本申請要求2016年04月22號提交的名稱為“蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其用途”，申請?zhí)枮?01610251397.0的發(fā)明專利申請的優(yōu)先權(quán)。

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽的突變體及其用途，具體涉及蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其在制備多肽類殺蟲劑中的用途。

背景技術(shù)：

我國為農(nóng)業(yè)大國，害蟲種類繁多，嚴重威脅我國糧食和其它農(nóng)作物的產(chǎn)量。目前，我國的害蟲防治主要依賴于化學類農(nóng)藥(如有機磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類等)。這些農(nóng)藥的持續(xù)和大量的使用，一方面造成了害蟲耐藥性的日益增加；同時農(nóng)藥殘留對環(huán)境和人類健康造成影響。為了尋求高效低毒的害蟲防治措施，近幾年，殺蟲微生物，如白僵菌和綠僵菌正日益受到重視。與化學類農(nóng)藥相比，殺蟲微生物具有明顯的優(yōu)勢：1)物種選擇性高導(dǎo)致對人畜和自然環(huán)境安全無害；2)繁殖快，生產(chǎn)成本低；3)害蟲不易產(chǎn)生抗藥性；4)有自然傳播感染的能力，在環(huán)境中存活力強，可以長期壓低蟲口密度；5)害蟲不易產(chǎn)生抗藥性。盡管如此，微生物殺蟲劑也有兩個主要的缺點：1)殺蟲譜窄，只針對特定種類的害蟲；2)感染的潛伏期導(dǎo)致殺蟲效果慢，造成實質(zhì)性經(jīng)濟損失。

電壓門控鈉通道(voltage-gatedna⁺channel，nav)廣泛分布于昆蟲和哺乳動物的肌肉、神經(jīng)元、腺體、心肌的可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其活動與細胞的興奮、收縮、分泌和突觸傳遞等特異性功能密切相關(guān)，也是重要的藥物靶點。哺乳動物基因組編碼至少9個不同亞型的電壓門控鈉通道，分別命名為nav1.1-nav1.9。不同亞型的鈉通道分別在不同組織中表達。以人類為例，nav1.1，nav1.6和nav1.9主要在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)表達；nav1.2和nav1.3主要在大腦表達，nav1.4分布于骨骼肌；nav1.5分布于心肌；nav1.7和nav1.8主要分布于背根神經(jīng)節(jié)。這些鈉通道具有相似的結(jié)構(gòu)構(gòu)架，分成4個相似的結(jié)構(gòu)域(d1-d4)，每個結(jié)構(gòu)域由6個跨膜的α-螺旋(s1-s6)組成，前四個螺旋(s1-s4)為電壓感受器區(qū)，s5-s6為孔形成區(qū)。

蝎是一類有毒動物，以昆蟲和蜘蛛等小型節(jié)肢動物為食。條斑鉗蝎(mesobuthuseupeus)是一種小型的沙漠類蝎，主要分布在我國東北以及土耳其、伊朗、俄羅斯和蒙古等部分國家，以小型昆蟲(如蟋蟀和蟑螂)為食。毒液在蝎捕食和防御過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在大多數(shù)鉗蝎科(buthidae)毒液中存在蝎α-型神經(jīng)毒素，是這類蝎種主要的毒性成分。

條斑鉗蝎的α-型神經(jīng)毒素為一個多基因家族，由超過14個的毒素成員組成，這類毒素組成了一個進化上保守的多肽家族，由大約60-76個氨基酸組成，含有4對二硫鍵，屬于典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊構(gòu)架，靶向電壓門控鈉通道。蝎α-型神經(jīng)毒素為該家族的一個亞家族分支，其成員通過與鈉通道細胞外表面的受體位點3結(jié)合，延緩?fù)ǖ朗Щ钸^程并放大峰電流?；诙舅氐乃幚韺W特征和物種選擇性，α-型神經(jīng)毒素被分成3個功能組：1)經(jīng)典α-型神經(jīng)毒素；2)昆蟲α-型神經(jīng)毒素；3)α-like毒素。

研究表明，這類毒素能夠與獵物的電壓門控鈉通道的受體位點相互作用，修飾通道的門控特性(激活和失活)導(dǎo)致獵物軟癱和死亡。作為高親和性配體，這類毒素為研究鈉通道的結(jié)構(gòu)和藥理學功能提供了最佳的分子工具，并且由于其獨特的結(jié)構(gòu)特征，長期以來它一直是結(jié)構(gòu)生物學家用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理想模型；另外，由于其強的殺昆蟲毒性，這類毒素也被認為是設(shè)計肽類殺蟲劑的有效模板。特別是作為殺蟲微生物的增效劑具有誘人的前景。

但是，蝎鈉通道毒素特異性作用于哺乳動物、昆蟲和甲殼蟲動物神經(jīng)細胞的鈉通道，使動物出現(xiàn)神經(jīng)癥狀并導(dǎo)致死亡。進一步地，盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的α-型神經(jīng)毒素，并獲得了廣泛的藥理學和空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但是這類毒素的物種選擇性的結(jié)構(gòu)和進化基礎(chǔ)仍沒有分辨?；谶@兩點，極大的限制了蝎鈉通道毒素作為肽類殺蟲劑的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述不足，本發(fā)明人利用定點突變，結(jié)合電生理和活體功能檢測技術(shù)，系統(tǒng)完成了蝎α-型神經(jīng)毒素中加速替代的氨基酸位點的分子解剖和功能評估。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，蝎α-型神經(jīng)毒素的大多數(shù)正選擇位點定位于毒素-鈉通道受體位點的作用界面，通過對蝎α-型神經(jīng)毒素正選擇位點的系統(tǒng)性功能評估，發(fā)現(xiàn)了蝎α-型毒素調(diào)控物種(昆蟲/哺乳動物)選擇性的關(guān)鍵氨基酸位點，以及其在調(diào)節(jié)毒素對哺乳動物/昆蟲選擇性中的關(guān)鍵作用，其中的熱點氨基酸殘基的突變導(dǎo)致了蝎α-型神經(jīng)毒素對哺乳動物鈉通道毒性的不同程度直至完全喪失，而毒素的昆蟲毒性得以保留甚至不同程度地加強。因此，本發(fā)明提供了一種蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體，該突變體可以高度選擇性地靶向昆蟲鈉通道，從而可以作為肽類殺蟲劑應(yīng)用，并且也為進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的增效型微生物殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

一方面，本發(fā)明提供了一種蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段，其中，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的序列如seqidno：1所示，并且所述突變體或其片段的突變位點位于所述蝎α-型神經(jīng)毒素的n-轉(zhuǎn)角、b環(huán)和/或j環(huán)三個結(jié)構(gòu)域中：

seqidno：1：ardayiakphncvyecfdafssycngvctkngaksgycqilgtygngcwcialpdnvpiripgkch。

其中，所述n-轉(zhuǎn)角位于seqidno：1的第8位到第12位氨基酸、所述j環(huán)位于seqidno：1的第17位到第23位氨基酸和/或所述b環(huán)位于seqidno：1：的第39位到第47位氨基酸。

所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段相對于野生型蝎α-型神經(jīng)毒素至少有一個氨基酸發(fā)生突變，所述突變包括氨基酸的取代、缺失或插入。在本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段中，可以有一個至六個氨基酸發(fā)生突變，優(yōu)選地，只有一個氨基酸位點發(fā)生突變。

優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的至少一個突變的氨基酸位點位于seqidno：1所示的序列的k8、p9、e15、d18、a19、f20、s22、i40、l41、t43和/或a52處。

優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段可以包括將第八位的賴氨酸突變?yōu)楸彼?、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或天冬氨酸?/p>

第九位的脯氨酸突變?yōu)楸彼?、甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸?/p>

第十五位的谷氨酸突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸或谷氨酰胺；

第十八位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或精氨酸?/p>

第十九位的丙氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒗野彼峄蛏彼幔?/p>

第二十位的苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼峄蛏彼幔?/p>

第二十二位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?、異亮氨酸、脯氨酸或甘氨酸?/p>

第四十位的異亮氨酸突變?yōu)楸彼帷⒗i氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

第四十一位的亮氨酸突變?yōu)楸彼?、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

第四十三位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼帷⒘涟彼?、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸或谷氨酸?/p>

第五十二位的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。

優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的一個突變選自k8a、p9a、e15a、d18a、s22g、i40a、l41a、t43a和a52k。

本發(fā)明中所有的突變命名是基于國際上突變的命名原則，包含了三部分，突變前氨基酸-突變的氨基酸位置-突變后氨基酸，如k8a，即突變導(dǎo)致了第8個氨基酸由突變前的賴氨酸(k)變成了突變后的丙氨酸(a)，核苷酸突變同理。

優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的序列如seqidno：2-11中任一項所示。

更優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的序列如seqidno：7或8所示。

優(yōu)選地，所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段還包括刪除突變體或其片段，其中如seqidno：1所示的序列中的19和20位點被刪除(δ19af20)，優(yōu)選地，所述刪除突變體或其片段的序列如seqidno：12所示。

另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的dna序列和表達盒，用于轉(zhuǎn)化所述序列的宿主細胞。

所述表達盒包括編碼蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的dna序列和與該序列操作性相連接的啟動子，該啟動子是在宿主細胞中起作用的。將表達盒插入轉(zhuǎn)化載體中并在轉(zhuǎn)化細胞中生產(chǎn)蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體。然后可從宿主細胞或宿主細胞上清液中純化獲得蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體。

蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段也可通過類似定點或隨機誘變的方式篩選和選擇自發(fā)突變體來制得。蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體可用體外誘變或從某步驟產(chǎn)生的片段半合成法來制得。最后，蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段可用化學合成方法來制得。

生產(chǎn)蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的方法包括，用包括該表達盒的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，在允許宿主細胞表達蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的條件下培養(yǎng)宿主細胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用各種方法來制得編碼本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體或其片段的dna序列?？梢允褂镁幋a基本對應(yīng)野生型蝎α-型神經(jīng)毒素的蛋白的dna序列作為模板dna來制得編碼蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體的dna序列。編碼野生型蝎α-型神經(jīng)毒素的dna序列如seqidno：13所示。

seqidno：13：

gctcgtgatgcttatattgccaagccccataactgtgtatacgaatgttttgatgcatttagtagttattgcaacggtgtatgtaccaagaacggtgctaagagtggctattgccaaatcctcggtacatatggaaatggttgctggtgcatagcgttgcccgataatgtaccgattagaataccaggaaaatgccat

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的dna序列可以編碼相同的氨基酸序列。本發(fā)明包括具有不同的核苷酸序列但編碼相同的氨基酸序列的dna序列。

此外，本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體可通過化學合成來制得?？梢詤⒄誻allace，fasebj.7：505(1993)描述的方法來化學合成蛋白。也可以合成部分蛋白，然后用酶連接在一起，或直接化學縮合?；瘜W合成尤其適用于制備野生型蝎α-型神經(jīng)毒素突變體的片段。

任選地，dna序列可以與不同的啟動子結(jié)合以在特定類型的宿主細胞中表達或增強在宿主細胞中的表達水平。

一旦將編碼蝎α-型神經(jīng)毒素突變體的dna序列與合適的啟動子結(jié)合成表達盒，就將該表達盒亞克隆到合適的轉(zhuǎn)化載體中。合適的轉(zhuǎn)化載體包括至少一種可檢測的標記物基因，它最好是能在大腸桿菌和革蘭陽性微生物中擴增的穿梭載體。合適的穿梭載體例子包括pmin164和pce104。其它類型的載體包括病毒載體如桿狀病毒載體，sv40，痘病毒如牛痘、腺病毒和巨細胞病毒。較佳的載體是pmin164載體，一種可在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中擴增的穿梭載體。

一旦形成了攜帶編碼蝎α-型神經(jīng)毒素突變體表達盒的轉(zhuǎn)化載體，就將其引入供表達蝎α-型神經(jīng)毒素突變體的合適宿主細胞中。合適的宿主細胞是那些能高水平表達突變型毒素并使其它不需要的分子(如內(nèi)毒素和m蛋白)污染可能性最少的細胞。合適的宿主細胞包括哺乳動物細胞、細菌細胞如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌屬、酵母細胞以及昆蟲細胞。

轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣沉淀和電穿孔。較佳的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

再另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包括本發(fā)明所述的突變體、編碼所述突變體的dna序列、表達盒和/或用于轉(zhuǎn)化所述序列的宿主細胞。

本發(fā)明還提供了一種肽類殺蟲劑，所述肽類殺蟲劑包括本發(fā)明所述的突變體、編碼所述突變體的dna序列、表達盒和/或用于轉(zhuǎn)化所述序列的宿主細胞。

本發(fā)明還提供了一種殺蟲微生物的增效劑，所述增效劑包括本發(fā)明所述的突變體、編碼所述突變體的dna序列、表達盒和/或用于轉(zhuǎn)化所述序列的宿主細胞。

本發(fā)明提供了一種蝎α-型神經(jīng)毒素(來自條斑鉗蝎m.eupeus的α-型神經(jīng)毒素，其影響電壓門控鈉通道)的突變體mt-5。該α-型神經(jīng)毒素來自條斑鉗蝎毒液中的α-型神經(jīng)毒素，該毒素能夠靶向昆蟲和哺乳動物的鈉離子通道，造成昆蟲和哺乳動物死亡；本發(fā)明利用進化指導(dǎo)的設(shè)計策略，發(fā)現(xiàn)蝎α-型毒素調(diào)控物種(昆蟲/哺乳動物)選擇性的關(guān)鍵氨基酸位點，并由此設(shè)計高度選擇性靶向昆蟲鈉通道的蝎α-型神經(jīng)毒素突變體，其不僅消除了對老鼠的毒性，而且保留甚至增強了對昆蟲的毒性，本發(fā)明的突變體不僅為進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的殺蟲微生物奠定基礎(chǔ)，可以用于研發(fā)增效型微生物殺蟲劑，還可以用作肽類殺蟲劑；而且本發(fā)明首次使用進化生物信息學的方法指導(dǎo)開發(fā)殺蟲分子的先導(dǎo)物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

當前，微生物殺蟲劑是新型的生物農(nóng)藥，本發(fā)明提供的蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體可以用于制備增效型微生物殺蟲劑或用作微生物殺蟲劑的增效器：

1)當前的微生物殺蟲劑殺蟲譜窄，只能針對特定種類的害蟲，而本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體是昆蟲鈉通道的高親和性配體，能夠高效選擇性的靶向昆蟲的鈉通道，因此可以用于昆蟲類害蟲；

2)當前微生物殺蟲劑的感染的潛伏期長，導(dǎo)致殺蟲效果慢，會造成實質(zhì)性經(jīng)濟損失，而本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素突變體能夠克服當前的微生物殺蟲劑潛伏期長，殺蟲效果慢的確定，提高經(jīng)濟效益；

3)本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素突變體的作用效果不受環(huán)境條件(溫度、濕度和光照)的影響，使得其應(yīng)用范圍更加廣泛。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1示出為蝎α-型神經(jīng)毒素(mt-5)的序列和正選擇位點定位；

其中，圖a為本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素與其他物種的序列做的多序列比對。粗體表示的8個半胱氨酸形成二硫鍵。富含正選擇位點的結(jié)構(gòu)區(qū)域加虛框示意；灰色線示意二硫鍵的連接方式；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件從mt-5實驗性結(jié)構(gòu)提取(pdbentry2lkb)。

序列來源：mt-5來自條斑鉗蝎mesobuthuseupeus；bmkm1來自東亞鉗蝎mesobuthusmartensii；lqh3，lqh2和lqhαit來自以色列金蝎leiurusquinquestriatushebraeus；aah2來自黃肥尾蝎androctonusaustralis。

圖1b為本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5的空間結(jié)構(gòu)的帶狀模型，并且該圖示出了正選擇氨基酸(用α-碳原子的球體模型顯示)在mt-5的空間結(jié)構(gòu)中的位置，其位于所述序列的n-轉(zhuǎn)角，b環(huán)和j環(huán)三個結(jié)構(gòu)域中。

圖2示出為本發(fā)明的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5的rp-hplc，其中峰圖顯示其洗脫時間和純度；

圖3示出為重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素(rmt-5)及其突變體的圓二色譜分析；

圖4為卵母細胞電壓鉗技術(shù)，檢測本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5對不同鈉通道及其亞型的效應(yīng)；其中rnav1.1、rnav1.2、rnav1.4、rnav1.5和mnav1.6為老鼠電壓門控鈉通道(其中m表示小鼠；r表示大鼠)；dmnav1為果蠅的電壓門控鈉通道；

圖5示出為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5及其突變體對電壓門控鈉通道門控特性的影響，其中圖5a為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5及其突變體對rnav1.1的影響；圖5b為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5及其突變體對果蠅dmnav1鈉通道門控特性的影響；

圖6示出為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5突變體對rnav1.2，rnav1.4和mnav1.6a電壓門控鈉通道門控特性的影響。其中圖6a為非熱點殘基突變體；圖6b為熱點殘基突變體。

圖7示出為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5及其突變體對rnav1.1的劑量-效應(yīng)曲線；

圖8示出為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5和rnav1.1受體的復(fù)合物模型；

圖9示出為本發(fā)明所述的重組野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5及其突變體對家蠅的活體毒性試驗。

具體實施方式

除非特別指明，以下實施例中所用的鼠品種均為icr小鼠，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；家蠅muscadomesticatjs，deltamethrin-sensitivestrain，購自中國科學院動物研究所。

實施例1蝎α-型神經(jīng)毒素正選擇位點的檢測

本實施例中使用的軟件為paml(phylogeneticanalysisbymaximumlikelihood)程序包(http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html)，由英國倫敦大學楊子恒教授開發(fā)。

發(fā)明人選取了來自條斑鉗蝎的mt-5、東亞鉗蝎的bmkm1、以色列金蝎的lqh3，lqh2和lqhαit和黃肥尾蝎的aah2，與本發(fā)明的α-型神經(jīng)毒素進行生物信息學分析，在本發(fā)明的α-型神經(jīng)毒素中發(fā)現(xiàn)了一系列的正選擇位點。

其中，本發(fā)明所使用的序列的信息如表1所示

表1序列信息

利用最大似然法的密碼子替代模型，申請人從mesobuthus蝎α-型毒素中檢測到了11個正選擇位點(k8、p9、e15、d18、a19、f20、s22、i40、l41、t43和a52)。這些位點主要分布在毒素分子的三個結(jié)構(gòu)區(qū)域，n-轉(zhuǎn)角，b環(huán)和j環(huán)，如圖1a和圖1b所示。圖1a為本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素與其他物種的序列做的多序列比對。粗體表示的8個半胱氨酸形成二硫鍵。富含正選擇位點的結(jié)構(gòu)區(qū)域加虛框示意；灰色線示意二硫鍵的連接方式；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件從mt-5實驗性結(jié)構(gòu)提取(pdbentry2lkb)。圖1b為本發(fā)明的蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5的空間結(jié)構(gòu)的帶狀模型，并且該圖示出了正選擇氨基酸(用α-碳原子的球體模型顯示)在mt-5的空間結(jié)構(gòu)中的位置，其位于所述序列的n-轉(zhuǎn)角，b環(huán)和j環(huán)三個結(jié)構(gòu)域中。

實施例2蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5及其突變體的設(shè)計、制備和鑒定

通過pcr策略，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，獲得了一系列的正選擇位點的突變體，分別包括了10個點突變(k8a、p9a、e15a、d18a、s22g、i40a、l41a、t43a、a52k和a52l)以及一個刪除突變體(δ19af20)。突變體的氨基酸序列如以下表2所示：

表2序列信息

所述序列使用的引物如表3所示：

表3使用的引物

注：突變的密碼子使用粗體表示，并且限制性核酸內(nèi)切酶位點(bamhiandsali)使用下劃線表示。所列出的所有引物由sbsgenetech合成。

利用大腸桿菌表達策略，發(fā)明人獲得了除了t43a之外的所有重組蛋白，包括有大腸桿菌重組制備的野生型蝎α-型神經(jīng)毒素rmt-5，其中，所述突變體由以下方法制備：

1.利用pcr策略，首先構(gòu)建了pet-28a-mt-5重組表達載體，所用內(nèi)切酶為ncoi和sali；

2.將測序正確的pet-28a-mt-5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)plyss細胞；

3.選取過夜培養(yǎng)的單克隆接種到lb培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g)，37℃培養(yǎng)至od600＝0.2-0.3，加入iptg至終濃度0.5mm，誘導(dǎo)4小時；

4.離心收集菌體，超聲波破菌后收集包涵體沉淀，懸浮于下列緩沖液(0.1mtris-hcl，ph8.5，0.1mnacl)；

5.用2m尿素，2％triton100，0.1mtris-hcl，ph8.5，0.1mnacl緩沖液洗滌包涵體3次；

6.用6m鹽酸胍，0.1mtris-hcl(ph8.5)，1mmedta，and30mmβ巰基乙醇溶解包涵體，室溫放置2小時；

7.用0.2m乙酸銨(ph9.0)20倍稀釋上述包涵體溶解液，啟動復(fù)性過程，室溫放置48小時；

8.復(fù)性的毒素用80％飽和硫酸銨沉淀，超濾脫鹽后用rp-hplc分離純化目的產(chǎn)物。

使用maldi-tof測定了它們的分子量，與理論分子量完全吻合，如表4所示。圓二色譜技術(shù)證實了這些突變體的空間結(jié)構(gòu)與野生型高度相似，如圖3所示。

其中，maldi-tof分析在中國科學院微生物所完成；圓二色譜技術(shù)在中科院生物物理所完成。cd儀器為chirascanplusspectropolarimeter(uk)，測量蛋白質(zhì)濃度為0.1mg/ml。波長范圍190-260nm。石英比色皿光程為1毫米。

表4rmt-5的分子量

實施例3蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5及其突變體的功能檢測

電生理檢測：

1.卵母細胞的分離：爪蟾冰麻醉1小時后，腹部朝上冰上取卵，取完后縫合好肌肉和皮膚，浸泡在2-3cm高室溫水里復(fù)蘇。卵母細胞取出后用含有膠原酶(1mg/ml)的nd96溶液消化1-2小時，用零鈣和1.8鈣的nd96各沖洗3次，在顯微鏡下挑選出無瑕疵的5-6期細胞保存在含有50mg/l硫酸慶大霉素的nd96中，16℃培養(yǎng)2-3小時后注射通道crna。

2.鈉通道crna的制備和顯微注射：通道線性化質(zhì)粒用mmessagemmachinet7/sp6kit(ambionam1344)轉(zhuǎn)錄，用nanoliter2000顯微注射儀(worldprecisioninstruments，usa)注射crna。

3.電生理記錄：用oocyteclampamplifier(oc-725c，harvardapparatuscompany)室溫記錄電流。數(shù)據(jù)采集器為pclamp10.2控制的digidata1440a，axoncns)。漏差減按p/4方案進行。雙電極電阻控制在0.5-1.5mω。去極化電流用1khz的四極低通bessel濾波器過濾，采樣頻率20khz。

4.數(shù)據(jù)處理：毒素的劑量效應(yīng)(延緩失活)用i30ms/ipeak計算(i30ms為去極化后30ms測量的穩(wěn)態(tài)電流電流，ipeak為對照峰電流)。數(shù)據(jù)用hill方程擬合，用sigmaplot11.0將三次獨立實驗的數(shù)據(jù)以平均值±標準誤的形式呈現(xiàn)。

利用卵母細胞電壓鉗技術(shù)，發(fā)明人分析了mt-5及其突變體對鈉通道功能的影響。五個老鼠鈉通道亞型和一個果蠅鈉通道用于評估重組mt-5的藥理學活性。結(jié)果表明，該毒素能夠顯著延緩rnav1.1和昆蟲鈉通道dmnav1的失活過程并放大峰電流，并且對rnav1.4和rnav1.6也有弱的活性(圖4)。因此，發(fā)明人選擇了rnav1.1和dmnav1兩個通道作為代表評估了系列突變體的活性。結(jié)果表明，雖然突變正選擇位點導(dǎo)致了對rnav1.1差異的活性，但是它們都對dmnav1沒有明顯的影響(圖5)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，突變40和41位點(i40a和l41a)，以及刪除19和20位點(δ19af20)，導(dǎo)致了mt-5對rnav1.1活性的完全喪失(1μm)(圖5)。利用其它通道亞型，包括rnav1.2,rnav1.4和mnav1.6，我們研究了上述突變體的突變效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述這些突變體對這三個哺乳動物通道亞型的活性也顯著下降了(圖6)。劑量-效應(yīng)曲線分析進一步表明這些位點的突變導(dǎo)致了毒素對rnav1.1通道活性下降超過100倍(表5和表6)，支持它們屬于毒素-通道作用的熱點氨基酸殘基。

表5mt-5及其突變體對rnav1.1的效應(yīng)

n.a.指使用1μm的突變體，在檢測通道中沒有活性。

表6mt-5及其突變體對rnav1.1和家蠅鈉通道的活性

備注：倍數(shù)減少通過使用(突變體的ec50-rmt-5的ec50)除以rmt-5的ec50來計算的；n.d.指沒有檢測；

實施例4蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5及其突變體與rnav1.1受體位點的相互作用

操作步驟：基于玻璃海鞘cionaintestinalis的實驗性結(jié)構(gòu)(pdbentry4g7v)，我們在swiss-model服務(wù)器(http://www.swissmodel.expasy.org/)通過同源模建的方法構(gòu)建了大鼠rnav1.1受體區(qū)域(從1540位到1655位氨基酸)的三維結(jié)構(gòu)模型。

利用分子對接軟件zdock(version3.0.2)建立了mt-5和rnav1.1受體的結(jié)構(gòu)復(fù)合物模型。該模型建立方法參考了實驗確定的毒素和通道氨基酸的數(shù)據(jù)信息，并完成了能量最小化。

利用分子對接方法，發(fā)明人將mt-5毒素分子的4個熱點氨基酸(a19，f20，i40和l41)定位到了rnav1.1受體位點(圖七)，建立了毒素通道相互作用的關(guān)鍵氨基酸配對，包括：a19和f20(毒素)-y1628和f1629(通道)；i40(毒素)-e1623(通道)；l41(毒素)-t1570(通道)。這說明這些正選擇位點以及正選擇環(huán)插入位點構(gòu)成了毒素-通道相互作用的關(guān)鍵氨基酸。

實施例5蝎α-型神經(jīng)毒素mt-5及其突變體的活體毒性試驗

活體毒性測定：

1.昆蟲毒性測定：用昆蟲生理鹽溶液(200mmnacl，3.1mmkcl，5.4mmcacl2，5mmmgcl2，2mmnahco3，0.1mmnah2po4，ph7.2)將每個毒素溶解成5個不同的溶度。利用微量進樣槍注射到家蠅，每只1μl劑量，實驗重復(fù)3次，每組10只家蠅成蟲。記錄12小時的死亡率。利用sigmaplot11.0軟件計算半致死濃度(ld50)。劑量效應(yīng)曲線用hill方程進行擬合，公式為y＝(a-b)/[1+(x/ld50)n]+b?！皔”為家蠅死亡率(％)，“x”為毒素劑量(pmol/g)，“n”變量斜率因子，“a”為最大死亡百分比，“b”為最小死亡百分比。

2.小鼠毒性測定：

用0.9％的nacl生理鹽水將毒素溶解成5個不同的溶度。采用尾靜脈給藥的方式將這些毒素注射入無特定病原體(specificpathogen-free，spf)小鼠體內(nèi)。每組10個小鼠，大約25克/小鼠。24小時后記錄死亡率。利用bliss方法計算毒素的半致死劑量(ld50)(spssstatistics17.0.1，spssinc.)。

表7mt-5及其突變體對家蠅和小鼠的活性

n.d.指沒有檢測到。相對毒性通過使用rmt-5的ld50除以家蠅幼蟲的突變體的ld50來計算的；

發(fā)明人評估了mt-5以及突變體對家蠅的活體毒性，發(fā)現(xiàn)所有的突變體都整體上保留了野生型的抗昆蟲活性，其中δ19af20活性比mt-5顯著提高。i40a和l41a整體活性也顯著下降(圖七，表4)。小鼠毒性實驗表明3個mt-5突變體(i40a，l41a和δ19af20)，對老鼠的毒性顯著下降(表4)，整體下降25-78。正選擇及其相近的插入氨基酸位點的突變可以改變毒素對昆蟲/哺乳動物選擇性，從而可以用于調(diào)整mt-5的毒性，為定向設(shè)計針對昆蟲電壓門控鈉通道的肽類殺蟲劑和微生物殺蟲劑的增效劑提供了基礎(chǔ)。

序列表

<110>中國科學院動物研究所

<120>蝎α-型神經(jīng)毒素的突變體及其用途

<130>dic16110006r

<160>40

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素

<400>1

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151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>2

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體k8a

<400>2

alaargaspalatyrilealaalaprohisasncysvaltyrglucys

151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>3

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體p9a

<400>3

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151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

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65

<210>4

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體e15a

<400>4

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyralacys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>5

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體d18a

<400>5

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>6

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體s22g

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151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>7

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體i40a

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alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

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202530

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505560

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65

<210>8

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體l41a

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151015

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202530

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354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>9

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體t43a

<400>9

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglyalatyrglyasnglycys

354045

trpcysilealaleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體a52k

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151015

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505560

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65

<210>11

<211>66

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體a52l

<400>11

alaargaspalatyrilealalysprohisasncysvaltyrglucys

151015

pheaspalaphesersertyrcysasnglyvalcysthrlysasngly

202530

alalysserglytyrcysglnileleuglythrtyrglyasnglycys

354045

trpcysileleuleuproaspasnvalproileargileproglylys

505560

cyshis

65

<210>12

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素突變體δ19af20

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<213>人工序列

<220>

<223>蝎α-型神經(jīng)毒素的dna序列

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<213>人工序列

<220>

<223>東亞鉗蝎的bmkm1

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151015

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<213>人工序列

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<223>以色列金蝎的lqh3

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202530

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354045

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505560

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65

<210>16

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>以色列金蝎的lqh2

<400>16

ilelysaspglytyrilevalaspaspvalasncysthrtyrphecys

151015

glyargasnalatyrcysasngluglucysthrlysleulysglyglu

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<213>人工序列

<220>

<223>以色列金蝎的lqhαit

<400>17

valargaspalatyrilealalysasntyrasncysvaltyrglucys

151015

pheargaspalatyrcysasngluleucysthrlysasnglyalaser

202530

serglytyrcysglntrpalaglylystyrglyasnalacystrpcys

354045

tyralaleuproaspasnvalproileargvalproglylyscyshis

505560

<210>18

<211>64

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>黃肥尾蝎的aah

<400>18

vallysaspglytyrilevalaspaspvalasncysthrtyrphecys

151015

glyargasnalatyrcysasngluglucysthrlysleulysglyglu

202530

serglytyrcysglntrpalaserprotyrglyasnalacystyrcys

354045

tyrlysleuproasphisvalargthrlysglyproglyargcyshis

505560

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<210>24

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>k8a/p9a-r

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<213>人工序列

<220>

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<220>

<223>e15a-r

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<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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<220>

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<400>35

gcgtatggaaatggttgctggtgc24

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<213>人工序列

<220>

<223>t43a-r

<400>36

accgaggatttggcaatagccact24

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<213>人工序列

<220>

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aaattgcccgataatgtaccgattaga27

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<213>人工序列

<220>

<223>a52k-r

<400>38

tatgcaccagcaaccatttccatatgt27

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>40

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>δaf-r

<400>40

atcaaaacattcgtatacacagtt24