本發(fā)明屬于腫瘤診斷和治療效果評估的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用一種血清和組織中的分子指標(biāo)pfn1蛋白(profilin1)中的表位肽制作特異抗體，然后利用這種抗體檢測血清中pfn1的含量，從而評估前列腺癌危險分級和治療效果。

背景技術(shù)：

在世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)生率是在男性腫瘤中排名第二，2012年就新增病例110萬，在中國，前列腺癌是排名第二的男性惡性腫瘤。而且在過去的二十多年，致死率增加了10倍。如何及早發(fā)現(xiàn)前列腺癌，并對前列腺癌的治療效果進行有效的評估是目前急需解決的問題。但目前的前列腺癌的危險分級是根據(jù)患者血清psa、gleason評分和臨床分期將前列腺癌分為低、中、高危三類，這種分級方法涉及三種指標(biāo)，其中的gleason評分和臨床分期指標(biāo)是根據(jù)腫瘤的形狀和邊界等多種形態(tài)來診斷，較難把握。更重要的目前還沒有關(guān)于前列腺癌治療效果評估的統(tǒng)一指標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一個血清分子指標(biāo)可以方便且精確地診斷前列腺癌的危險程度并可以用來評估前列腺癌的治療效果。

技術(shù)方案：

(1)本研究首先通過itraq檢測前列腺癌不同危險分期和治療不同階段的血清蛋白組表達變化，發(fā)現(xiàn)pfn1，在不同危險分期的前列腺癌中表達有重要差異(p＜0.001)，而且在重離子治療的不同階段，腫瘤癥狀好轉(zhuǎn)(基于腫瘤體積大小和病理指標(biāo))的過程中，該分子指標(biāo)的含量具有明顯的不同(p＜0.001)(表1和附圖1)。

表1四種片斷在不同危險分期的前列腺癌治療過程中的表達譜

(2)通過差異蛋白富集分析發(fā)現(xiàn)該分子通過肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(整合素信號通路的細胞膜內(nèi)部分)影響重離子治療的效果(附圖2)。

(3)通過生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法及b細胞表位分析方法，獲得四種肽表位序列(seqno.3、no.4、no5、no6)，通過混合酸酐法人工合成所需的肽，免疫動物產(chǎn)生抗pfn1蛋白表位的高親和性抗體。根據(jù)該抗體制作的診斷試劑，可以診斷前列腺癌的危險程度和治療療效(附圖3)。

本發(fā)明提供的血清分子指標(biāo)pfn1基因序列和氨基酸序列分別為seqno.1和seqno.2。

本發(fā)明提供的抗原表位肽是seqno.3、seqno.4、seqno5、seqno6(序列附件)，發(fā)現(xiàn)這四種肽能引起強烈免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體，可用于檢測pfn1的含量和存在。

本發(fā)明提供的是基于這四種表位肽序列及其所制備的特異性抗體生產(chǎn)診斷前列腺癌危險程度和治療療效的檢測試劑盒，該試劑盒能分辨低危，中危和高危前列腺癌病人(p＜0.05)以及前列腺癌治療效果(治療前和治療好轉(zhuǎn)的具有明顯的差異，p＜0.05)

附圖說明

圖1是四種蛋白片斷在不同危險分級前列腺癌病例中治療前中后的表達比較圖。

圖2是在kegg肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中差異表達基因(粉紅色)圖。試驗方法是itraq蛋白組表達測序。

圖3是通過四種表位肽制作的多克隆抗體監(jiān)測重離子治療前列腺癌療效圖。

具體實施方式

1.對外周血進行取樣。抽血后2小時內(nèi)馬上進行處理。

2.室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)取上清液

3.按1∶1-1∶500在150μl小試管中梯度稀釋待測

4.在96或48孔板上分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準品準確加樣50μl，待測樣品孔中測樣品50μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；標(biāo)準孔為分別加入一定濃度的各目標(biāo)靶蛋白和表位肽(序列為seqidno.2、no.3、no.4、no5、no6)；

5.溫育，配液，洗滌和加酶：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；將30倍(48t的20倍)濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；

6.顯色：每孔先加入顯色劑a50μl，再加入顯色劑b50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘；(k)終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)；

7.以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(od值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。以標(biāo)準物的濃度為橫坐標(biāo)，od值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準曲線，根據(jù)樣品的od值由標(biāo)準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準物的濃度與od值計算出標(biāo)準曲線的直線回歸方程式，將樣品的od值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

8.前列腺癌診斷指標(biāo)：以正常為對照，如果樣本濃度為正常的1.2-2倍，為低危病人；2-3倍，為中危病人；3倍以上即為高危病人。治療效果評估：中危和高危病人，如果治療后，樣本濃度回歸2倍以下，即為治療好轉(zhuǎn)。如回歸正常水平，即基本恢復(fù)。

序列表

seqno.1基因核苷酸序列，

cccgcagggtccacacgggtcgggccgggcgcgctcccgtgcagccggctccggccccgaccgccccatgcactcccggccccggcgcaggcgcaggcgcgggcacacgcgccgccgcccgccggtccttcccttcggcggaggtgggggaaggaggagtcatcccgtttaaccctgggctccccgaactctccttaatttgctaaatttgcagcttgctaatt

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于腫瘤診斷和治療療效和復(fù)發(fā)判斷的分子指標(biāo)技術(shù)領(lǐng)域，具體為應(yīng)用血清中與腫瘤密切相關(guān)的PFN1蛋白的表位肽制作特異抗體來特異檢測前列腺癌危險程度和治療療效的診斷試劑。本發(fā)明首先用iTRAQ大量檢測前列腺癌治療前后的血清蛋白地含量變化，發(fā)現(xiàn)PFN1蛋白與前列腺癌的危險分級和治療療效密切相關(guān)。然后篩選和人工合成PFN1中的功能表位肽，并以這些肽作為抗原免疫動物制作相應(yīng)抗體，得到的抗體可以較靈敏地檢測低危，中危和高危的前列腺癌病人，并對前列腺癌的療效及復(fù)發(fā)有較好地評估作用；該分子標(biāo)志物可用來作為檢測標(biāo)準對照和制備抗體用于生產(chǎn)相應(yīng)腫瘤診斷和研究試劑盒。

技術(shù)研發(fā)人員：朱嗣博;朱乃碩;謝君
受保護的技術(shù)使用者：朱嗣博;朱乃碩;謝君
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.31
技術(shù)公布日：2017.07.11