基因的表達(dá)，p35s::crrp表達(dá)序列1的第81-474位所示的蛋白質(zhì)。其中，pcambia1301-n-gfp載體的制備方法如下：用hindiii和ecori雙酶切p221-gfp載體，回收大小為1460bp的目的條帶(含gfp的表達(dá)框)，將其與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pcambia1301載體的骨架片段相連，得到的重組載體命名為pcambia1301-n-gfp載體。其中，p221-gfp載體記載于“weichi,jinfangma,dongyuanzhang,etal.thepentratricopeptiderepeatproteindelayedgreening1isinvolvedintheregulationofearlychloroplastdevelopmentandchloroplastgeneexpressioninarabidopsis.plantphysiology,june2008,vol.147,pp.573-584.”一文中，公眾可從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得；pcambia1301載體為cambia公司產(chǎn)品。將載體pcambia1301–n–gfp的xbai和kpni識(shí)別位點(diǎn)間的dna片段替換為序列2的第1-681位所示的dna分子，得到重組載體，將該重組載體命名為p35s::tp-crrp，p35s::tp-crrp中35s啟動(dòng)序列2的第1-681位所示的dna分子的表達(dá)，p35s::tp-crrp表達(dá)序列1所示的蛋白質(zhì)。其中，序列2由1425個(gè)核苷酸組成，編碼序列1所示的蛋白質(zhì)。序列2的第1-240位編碼序列1的第1-80位的蛋白質(zhì)(將其命名為tp)，序列2的第241-681位編碼序列1的第81-227位的蛋白質(zhì)，序列2的第706-1425位編碼序列1的第236-474位的gfp。將載體p35s::tp-crrp的hindⅲ和xbai識(shí)別位點(diǎn)間的dna片段替換為序列3所示的dna分子(cab2啟動(dòng)子)，得到重組載體，將該重組載體命名為pcab2::tp-crrp，pcab2::tp-crrp中cab2啟動(dòng)子啟動(dòng)序列2所示的dna分子的表達(dá)，pcab2::tp-crrp表達(dá)序列1所示的蛋白質(zhì)。將p35s::crrp、p35s::tp-crrp、pcab2::tp-crrp和pcambia1301–n–gfp分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌c58中，分別得到含有p35s::crrp的重組菌、p35s::tp-crrp的重組菌、pcab2::tp-crrp的重組菌和pcambia1301–n–gfp的重組菌，將其分別命名為c58–p35s::crrp、c58–p35s::tp-crrp、c58–pcab2::tp-crrp和c58–pcambia1301–n–gfp。二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建1、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥①?gòu)膟eb固體培養(yǎng)基上挑取重組農(nóng)桿菌c58–p35s::crrp單克隆接種到10ml含相應(yīng)抗生素的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。②以1:50(體積比)的比例轉(zhuǎn)接到50ml新鮮的yeb液體培養(yǎng)基中，同樣條 件下培養(yǎng)至od600約為1.0左右，6000rpm，離心5min收集菌體，棄上清液，用濃度為5％(5g/100ml)的蔗糖水溶液重懸菌體，重復(fù)洗一遍。然后，用5％(5g/100ml)蔗糖水溶液將菌體重懸至od600為0.8，加入silwetl-77使其終濃度為0.03％(體積分?jǐn)?shù))，待用。擬南芥(arabidopsisthaliana)哥倫比亞生態(tài)型種子播種于裝有土壤(營(yíng)養(yǎng)土和蛭石以1:1的體積比混合)小盆中，置于培養(yǎng)室中生長(zhǎng)。擬南芥生長(zhǎng)條件均為22℃，相對(duì)濕度為60％-70％，16h光照，8h黑暗。約35d后，選已經(jīng)抽苔正在開(kāi)花的擬南芥，剪去角果，將整個(gè)花序浸泡在上述準(zhǔn)備的轉(zhuǎn)化液中，浸約15s左右。將農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥放于陰暗處保濕培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室中正常生長(zhǎng)。③為獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，可在一周后浸蘸第二次。將得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥命名為p35s::crrp-gfp擬南芥。2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗生素篩選①收獲成熟的t1代p35s::crrp擬南芥種子，經(jīng)過(guò)表面消毒滅菌，平鋪在含有40μg/ml潮霉素的固體培養(yǎng)基(該固體培養(yǎng)基為在1/2ms液體培養(yǎng)基中另加1％(1g/100ml)瓊脂粉，ph值為5.8)的平板上；②4℃低溫春化兩天后，置于光照培養(yǎng)箱避光生長(zhǎng)。條件為22℃，相對(duì)濕度為60％-70％，16h光照，8h黑暗；③4d后，觀察培養(yǎng)皿中擬南芥幼苗的胚軸。胚軸長(zhǎng)的即為抗潮霉素的陽(yáng)性植株t1代p35s::crrp擬南芥幼苗，移植到土壤中繼續(xù)培養(yǎng)。其中，1/2ms液體培養(yǎng)基的配方為500ml蒸餾水中加入1.11gms鹽(sigma-aldrich)，ph5.8。按照步驟1和2的方法，將c58–p35s::crrp分別替換為c58–p35s::tp-crrp、c58–pcab2::tp-crrp和c58–pcambia1301–n–gfp，其他步驟均不變，得到三種轉(zhuǎn)基因擬南芥，將其分別命名為p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥(p35s::gfp)。三、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定1、dna水平分別提取步驟二抗生素篩選后的p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥葉片基因組dna進(jìn)行鑒定，并用轉(zhuǎn)空載體擬南芥和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型作為對(duì)照。鑒定p35s::crrp-gfp擬南芥的正向引物為gctctagaatgaagatcggagaactggc(下劃線為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列)，反向引物為gcagtactcttgtacagctcgtccatgc(下劃線為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列)，鑒定p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥的正向引物為gctctagaatggcttcctctatgctctct(下劃線為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列)，反向引物為 gcagtactcttgtacagctcgtccatgc(下劃線為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列)，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)空載體擬南芥和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型中均不含有目的條帶，p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥均含有相應(yīng)的目的條帶。2、蛋白質(zhì)水平分別提取步驟二抗生素篩選后的p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥葉片總蛋白，利用western-blot在蛋白水平上進(jìn)行鑒定，并用轉(zhuǎn)空載體擬南芥和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型作為對(duì)照。用到的一抗均為gfp抗體(abmart，m20004s)，內(nèi)參為cbb，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)空載體擬南芥和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型中均未檢測(cè)到目的蛋白，除p35s::crrp-gfp擬南芥的編號(hào)為3的株系，其余p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥、pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥均有目的基因的表達(dá)。選取目的基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選取的株系為編號(hào)為2和8的p35s::crrp-gfp擬南芥(分別簡(jiǎn)稱(chēng)為p35s::crrp2和p35s::crrp8)，編號(hào)為6和8的p35s::tp-crrp-gfp擬南芥(分別簡(jiǎn)稱(chēng)為p35s::tp-crrp6和p35s::tp-crrp8)，編號(hào)為1和4的pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥(分別簡(jiǎn)稱(chēng)為pcab2::tp-crrp1和pcab2::tp-crrp4)。3、目的基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分別觀察步驟二抗生素篩選后的p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥和pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥中目的基因編碼蛋白質(zhì)的定位情況，結(jié)果如圖3所示，p35s::crrp-gfp擬南芥、p35s::tp-crrp-gfp擬南芥和pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥中目的基因在葉肉、葉表、下胚軸和根部的細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。p35s::tp-crrp-gfp擬南芥和pcab2::tp-crrp-gfp擬南芥中目的基因在葉綠體中有表達(dá)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鎘性鑒定按照如下方法鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鎘性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：分別在0μm、25μm、50μm、75μm和100μmcdcl2固體培養(yǎng)基中播種實(shí)施例1的p35s::crrp2、p35s::crrp8、p35s::tp-crrp6、p35s::tp-crrp8、pcab2::tp-crrp1和pcab2::tp-crrp4的種子，每個(gè)株系的種子均在上述五種培養(yǎng)基中進(jìn)行播種，每個(gè)培養(yǎng)基60粒種子，在8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗，25℃條件下進(jìn)行將培養(yǎng)基豎直放置進(jìn)行培養(yǎng)，將播種當(dāng)天記為處理第0天。將轉(zhuǎn)空載體擬南芥和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(wt)作為對(duì)照。在播種第10天統(tǒng)計(jì)各轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)(表1)與單株鮮重(表2)，結(jié)果如圖 4所示。用hsdturkey檢驗(yàn)方法在p<0.05和p<0.01水平上對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系與wt之間差異的顯著性進(jìn)行比較。表1、不同cdcl2濃度處理后的根長(zhǎng)(cm)表2、不同cdcl2濃度處理后的單株鮮重(mg/株)結(jié)果顯示，wt與轉(zhuǎn)空載體擬南芥在不同cdcl2濃度下的根長(zhǎng)與單株鮮重均無(wú)顯著差異。在cdcl2濃度為25μm時(shí)，各轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)均顯著高于wt的根長(zhǎng)，各轉(zhuǎn)基因的單株鮮重與wt均無(wú)顯著差異；在cdcl2濃度為50μm時(shí)，p35s::tp-crrp6、p35s::tp-crrp8和pcab2::tp-crrp1的根長(zhǎng)均顯著高于wt的根長(zhǎng)，pcab2::tp-crrp4的單株鮮重顯著高于wt的單株鮮重；在cdcl2濃度為75μm時(shí)，p35s::tp-crrp6、 p35s::tp-crrp8和pcab2::tp-crrp4的根長(zhǎng)均顯著高于wt的根長(zhǎng)，p35s::crrp2、p35s::crrp8、p35s::tp-crrp8、pcab2::tp-crrp1和pcab2::tp-crrp4的單株鮮重均顯著高于wt的單株鮮重；在cdcl2濃度為100μm時(shí)，p35s::tp-crrp8和pcab2::tp-crrp1的根長(zhǎng)均顯著高于wt的根長(zhǎng)，p35s::tp-crrp8的單株鮮重均顯著高于wt的單株鮮重。表明，crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)可以提高擬南芥對(duì)鎘的抗性，序列3所示的dna分子在作為啟動(dòng)子時(shí)可以進(jìn)一步提高擬南芥對(duì)鎘的抗性，序列1的第1-80位所示的多肽也可以進(jìn)一步可以提高擬南芥對(duì)鎘的抗性。在實(shí)際運(yùn)用中可以利用crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)、序列3所示的dna分子以及序列1的第1-80位所示的多肽調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鎘的抗性，也可以選育抗鎘的植株。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因擬南芥鎘積累的鑒定按照如下方法鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥的鎘積累，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：①將實(shí)施例1的p35s::crrp2、p35s::crrp8、p35s::tp-crrp6、p35s::tp-crrp8、pcab2::tp-crrp1和pcab2::tp-crrp4的種子分別在1/2ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d，轉(zhuǎn)移至水培營(yíng)養(yǎng)液(水培營(yíng)養(yǎng)液為由水和溶質(zhì)組成的液體，其中溶質(zhì)及其濃度分別為：1.5mmca(no3)2·4h2o,1.25mmkno3,0.75mmmgso4·7h2o,0.42mmkh2po4,38μmh3bo3,12μmmnso4·h2o,0.99μmznso4,0.69μmcuso4·5h2o,0.24μmna2moo4·2h2o,100μmna2sio3·5h2o,50μmnafeedta)中繼續(xù)培養(yǎng)，兩周后，將水培營(yíng)養(yǎng)液更換為cdcl2水培營(yíng)養(yǎng)液(cdcl2水培營(yíng)養(yǎng)液為向水培營(yíng)養(yǎng)液中添加cdcl2得到的cdcl2濃度為20μm的液體)，繼續(xù)培養(yǎng)，將更換為cdcl2水培營(yíng)養(yǎng)液的當(dāng)天記為培養(yǎng)第0天。②將培養(yǎng)第2天、培養(yǎng)第7天和培養(yǎng)第16天的擬南芥取出，依次用自來(lái)水和去離子水沖洗植株，然后分別收集地上部分和根部，80℃烘干至恒重。③材料稱(chēng)干重后，倒入消煮管中，加入6ml濃硝酸冷消化過(guò)夜。④第二天加入2ml30％(體積百分比濃度)的過(guò)氧化氫，靜置15min后，蓋上蓋子。用微波消解的方法對(duì)樣品進(jìn)行消煮。⑤消煮完全后，將液體從消煮管中轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至50ml，過(guò)濾。⑥用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(icp-oes)檢測(cè)植株中鎘離子積累量。按照上述方法，分別用和擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(wt)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。鑒定結(jié)果參看附圖5與表3，并計(jì)算轉(zhuǎn)移系數(shù)(表4)，轉(zhuǎn)移系數(shù)＝地上部分鎘含量/根中鎘含量，用hsdturkey檢驗(yàn)的方法在p<0.05和p<0.01水平上對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系與wt之間差異的顯著性進(jìn)行比較。表3、cdcl2處理不同時(shí)間后地上部分與根的鎘積累量(μg/g干重)表4、cdcl2處理不同時(shí)間后鎘的轉(zhuǎn)移系數(shù)結(jié)果顯示，wt與轉(zhuǎn)空載體擬南芥在cdcl2處理不同時(shí)間時(shí)，地上部分與根的鎘積累量以及轉(zhuǎn)移系數(shù)均無(wú)顯著差異。在cdcl2處理第2天，各轉(zhuǎn)基因株系地上部分的鎘積累量與wt均無(wú)顯著差異，除pcab2::tp-crrp4外，其余各轉(zhuǎn)基因株系根的鎘積累量均顯著高于wt；在cdcl2處理第7天，各轉(zhuǎn)基因株系地上部分的鎘積累量與wt均無(wú)顯著差異，各轉(zhuǎn)基因株系根的鎘積累量均極顯著高于wt；在cdcl2處理第16天，各轉(zhuǎn)基因株系地上部分及根的鎘積累量均顯著高于wt。而在cdcl2處理的第2天和第7天，各轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)移系數(shù)均極顯著小于wt。表明，crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)擬南芥對(duì)鎘的積累，序列3所示的dna分子在作為啟動(dòng)子時(shí)也可以促進(jìn)擬南芥對(duì)鎘的積累。在實(shí)際運(yùn)用中可以利用crrp基因及其編碼的蛋白質(zhì)、序列3所示的dna分子以及序列1的第1-80位所示的多肽調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鎘的積累，也可以選育對(duì)鎘的積累量高的植株。當(dāng)前第1頁(yè)12