本發(fā)明涉及一種抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)是黃病毒科丙型肝炎病毒屬的重要人類病原體，其慢性感染常導(dǎo)致肝硬化、肝癌等嚴(yán)重肝病，威脅人類健康。根據(jù)who于2013年7月更新的數(shù)據(jù)，全球約有1.5億人為hcv慢性感染者，每年死于丙型肝炎相關(guān)肝病的人數(shù)超過(guò)35萬(wàn)。由于hcv具有多種基因型(包括亞型)、病毒基因組高度變異，且缺乏有效的小動(dòng)物模型等原因，針對(duì)hcv的疫苗研究迄今未有實(shí)質(zhì)性突破。近年來(lái)，作用于hcv的直接抗病毒藥物(daas)研發(fā)取得了較好的進(jìn)展，相繼獲得針對(duì)蛋白酶、聚合酶以及ns5a等病毒蛋白的小分子化合物，但迅速產(chǎn)生的耐藥突變、價(jià)格昂貴以及靶點(diǎn)范圍相對(duì)較窄等問(wèn)題仍有待于人們?cè)O(shè)計(jì)新策略。hcv作為囊膜病毒，病毒的膜融合(membranefusion)環(huán)節(jié)是繼受體結(jié)合和病毒內(nèi)吞后，實(shí)現(xiàn)感染的必需過(guò)程。針對(duì)囊膜病毒融合機(jī)制，通過(guò)阻斷病毒膜融合可實(shí)現(xiàn)高效的抗病毒治療。例如：針對(duì)人免疫缺陷病毒(hiv-1)的膜融合抑制劑已應(yīng)用于臨床治療多年，是雞尾酒療法的重要組成部分，目前hiv膜融合抑制劑的藥物開(kāi)發(fā)已進(jìn)入第三代。然而在hcv領(lǐng)域，盡管受體研究取得重要進(jìn)展，但是人們對(duì)于hcv的膜融合機(jī)制仍然知之甚少。用于hcv膜融合的研究方法通常包括兩類：即基于病毒受體與囊膜蛋白的細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)和基于病毒囊膜蛋白的脂質(zhì)體融合試驗(yàn)。病毒膜中的脂類組成對(duì)膜融合發(fā)揮重要作用，其中膽固醇是必須的組成成分，去掉膽固醇的病毒顆粒的感染效率極低。有趣的是，在目標(biāo)膜中存在膽固醇的情況下，向病毒膜中加入鞘磷脂可以顯著增強(qiáng)膜融合效率。這些證據(jù)表明，由膽固醇以及鞘磷脂等脂類組成的所謂脂筏(raft)在hcv入侵特別是融合過(guò)程中扮演重要角色。hcv病毒顆粒所結(jié)合β脂蛋白(apoe和apob)，也可顯著提高其膜融合能力?？傮w上，盡管科學(xué)家們付出了艱辛的努力，但是關(guān)于hcv膜融合的分子機(jī)制，特別是參與膜融合的囊膜蛋白組成與關(guān)鍵位點(diǎn)、構(gòu)象變化、外部誘發(fā)環(huán)境，以及膜融合抑制劑研發(fā)等領(lǐng)域仍然留下太多的問(wèn)題等待回答。由于病毒膜融合是hcv生活周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此清晰的闡明病毒膜融合分子機(jī)制不但對(duì)基礎(chǔ)病毒學(xué)研究具有重要意義，而且對(duì)于開(kāi)發(fā)全新的抗病毒策略更具有創(chuàng)新性指導(dǎo)意義。在世界范圍內(nèi)，病毒膜融合抑制劑類藥物研發(fā)最成功的領(lǐng)域?yàn)槿嗣庖呷毕莶《尽?003年，美國(guó)fda批準(zhǔn)了第一個(gè)抗病毒膜融合抑制劑恩夫韋肽(enfuvirtide，t20)進(jìn)入臨床應(yīng)用，從而開(kāi)啟了一類新的抗病毒策略的應(yīng)用。通過(guò)十幾年的研究，目前hiv膜融合抑制劑在提高抗病毒活性、廣譜性、抗耐藥等方面得到了顯著地提高。但hcv的膜融合抑制劑領(lǐng)域的研究還剛剛起步。多年來(lái)，人們對(duì)于hcv入侵的研究大多數(shù)集中在病毒輔助受體的發(fā)現(xiàn)及功能研究方面，而隨著輔助受體逐步被發(fā)現(xiàn)，hcv是如何完成膜融合過(guò)程以及如何根據(jù)膜融合機(jī)制設(shè)計(jì)新的抗病毒策略這一重要科學(xué)問(wèn)題便擺在科學(xué)家面前。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供一種多肽，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抑制丙型肝炎病毒感染相關(guān)的由序列1衍生的多肽。編碼所述多肽的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因?yàn)槿缦?1)或(2)或(3)的dna分子：(1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的dna序列雜交且編碼與抑制丙型肝炎病毒感染活性相關(guān)多肽的dna分子；(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼與抑制丙型肝炎病毒感染活性相關(guān)多肽的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以所述多肽為免疫原得到的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述抗體具體可為多克隆抗體或單克隆抗體。所述多克隆抗體具體可為以所述多肽為免疫原免疫小鼠得到的多克隆抗體。所述小鼠具體可為blab/c小鼠。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽或所述抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的用途為如下(a1)-(a7)中任意一種：(a1)抑制丙型肝炎病毒感染活性；(a2)抑制丙型肝炎病毒感染細(xì)胞；(a3)抑制丙型肝炎病毒入侵；(a4)抑制丙型肝炎病毒入侵細(xì)胞；(a5)抑制丙型肝炎病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合；(a6)預(yù)防丙型肝炎；(a7)治療丙型肝炎。本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為所述多肽或所述抗體；所述產(chǎn)品的用途為如下(a1)-(a7)中任意一種：(a1)抑制丙型肝炎病毒感染活性；(a2)抑制丙型肝炎病毒感染細(xì)胞；(a3)抑制丙型肝炎病毒入侵；(a4)抑制丙型肝炎病毒入侵細(xì)胞；(a5)抑制丙型肝炎病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合；(a6)預(yù)防丙型肝炎；(a7)治療丙型肝炎。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽或所述抗體的應(yīng)用；所述應(yīng)用為如下(b1)或(b2)：(b1)抑制丙型肝炎病毒感染；(b2)丙型肝炎病毒感染細(xì)胞。所述丙型肝炎病毒具體可為1a亞型的丙型肝炎病毒、1b亞型的丙型肝炎病毒、2a亞型的丙型肝炎病毒、2b亞型的丙型肝炎病毒、3a亞型的丙型肝炎病毒、4a亞型的丙型肝炎病毒、4c亞型的丙型肝炎病毒、5a亞型的丙型肝炎病毒或6a亞型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具體可為hcv1a(tncc)毒株、hcv2a(j6cc)毒株、hcv2b(dh8cc)毒株、hcv3a(s52_5-5a)毒株、hcv4a(ed43_5-5a)毒株、hcv5a(sa13_5-5a)毒株、hcv6a(hk6a_5-5a)毒株或jc-1毒株。所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體可為huh7.5.1細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽或所述抗體的應(yīng)用；所述應(yīng)用為如下(b3)或(b4)：(b3)抑制丙型肝炎病毒入侵；(b4)抑制丙型肝炎病毒入侵細(xì)胞。所述丙型肝炎病毒具體可為1a亞型的丙型肝炎病毒、1b亞型的丙型肝炎病毒、2a亞型的丙型肝炎病毒、2b亞型的丙型肝炎病毒、3a亞型的丙型肝炎病毒、4a亞型的丙型肝炎病毒、4c亞型的丙型肝炎病毒、5a亞型的丙型肝炎病毒或6a亞型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具體可為hcv1a(tncc)毒株、hcv2a(j6cc)毒株、hcv2b(dh8cc)毒株、hcv3a(s52_5-5a)毒株、hcv4a(ed43_5-5a)毒株、hcv5a(sa13_5-5a)毒株、hcv6a(hk6a_5-5a)毒株或、jc-1毒株。所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具體可為huh7.5.1細(xì)胞。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽或所述抗體的應(yīng)用；所述應(yīng)用為抑制丙型肝炎病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合。所述丙型肝炎病毒具體可為1a亞型的丙型肝炎病毒、1b亞型的丙型肝炎病毒、2a亞型的丙型肝炎病毒、2b亞型的丙型肝炎病毒、3a亞型的丙型肝炎病毒、4a亞型的丙型肝炎病毒、4c亞型的丙型肝炎病毒、5a亞型的丙型肝炎病毒或6a亞型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具體可為hcv1a(tncc)毒株、hcv2a(j6cc)毒株、hcv2b(dh8cc)毒株、hcv3a(s52_5-5a)毒株、hcv4a(ed43_5-5a)毒株、hcv5a(sa13_5-5a)毒株、hcv6a(hk6a_5-5a)毒株或、jc-1毒株。所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞融合具體可為293t細(xì)胞和huh7.5.1細(xì)胞的融合。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽或所述抗體應(yīng)用；所述應(yīng)用為如下(b5)或(b6)：(b5)預(yù)防丙型肝炎；(b6)治療丙型肝炎。本發(fā)明以hcv膜融合模型和囊膜蛋白多肽文庫(kù)篩選為切入點(diǎn)，充分利用hcv假病毒、細(xì)胞培養(yǎng)活病毒等先進(jìn)病毒學(xué)研究工具，通過(guò)病毒學(xué)、生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法手段，發(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)和優(yōu)化了抗hcv入侵的膜融合抑制多肽候選物，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)阻斷hcv感染的藥物提供新靶點(diǎn)。本發(fā)明為研發(fā)高效的新型小分子抗hcv病毒感染藥物奠定了理論基礎(chǔ)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景和創(chuàng)新意義。附圖說(shuō)明圖1為多肽e27對(duì)hcv不同型假病毒入侵細(xì)胞的抑制結(jié)果。圖2為多肽e27對(duì)hcv不同型病毒株入侵細(xì)胞的抑制結(jié)果。圖3為多肽e27抗體對(duì)hcv病毒株感染的抑制結(jié)果。圖4為多肽e27的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為多肽e27抑制hcve152介導(dǎo)的細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6為多肽e27抗體抑制hcve152介導(dǎo)的細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。huh7.5.1細(xì)胞：參考文獻(xiàn)：jinz，pablog，guofengc，etal.robusthepatitiscvirusinfectioninvitro.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，2005，102(26)：9294-9299.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。293t細(xì)胞：國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，資源編號(hào)：3111c0001ccc000091。多肽e27先用dmos作為溶劑制備得到濃度為10mm的母液。使用時(shí)將母液加入dmem培養(yǎng)基，得到含有不同濃度多肽e27的dmem培養(yǎng)基。pbs緩沖液：北京索萊寶科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：p1020，ph7.4，0.01m。熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和細(xì)胞裂解液：promega公司，產(chǎn)品編號(hào)：e2610。hcv1a(tncc)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，jensensb，etal.highlyefficientfull-lengthhepatitiscvirusgenotype1(straintn)infectiousculturesystem.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，2012，109(48)：19757-19762.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv2a(j6cc)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，gottweinjm，etal.robustfull-lengthhepatitiscvirusgenotype2aand2binfectiousculturesusingmutationsidentifiedbyasystematicapproachapplicabletopatientstrains.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，2012，109(18)：6806-6807.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv2b(dh8cc)：參考文獻(xiàn)：santseharayr，yi-pingl，jensensb，etal.highlyefficientinfectiouscellcultureofthreehepatitiscvirusgenotype2bstrainsandsensitivitytoleadprotease，nonstructuralprotein5a，andpolymeraseinhibitors.[j].hepatology，2014，59(2)：395-407.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv3a(s52_5-5a)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，darylh，etal.differentialsensitivityof5’utr-ns5arecombinantsofhepatitiscvirusgenotypes1-6toproteaseandns5ainhibitors.[j].gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv4a(ed43_5-5a)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，darylh，etal.differentialsensitivityof5’utr-ns5arecombinantsofhepatitiscvirusgenotypes1-6toproteaseandns5ainhibitors.[j].gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv5a(sa13_5-5a)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，darylh，etal.differentialsensitivityof5’utr-ns5arecombinantsofhepatitiscvirusgenotypes1-6toproteaseandns5ainhibitors.[j].gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv6a(hk6a_5-5a)：參考文獻(xiàn)：yi-pingl，santseharayr，darylh，etal.differentialsensitivityof5’utr-ns5arecombinantsofhepatitiscvirusgenotypes1-6toproteaseandns5ainhibitors.[j].gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得?？?hcv核心蛋白的抗體：thermo公司貨號(hào)：39-6900。irdye二抗：li-cot，nebraska，usa。ppr-crem/cmv-stop-luc質(zhì)粒(包括ppr-crem質(zhì)粒和cmv-stop-luc質(zhì)粒)：addgene公司，貨號(hào)：#8406。scramble：陰性對(duì)照多肽，氨基酸序列如序列表的序列3所示。hcv病毒株jc-1：參考文獻(xiàn)：yangw，hoodbl，chadwicksl，lius，watkinssc，luog，conradstp，etal.fattyacidsynthaseisup-regulatedduringhepatitiscvirusinfectionandregulateshepatitiscvirusentryandproduction.hepatology2008；48：1396-1403.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。實(shí)施例1、多肽e27的制備人工合成多肽e27。多肽e27的氨基酸序列如序列表的序列1所示。多肽e27的編碼基因如序列表的序列2所示。實(shí)施例2、多肽e27抑制hcv假病毒感染待測(cè)假病毒分別為：hcv1a(h77)、hcv1b(ch35)、hcv2a(jfh1)、hcv3a(ukn3)a1.28、hcv4c(ed43)、hcv5(ukn14.4)、hcv6(ukn5.34)或vsv-g。hcv代表丙型肝炎病毒。vsv代表水皰性口炎病毒。上述各個(gè)待測(cè)假病毒中均攜帶熒光素酶報(bào)告基因。一、假病毒的制備1、hcv1a(h77)假病毒的制備(培養(yǎng)條件均為：37℃、5％co2、靜置)hcv1a(h77)假病毒的囊膜蛋白為h77毒株的囊膜蛋白，代表hcv1a亞型。hcv1a(h77)假病毒的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.；hcv1a(h77)假病毒即文獻(xiàn)中的“hcvgenotypes1a”。公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv1a(h77)假病毒具體可按如下方法制備：(1)將293t細(xì)胞接種至裝有含10％fbs的dmem培養(yǎng)基的10cm平皿內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)。(2)完成步驟(1)后，取所述平皿，用pnl4-3.luc.r-e-和pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)轉(zhuǎn)染其中的細(xì)胞(采用transmaxi轉(zhuǎn)染試劑)，然后將培養(yǎng)體系更換為新的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基并培養(yǎng)48小時(shí)。(3)完成步驟(2)后，離心并收集上清液，即為含有hcv1a(h77)假病毒的病毒液，簡(jiǎn)稱1a(h77)病毒液。2、hcv1b(ch35)假病毒的制備hcv1b(ch35)假病毒的囊膜蛋白為ch35毒株的囊膜蛋白，代表hcv1b亞型。hcvpp1bch35：參考文獻(xiàn)：mckeatingja，zhanglq，logvinoffc，flintm，zhangj，yuj，buterad，etal.diversehepatitiscvirusglycoproteinsmediateviralinfectioninacd81-dependentmanner.jvirol2004；78：8496-8505.。公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv1b(ch35)假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp1bch35)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到含有hcv1b(ch35)假病毒的病毒液，簡(jiǎn)稱1b(ch35)病毒液。3、hcv2a(jfh1)假病毒的制備hcv2a(jfh1)假病毒的囊膜蛋白為jfh1毒株的囊膜蛋白，代表hcv2a亞型。hcv2a(jfh1)假病毒的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)：si，y.etal.ahumanclaudin-1-derivedpeptideinhibitshepatitiscvirusentry.hepatology.56，507-515(2012).；hcvpp2ajfh1又稱為pcmv-e1e2(hcvpp2ajfh1)；hcv2a(jfh1)假病毒即文獻(xiàn)中的“hcvgenotype2a”。公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv2a(jfh1)假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp2ajfh1)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到2a(jfh1)病毒液。4、hcv3a(ukn3)a1.28假病毒的制備hcv3a(ukn3)a1.28假病毒的囊膜蛋白為ukn3毒株的囊膜蛋白，代表hcv3a亞型。hcvpp3aukn2.8：參考文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv3a(ukn3)a1.28假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp3aukn3)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到3a(ukn3)a1.28病毒液。5、hcv4c(ed43)假病毒的制備hcv4c(ed43)假病毒的囊膜蛋白為ed43毒株的囊膜蛋白，代表hcv4c亞型。hcvpp4ced43：參考文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv4c(ed43)假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp4ced43)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到4c(ed43)病毒液。6、hcv5(ukn14.4)假病毒的制備hcv5(ukn14.4)假病毒的囊膜蛋白為ukn14.4毒株的囊膜蛋白，代表hcv5亞型。hcvpp5aukn14.4：參考文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv5(ukn14.4)假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp5aukn14.4)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到5(ukn14.4)病毒液。7、hcv6(ukn5.34)假病毒的制備hcv6(ukn5.34)假病毒的囊膜蛋白為ukn5.34毒株的囊膜蛋白，代表hcv6亞型。hcvpp6aukn5.34：參考文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.；公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。hcv6(ukn5.34)假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-e1e2(hcvpp6aukn5.34)代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到6(ukn5.34)病毒液。8、vsv-g假病毒的制備vsv-g假病毒的囊膜蛋白為vsv-g蛋白。vsv-g假病毒的制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)：bartoschb，dubuissonj，cossetfl.infectioushepatitiscviruspseudo-particlescontainingfunctionale1-e2envelopeproteincomplexes.jexpmed2003；197：633-642.”；vsv-g假病毒即文獻(xiàn)中的“vsv-gpp”。公眾可以從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所獲得。vsv-g假病毒具體可按如下方法制備：用pcmv-vsv-g代替pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)，其它同步驟1。得到vsv-g病毒液。9、對(duì)照液的制備(1)將293t細(xì)胞接種至裝有含10％fbs的dmem培養(yǎng)基的10cm平皿內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)。(2)完成步驟(1)后，取所述平皿，用pnl4-3.luc.r-e-轉(zhuǎn)染其中的細(xì)胞(采用transmaxi轉(zhuǎn)染試劑)，然后將培養(yǎng)體系更換為新的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基并培養(yǎng)48小時(shí)。(3)完成步驟(2)后，離心并收集上清液，即為對(duì)照液。10、熒光信號(hào)的檢測(cè)分別檢測(cè)步驟1至8得到的各個(gè)病毒液以及步驟9得到的對(duì)照液的熒光信號(hào)，步驟1至8得到的各個(gè)病毒液的熒光信號(hào)均為對(duì)照液的30倍以上。二、多肽e27抑制hcv假病毒感染分別將步驟一制備的各個(gè)病毒液分別進(jìn)行如下操作(培養(yǎng)條件均為：37℃、5％co2、靜置)：1、取48孔板，每孔接種2×104個(gè)huh7.5.1細(xì)胞(采用10％fbs的dmem培養(yǎng)基)，培養(yǎng)16小時(shí)。2、完成步驟1后，取所述48孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基(200μl/孔)。3、完成步驟2后，取所述48孔板，吸棄培養(yǎng)基，每孔中加入200μl感染混合液，先在臺(tái)式離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)(30℃、2500rpm)感染1.5h，然后培養(yǎng)1.5h。感染混合液(200μl)的制備方法：將步驟一制備的病毒液、0.2μl8μg/ml聚凝胺溶液和2μlhepes緩沖液(ph7.55、2m)混合。4、完成步驟3后，取所述48孔板，加入含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基(20μl/孔)，37℃培養(yǎng)6小時(shí)。多肽e27在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：2.2nm、4.4nm、8.5nm、17nm、34nm、68nm、136nm、312nm、725nm、1250nm、2500nm、5000nm或10000nm。設(shè)置用等體積dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照甲(空白對(duì)照組)。設(shè)置用等體積含0.5％(體積比)dmso的dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照乙。每個(gè)多肽e27濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照甲和對(duì)照乙均各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。5、完成步驟4后，取所述48孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。6、完成步驟5后，取所述48孔板，棄除培養(yǎng)基，用無(wú)菌pbs緩沖液洗細(xì)胞一次，然后加入1×細(xì)胞裂解液(80μl/孔)，室溫裂解20分鐘。7、完成步驟6后，將所述48孔板的每個(gè)孔中的液相以一一對(duì)應(yīng)的方式轉(zhuǎn)移到不透光的96孔板中。8、完成步驟7后，取所述96孔板，加入luciferaseassayreagent(70-100μl/孔)，然后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度反應(yīng)了熒光素酶的活性，從而指示假病毒感染的水平。假病毒入侵效率＝試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100％。結(jié)果如圖1所示。圖1中，橫坐標(biāo)為多肽e27的濃度以10為底的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)為假病毒入侵效率。結(jié)果表明，多肽e27以劑量依賴的方式抑制hcv假病毒感染。多肽e27不抑制vsv-g假病毒感染。對(duì)照組乙的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組甲的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異。計(jì)算多肽e27對(duì)不同hcv假病毒引起細(xì)胞病變的半數(shù)抑制濃度ic50值，結(jié)果如表1所示。表1多肽e27對(duì)不同hcv假病毒的抗病毒活性ic50實(shí)施例3、e27抑制hcv病毒株感染待測(cè)hcv病毒株為：hcv1a(tncc)、hcv2a(j6cc)、hcv2b(dh8cc)、hcv3a(s52_5-5a)、hcv4a(ed43_5-5a)、hcv5a(sa13_5-5a)或hcv6a(hk6a_5-5a)。各個(gè)待測(cè)病毒株分別按照如下步驟進(jìn)行操作(培養(yǎng)條件均為：37℃、5％co2、靜置)：1、取48孔板，每孔接種2×104個(gè)huh7.5.1細(xì)胞(采用10％fbs的dmem培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。2、完成步驟1后，取所述48孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基(200μl/孔)。3、完成步驟2后，取所述48孔板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200μl含有待測(cè)hcv病毒株的dmem培養(yǎng)基(moi＝0.01)。4、完成步驟3后，取所述48孔板，加入含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基(20μl/孔)，37℃培養(yǎng)6小時(shí)。多肽e27在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：0.001894nm、0.009472nm、0.047360nm、0.236800nm、1.184000nm、5.920000nm、29.600000nm、148.000000nm或740.000000nm。設(shè)置用等體積dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照甲(空白對(duì)照組)。設(shè)置用等體積含0.5％(體積比)dmso的dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照乙。每個(gè)多肽e27濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照甲和對(duì)照乙均各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。5、完成步驟4后，取所述48孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)。6、完成步驟5后，取所述48孔板，棄除孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入多聚甲醛固定細(xì)胞，使用tritonx-100滲透后加入免疫染色的抗-hcv核心蛋白的抗體(1∶400稀釋)和irdye二抗(1∶1000稀釋)，最終通過(guò)odeyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)圖片。病毒株入侵效率＝試驗(yàn)組具有熒光信號(hào)的細(xì)胞個(gè)數(shù)/空白對(duì)照組具有熒光信號(hào)的細(xì)胞個(gè)數(shù)×100％。結(jié)果如圖2所示。圖2中，橫坐標(biāo)為多肽e27的濃度以10為底的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)為病毒株入侵效率。結(jié)果表明，多肽e27以劑量依賴的方式抑制多種病毒株感染。對(duì)照組乙的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組甲的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異。計(jì)算多肽e27對(duì)不同hcv病毒株引起細(xì)胞病變的半數(shù)抑制濃度ic50值，結(jié)果如表2所示。表2多肽e27對(duì)不同hcv病毒株的抗病毒活性ic50hcv病毒株ic501a(tncc)0.5163nm2a(j6cc)29.48nm2b(dh8cc)0.1582nm3a(s52_5-5a)11.22nm4a(ed43_5-5a)0.3650nm5a(sa13_5-5a)0.1800nm6a(hk6a_5-5a)0.3595nm實(shí)施例4、多肽e27抗體抑制hcv病毒株感染一、以多肽e27為免疫原制備多克隆抗體用e27多肽(抗原)免疫雌性blab/c小鼠，具體步驟如下：1、初次免疫：抗原劑量80微克/只，使用完全佐劑(250微升/只)，背部皮下多點(diǎn)免疫；2、第一次加強(qiáng)免疫：抗原劑量40微克/只，使用不完全佐劑(250微升/只)，背部皮下多點(diǎn)免疫；3、第二次加強(qiáng)免疫：抗原劑量40微克/只，使用不完全佐劑(250微升/只)，背部皮下多點(diǎn)免疫；4、終加強(qiáng)免疫：抗原劑量80微克/只，使用pbs緩沖液為佐劑(100微升/只)，脾內(nèi)加強(qiáng)。5、收集血清，得到多克隆抗體(命名為e27多克隆抗體)。二、制備同型抗體igg制備1、人工合成對(duì)照抗原。對(duì)照抗原的氨基酸序列如序列表的序列4所示。2、用對(duì)照抗原代替e27多肽，其他同步驟一，得到多克隆抗體(命名為同型抗體igg)。三、多肽e27抗體抑制hcv病毒株感染參照實(shí)施例3，具體差異如下：用e27多克隆抗體取代多肽e27，e27多克隆抗體在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、50.0μg/ml或100.0μg/ml(e27多克隆抗體的濃度以總蛋白濃度計(jì))；設(shè)置用同型抗體igg代替e27多克隆抗體的對(duì)照；用hcvjc-1毒株代替待測(cè)病毒株。結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，e27多克隆抗體以劑量依賴的方式抑制hcv病毒株的入侵，同型抗體igg不能抑制hcv病毒株的入侵。e27多克隆抗體對(duì)hcv病毒引起細(xì)胞病變的半數(shù)抑制濃度ic50值為9.64μg/ml。實(shí)施例5、多肽e27細(xì)胞毒性培養(yǎng)條件均為：37℃、5％co2、靜置。1、將huh7.5.1細(xì)胞以3×104個(gè)/ml的濃度加入96孔板中(每孔180μl)，96孔板周邊以無(wú)血清培養(yǎng)基封閉，培養(yǎng)24小時(shí)。2、完成步驟1后，取所述96孔板，加入含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基(每孔20μl)，培養(yǎng)48小時(shí)。多肽e27在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：1μm、4μm、5μm、20μm、25μm、50μm、100μm、200μm或400μm。設(shè)置用等體積含0.5％(體積比)dmso的dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照。各組均設(shè)置相應(yīng)的背景孔，背景孔不接種細(xì)胞，只加入含有相應(yīng)濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基或含有0.5％dmso的dmem培養(yǎng)基。每個(gè)多肽e27濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。背景孔各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。3、完成步驟2后，取所述96孔板，每孔中加入20μlmtt，培養(yǎng)4小時(shí)。4、完成步驟3后，取所述96孔板，吸去各孔內(nèi)液體，每孔中加入150μldmso，平板搖床震搖10min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光吸收，波長(zhǎng)為570nm。計(jì)算細(xì)胞存活率及多肽e27對(duì)細(xì)胞的毒性cc50值。按照下列公式計(jì)算各濃度組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率％＝(od實(shí)驗(yàn)組-od實(shí)驗(yàn)組背景)/(od對(duì)照組-od對(duì)照組背景)×100％；細(xì)胞增殖抑制率＝100％-細(xì)胞存活率％；結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4中，橫坐標(biāo)為多肽濃度以10為底的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果表明，多肽e27以劑量依賴的方式抑制huh7.5.1細(xì)胞的生長(zhǎng)，多肽e27對(duì)細(xì)胞的毒性cc50值為180.3μm。實(shí)施例6、多肽e27抑制hcv介導(dǎo)的細(xì)胞融合293t細(xì)胞作為“供體”細(xì)胞，huh7.5.1細(xì)胞作為受體細(xì)胞，只有融合細(xì)胞具有熒光素酶的活性。培養(yǎng)條件：37℃、5％co2、靜置。1、在24孔板內(nèi)接種293t細(xì)胞(采用10％fbs的dmem培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。2、完成步驟1后，取所述24孔板，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)質(zhì)粒和cmv-stop-luc質(zhì)粒(每105個(gè)細(xì)胞約轉(zhuǎn)染0.5微克pcmv-e1e2(hcvpp1ah77)質(zhì)粒和0.5微克cmv-stop-luc質(zhì)粒)并培養(yǎng)4小時(shí)，然后將培養(yǎng)基更換為新的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基并培養(yǎng)12小時(shí)。3、在24孔板內(nèi)接種huh7.5.1細(xì)胞(采用10％fbs的dmem培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)。4、完成步驟3后，取所述24孔板，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染ppr-crem質(zhì)粒(每105個(gè)細(xì)胞約轉(zhuǎn)染0.5微克ppr-crem質(zhì)粒)并培養(yǎng)4小時(shí)，然后將培養(yǎng)基更換為新的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基并培養(yǎng)12小時(shí)。5、完成步驟4后，取細(xì)胞并進(jìn)行消化。6、將步驟5得到的消化后受體細(xì)胞覆蓋在完成步驟2的供體細(xì)胞上(供體細(xì)胞與受體細(xì)胞的數(shù)量比約為1∶2)，共培養(yǎng)4-6小時(shí)。7、完成步驟6后，取所述24孔板，用融合緩沖液處理細(xì)胞1-5分鐘，然后將孔內(nèi)液體更換為含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基(每孔中加入20μl)，然后培養(yǎng)6小時(shí)。多肽e27在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：0.1μm、0.4μm、0.8μm、1.0μm、2.0μm、4.0μm、8.0μm、16.0μm或20.0μm，設(shè)置用等濃度的scramble代替多肽e27的對(duì)照甲。設(shè)置用等體積dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照乙(空白對(duì)照組)。設(shè)置用等體積含0.5％(體積比)dmso的dmem培養(yǎng)基代替“含有不同濃度的多肽e27的dmem培養(yǎng)基”的對(duì)照丙。每個(gè)多肽e27濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照甲、對(duì)照乙和對(duì)照丙均各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。8、完成步驟7后，取所述24孔板，將孔內(nèi)的培養(yǎng)基更換為新鮮的含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，培養(yǎng)12小時(shí)。9、完成步驟8后，取所述24孔板，棄除培養(yǎng)基，用無(wú)菌pbs緩沖液洗細(xì)胞一次，棄掉殘留液體，然后加入1×細(xì)胞裂解液(80μl/孔)，室溫下輕晃，裂解20分鐘。10、完成步驟9后，將所述24孔板的每個(gè)孔中的液相以一一對(duì)應(yīng)的方式轉(zhuǎn)移到不透光的96孔板中。11、完成步驟10后，取所述96孔板，加入luciferaseassayreagent(70-100μl/孔)，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了熒光素酶的活性，從而指示細(xì)胞的融合水平，并計(jì)算多肽e27對(duì)huh7.5.1細(xì)胞的抑制半數(shù)融合值。細(xì)胞融合率＝實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100％。細(xì)胞融合抑制率＝100％-細(xì)胞融合率％。結(jié)果如圖5所示。圖5中，橫坐標(biāo)為多肽濃度以10為底的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為細(xì)胞融合率。結(jié)果表明，多肽e27以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞的融合，多肽e27對(duì)huh7.5.1細(xì)胞的抑制半融合值為734.2nm。實(shí)施例7、多肽e27抗體抑制hcv介導(dǎo)的細(xì)胞融合參照實(shí)施例6，具體差異如下：使用實(shí)施例5制備的e27多克隆抗體替代多肽e27，e27多克隆抗體在培養(yǎng)體系中的濃度分別為：5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、80.0μg/ml、100.0μg/ml、120.0μg/ml、150.0μg/ml、200.0μg/ml或250.0μg/ml(多克隆抗體的濃度以總蛋白濃度計(jì))；使用同型抗體igg代替e27多克隆抗體作為對(duì)照甲。結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，mabanti-e27以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞的融合，mabanti-e27對(duì)huh7.5.1細(xì)胞的抑制半融合值為108.75μg/ml。當(dāng)前第1頁(yè)12