本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種抗水稻褐飛虱的殺蟲蛋白cry30t及其編碼基因與應用。

背景技術：

水稻(oryzasatival.)是全球耕種面積最大的糧食作物，亞洲20億人口所需熱量的80％從中攝取(jaymacleanetal.,2013)。水稻褐飛虱(nilaparvatalugens)是水稻的主要害蟲，每年能導致水稻減產(chǎn)超100萬噸，在飛虱發(fā)生嚴重的年份可達200萬噸(cheng,2015)。褐飛虱屬于半翅目(hemiptera)，頸喙亞目(auchenorrhyncha)，稻虱科(delphacidae)(bourgoin,2014)，為半變態(tài)昆蟲，全生育期分卵、若蟲、成蟲三個階段。褐飛虱食性單一，只取食栽培水稻和普通野生稻。為害時褐飛虱成、若蟲群集于稻叢基部，通過刺吸水稻韌皮部汁液為害(seoetal.,2009)，造成水稻光合產(chǎn)物的流失。同時，刺吸分泌凝固性的唾液形成“口針鞘”(wangetal.,2008)，阻礙稻株體內(nèi)水分及養(yǎng)分的運輸，嚴重時可使稻株莖稈變黑，全株枯黃死亡，甚至引起全田稻株枯死，形成所謂的“虱燒”(irri,1979)；另外，褐飛虱在產(chǎn)卵時還會利用產(chǎn)卵器劃破水稻莖稈和葉片組織，影響稻株水分和養(yǎng)分的輸送與吸收；褐飛虱還是水稻草狀叢矮病和齒葉矮縮病等水稻病毒病的蟲媒(cabauatanetal.,2009；heinrichs,1979)。自1980年以來我國每年受到褐飛虱危害的稻田面積占總種植面積的50％，造成的損失達10％～20％，嚴重時可達40％～60％。

目前，防治褐飛虱主要通過栽培管理、合理使用農(nóng)藥、利用天敵、培育抗蟲品種以及利用外源抗性基因培育轉(zhuǎn)基因水稻等方式進行。農(nóng)藥的施用往往受限于天氣條件，在高溫多雨飛虱高發(fā)的季節(jié)農(nóng)藥的效果容易受到限制，大量消耗了人力財力的同時，對環(huán)境造成污染，危害人類健康。在經(jīng)銷商的促銷及錯誤引導下農(nóng)民對農(nóng)藥的使用往往超過使用說明的建議劑量，有證據(jù)表明，農(nóng)藥的過度使用是飛虱爆發(fā)的主要原因(sogawa,2015)。培育抗蟲品種是對環(huán)境友好、最具經(jīng)濟效益的抗蟲策略。自1973年以來，國際水稻研究所(internationalriceresearchinstitute，簡稱irri)先后選育了一系列含有抗褐飛虱主基因的水稻品種：1973年培育出含bph1基因的ir26，1976年推出含bph2基因的ir36，1982年又推出含bph3基因的ir56，這些品種的育成有效地控制了褐飛虱的暴發(fā)。雖然水稻抗褐飛虱育種已經(jīng)取得了一些成績，但是依然存在一些問題。首先，抗褐飛虱基因多來源于野生稻或原始材料，抗性基因往往與生產(chǎn)不利基因連鎖，打破連鎖所需時間長；其次，目前精細定位的抗飛虱基因及主效qtl還較少；再次，由于飛虱對抗性基因的適應性導致新的生物型的產(chǎn)生，使抗性品種失 效。比如含bph1基因的ir26僅在推廣兩年后便被生物ii型的褐飛虱攻克，含bph2基因的ir36也在推廣數(shù)年后被生物型iii的褐飛虱攻克。因此，發(fā)掘和利用新的抗褐飛虱基因，采用現(xiàn)代育種技術培育具有持久水平抗蟲性的水稻品種，是抗褐飛虱水稻育種的關鍵。

轉(zhuǎn)基因技術作為常規(guī)育種技術的重要補充，具有著極高的效率和廣闊的應用前景，為抗蟲水稻培育提供了新的途徑(brookesandbarfoot,2003)。目前應用于抗褐飛虱轉(zhuǎn)基因水稻的基因主要有雪花蓮凝集素及大蒜凝集素等植物凝集素類基因。植物凝集素多數(shù)情況下對哺乳動物具有毒性，限制了此類基因在轉(zhuǎn)基因水稻上的應用。水稻內(nèi)源抗褐飛虱基因bph14和bph3已經(jīng)分別被克隆，為應用于抗飛虱轉(zhuǎn)基因水稻品種的培育提供了可能。但目前僅克隆到兩例此類基因，可用資源有限，此外，飛虱可以很快產(chǎn)生新的生物型而表現(xiàn)出對此類基因的適應性，使抗性基因失效。因此，創(chuàng)制發(fā)展對稻褐飛虱等害蟲有高毒力的新型殺蟲基因迫在眉睫。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)為將cry30fa1蛋白氨基酸序列的第1-49位氨基酸截去，且將所述cry30fa1蛋白氨基酸序列的第515位氨基酸由亮氨酸突變?yōu)楦彼帷⒌?34位氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?74位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒌?44位氨基酸由頡氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?57位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０泛偷?80位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔冶３制渌糠职被釟埢蛄胁蛔?，得到的蛋白質(zhì)，將其命名為cry30t蛋白。

上述cry30fa1蛋白為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白質(zhì)。

上述b)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

本發(fā)明所創(chuàng)制cry30t蛋白全長為638個氨基酸，其序列經(jīng)ncbiblastp分析，其結(jié)構域i的區(qū)間為：v19-i254，具有在昆蟲中腸膜上形成空洞的能力；結(jié)構域ii的區(qū)間為：t261-d465，具有與水稻褐飛虱中腸膜上受體特異結(jié)合的能力；結(jié)構域iii的區(qū)間為：n468-v628，具有穩(wěn)定蛋白空間結(jié)構等功能。本發(fā)明所創(chuàng)制蛋白分子量為71287.0da，等電點為8.00。本發(fā)明所創(chuàng)制cry30t蛋白氨基酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫中已知序列比對，同源性最高為91.99％。

本發(fā)明的另一個目的是提供編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子。

上述核酸分子為如下1)或2)或3)或4)所示的基因：

1)其編碼序列是序列表中序列1的dna分子；

2)其編碼序列是序列表中序列3的dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna分子雜交且編碼上述蛋白的dna分子；

4)與1)或2)限定的dna分子具有90％以上的同源性且編碼上述蛋白的dna分子。

本發(fā)明創(chuàng)制的cry30t蛋白編碼基因的核酸序列全長為1,914bp，其核苷酸序列為序列1，并將其優(yōu)化為水稻最優(yōu)勢密碼子，優(yōu)化后的核酸序列為序列3。序列優(yōu)化時同時考慮到5’非編碼區(qū)及3’非編碼區(qū)對基因所轉(zhuǎn)錄之mrna整體二級結(jié)構的影響，以確保mrna具有更穩(wěn)定，更利于高效翻譯其所編碼的蛋白的能力。本序列亦去除了影響mrna穩(wěn)定的一些基序，包括可能的mrna剪切位點、可能的mrna加polya位點、重復的polya及polyt序列以及一些正向或反向的重復序列。為了有效的翻譯起始，引入了kozak序列。另外，為了有效的提高翻譯效率同時引入了ω序列。應用本優(yōu)化方案所得到的序列所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因水稻株系可以高水平的表達本基因所編碼蛋白，并提供高水平的防治害蟲的能力。

本發(fā)明還有一個目的是提供下述1)-4)中的任一種生物材料：

1)含有上述核酸分子的表達盒；

2)含有上述核酸分子的重組載體；

3)含有上述核酸分子的重組菌；

4)含有上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細胞系。

本發(fā)明最后一個目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述核酸分子或上述表達盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系的新用途。

本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述核酸分子或上述表達盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在作為cry類殺蟲劑中的應用。

本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述核酸分子或上述表達盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在制備cry類殺蟲劑中的應用。

上述應用中，所述殺蟲的對象為水稻褐飛虱。

上述蛋白質(zhì)或上述核酸分子或上述表達盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在防治水稻褐飛虱中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述蛋白質(zhì)或上述核酸分子或上述表達盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在制備防治水稻褐飛虱的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明所改造cry30t與已知蛋白cry30fa1具有本質(zhì)上的不同，且對褐飛虱等刺吸式口器昆蟲具有強殺蟲活性，從而為防治稻褐飛虱等水稻害蟲 提供了新的策略，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為cry30fa1與ncbi數(shù)據(jù)庫中序列比對結(jié)果。

圖2為cry30fa1ncbiblastpcdd分析結(jié)果。

圖3為cry30t核苷酸序列pcr擴增結(jié)果。

圖4為cry30t與cry30fam氨基酸序列比對結(jié)果。

圖5為cry30t截斷結(jié)構與cry30fa1全長結(jié)構比對示意圖。

圖6為cry30t與cry30fa1蛋白質(zhì)三維機構比較。

圖7為pet28b30t的質(zhì)粒圖譜及酶切鑒定。

圖8為pet28b30t的原核表達。

圖9為pet28b30t的蛋白純化及定量。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例構建過程中質(zhì)粒提取、酶切、dna的回收、純化均按分子克隆中的方法進行(sambrookandrussell2001)。

下述實施例中的含有cry30fa1基因的質(zhì)粒pet22b30在文獻“cloningandcharacterizationoftwonovelcrystalproteingenes,cry54aa1andcry30fa1,frombacillusthuringiensisstrainbtmc28”中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。

下述實施例中涉及的概念及其定義如下：

“殺蟲蛋白”是指能夠控制昆蟲的的生存、生長以及繁殖的蛋白，并且主要是通過殺死昆蟲的方式實現(xiàn)是生物活性。

“δ-內(nèi)毒素”是指由蘇云金芽孢桿菌在產(chǎn)生的，具有對不同昆蟲具有毒性的蛋白質(zhì)。

“靶標害蟲”是指對某一特定殺蟲蛋白敏感的昆蟲稱為此殺蟲蛋白的靶標害蟲，與此對應的對此蛋白不敏感的害蟲稱為非靶標害蟲。

“結(jié)構域”：是蛋白質(zhì)中的一類結(jié)構單元，是構成蛋白質(zhì)三級結(jié)構的基本單元。它由不同的α螺旋、β折疊或者其它蛋白質(zhì)二級結(jié)構組成，具有相對獨立的空間結(jié)構和功能。

“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區(qū)前面(5’非編碼區(qū))和后面(3’非編碼區(qū))的調(diào)控序列。

“植物”是指處于任何發(fā)育階段的任何植物，特別是種子植物。

“轉(zhuǎn)化”是指將源核酸引入至一種宿主細胞或生物中的一個過程。

“外源基因”是指正常情況下宿主生物中沒有的、通過基因轉(zhuǎn)移導入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會導致一種內(nèi)源基因的編碼序列的一個或幾個額外拷貝的出現(xiàn)。

“基序”是指dna，蛋白質(zhì)等生物大分子中的保守序列，在反式作用因子的結(jié)構中，基序一般指構成任何一種特征序列的基本結(jié)構(既指此具功能的基本結(jié)構，也指編碼此結(jié)構的蛋白質(zhì)/dna序列)，作為結(jié)構域中的亞單元，其功能是體現(xiàn)結(jié)構域的多種生物學作用。

“mrna剪切”是指從dna模板鏈轉(zhuǎn)錄出的最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去內(nèi)含子，并將外顯子連接起來形成一個連續(xù)的rna分子的過程。

“密碼子”是指信使rna鏈上決定一個氨基酸的相鄰的三個堿基亦稱三聯(lián)體密碼。同一個氨基酸可由不同的密碼子編碼稱為“密碼子的簡并性”。

“密碼子偏愛性”是指由于密碼子的簡并性，每個氨基酸至少對應1種密碼子，最多有6種對應的密碼子。不同物種、不同生物體的基因密碼子使用存在著很大的差異。各種生物體似乎更偏愛使用某些同義三聯(lián)密碼子。其中在某一物種中使用頻率高的密碼子稱為該物種的“優(yōu)勢密碼子”。

“保護堿基”是指限制性內(nèi)切酶識別特定的dna序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到dna雙鏈并發(fā)揮切割dna作用是有很大影響的，被稱為保護堿基。

“半致死濃度”是指在動物急性毒性試驗中，使受試動物半數(shù)死亡的毒物濃度，用lc50表示。

實施例1、新型殺蟲蛋白基因cry30t的獲得

一、新型殺蟲蛋白基因cry30t的獲得

1、cry30fa1的測序分析

將含有cry30fa1基因的質(zhì)粒pet22b30轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株bl21(de3)并選取3個獨立的單克隆用t7啟動子引物(5’-taatacgactcactataggg-3’)進行了測序驗證。并根據(jù)測序結(jié)果翻譯成氨基酸序列。

結(jié)果如圖1所示，pet22b30的氨基酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫提交序列(aci22625.1)同源性為98.98％，存在7個氨基酸突變。任何一個氨基酸的突變都可能嚴重的影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構和功能，這表明獲得的突變后的cry30fa1基因是一條新的基因，并命名為cry30fam。

為了進一步的序列優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程改造，利用ncbiblastp對cry30fa1的氨基酸序列進行了保守結(jié)構分析，在ncbi保守結(jié)構域數(shù)據(jù)庫(conserveddomaindatabase, cdd)中得到三個結(jié)構域的具體位點，其中endotoxin_n、endotoxin_m和delta_endotoxin_c分別對應cry蛋白的結(jié)構域i，結(jié)構域ii和結(jié)構域iii，其ncbi數(shù)據(jù)庫結(jié)構示意圖如圖2所示。從圖2可以看出，在cry30fa1的n端，結(jié)構域i前有一段短的非功能冗余序列，可能對蛋白的殺蟲活性造成不利影響。根據(jù)cdd分析結(jié)果，cry30fa1的結(jié)構域i的區(qū)間為：v68-i303，結(jié)構域ii的區(qū)間為：t310-d514，結(jié)構域iii的區(qū)間為：n517-v677。

2、cry30t基因的獲得

(1)引物的設計

根據(jù)以上結(jié)構域區(qū)間分析結(jié)果，在cry30fa1結(jié)構域i的n末端v68向上游方向?qū)ふ业谝粋€甲硫氨酸m50，并根據(jù)對應的核苷酸序列設計引物，上游引物5’端帶有bamhi酶切位點及保護堿基，下游引物5’端帶有hindiii酶切位點及保護堿基，引物序列如下所示(下劃線標識引物所帶酶切位點)：

cry30tfb:5’-tttgtggatcctatgtgtcaaactattact-3’

cry30r:5’-gggcaaagcttgttcactggacaagcaaatgc-3’

(2)pcr擴增

以pet22b30質(zhì)粒為模板，采用cry30tfb和cry30r進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，即為截短后的cry30fa1。將pcr擴增產(chǎn)物電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。電泳結(jié)果表明，pcr擴增得到大小約為1900bp的產(chǎn)物。將pcr擴增產(chǎn)物進行切膠回收，并插入peasy-blunt克隆載體，隨后每個構建挑取3陽性個克隆，用通用引物m13f/r進行測序。

測序結(jié)果表明：pcr擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列1所示，序列1所示的基因編碼的氨基酸序列如序列2所示。將序列2所示的氨基酸序列用dnaman8.0進行序列比對，比對結(jié)果表明，截短后的氨基酸序列與全長氨基酸序列相比，除n端去除部分冗余序列外，其它部分沒有引入突變。三個結(jié)構域在序列上的分布分別用藍綠紅三種顏色下劃線進行標識，序列比對結(jié)果如圖4所示。

將截短后的蛋白序列進行ncbicdd數(shù)據(jù)庫分析，證實截短后的氨基酸序列n端第一個結(jié)構域結(jié)構依然完整，沒有受到破壞，截短前后結(jié)構比較如錯誤！未找到引用源。所示，可以看出在保證結(jié)構域完整的情況下已經(jīng)將原始序列盡可能的截短了，截短后的cry蛋白從一級結(jié)構上看更加緊密。cry30fa1截短前后的參數(shù)對比如其中，cry30fa1為截短前，30t為截短后。

表1所示。其中，cry30fa1為截短前，30t為截短后。

表1、cry30fa1截短前后的參數(shù)比較

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構決定蛋白的功能。為了進一步分析截短是否影響到兩個蛋白的三級結(jié)構，利用swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)數(shù)據(jù)庫分析了截短前后蛋白的三級結(jié)構，結(jié)果如錯誤！未找到引用源。所示。通過構象比對可以看出，改造前后僅有結(jié)構域i的環(huán)區(qū)(loop)有輕微的構象差異，最明顯的是位于cry30fa1n端s233-s240的環(huán)區(qū)，其它結(jié)構域的構象沒有明顯改變。這樣的輕微構象變化通常不會影響蛋白的活性。

3、cry30t基因的序列優(yōu)化

將cry30t基因的序列進行優(yōu)化，優(yōu)化后的cry30t基因序列如序列3所示，將序列3所示的基因命名為cry30t，該基因編碼的蛋白命名為cry30t，其氨基酸序列為序列表中序列2。cry30t蛋白為將cry30fa1蛋白(cry30fa1蛋白的氨基酸序列為序列4)的第1-49位氨基酸截去，且將cry30fa1蛋白的第515位氨基酸由亮氨酸突變?yōu)楦彼?、?34位氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)槔野彼?、?74位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?、?44位氨基酸由頡氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?57位氨基酸由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰⒌?80位氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼岷蟮玫降牡鞍踪|(zhì)。優(yōu)化的具體方法如下：優(yōu)化采用金斯瑞公司密碼子優(yōu)化軟件optimumgene^tm，采用水稻(oryzasativasubsp.indica)優(yōu)勢密碼子，去除xmai、kpni、noti和xhoi等酶切位點。序列優(yōu)化時同時考慮到5’非編碼區(qū)及3’非編碼區(qū)對基因所轉(zhuǎn)錄之mrna整體二級結(jié)構的影響，去除影響mrna穩(wěn)定的一些基序，包括可能的mrna剪切位點、可能的mrna加polya位點、重復的polya及polyt序列以及一些正向或反向的重復序列。另外，加入了kozak序列gccgccatgg及ω序列。優(yōu)化后的cry30t基因序列與優(yōu)化前的參數(shù)比較如下表2所示。

表2、cry30t基因優(yōu)化前后參數(shù)比較

二、殺蟲晶體蛋白cry30t的原核表達及純化

1、重組載體的構建

(1)將上述實施例1獲得的pcr產(chǎn)物(優(yōu)化前)經(jīng)1％瓊脂糖凝膠6v/cm，20min分離后從瓊脂糖中切出目標條帶，并用svgelandpcrclean-upsystem試劑盒純化回收，得到回收產(chǎn)物。

(2)將回收產(chǎn)物(cry30t基因)用bamhi及hindiii雙酶切(全部酶切)，并連接入同是bamhi及hindiii雙酶切的原核表達載體pet28b(100ng/μl×45μl)。酶切產(chǎn)物再次經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠6v/cm，20min分離并用svgelandpcrclean-upsystem試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物16℃連接1h。其中，連接酶購自neb公司；t4dnaligase(貨號為m0202l)。

(3)連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化trans1-t1phageresistant化學感受態(tài)細胞(貨號為cd501)，并涂布含50mg/μlkanamycinlb平板(1llb平板配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，瓊脂粉15g，121℃高壓滅菌20min)。

第二天挑單克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含瓊脂的lb液體培養(yǎng)基(1llb液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，121℃高壓滅菌20min)中，37℃，200rpm搖菌12h，用plussvminiprepsdnapurificationsystem提取質(zhì)粒用ndei/xhoi進行酶切鑒定，結(jié)果見圖7a。酶切鑒定正確后送睿博興科公司進行測序，結(jié)果表明該質(zhì)粒為將序列表中序列1所示的cry30t基因插入pet28b載體的bamhi和hindiii酶切位點間，且保持pet28b載體的其他序列不變得到的載體，將其命名為pet28b30t，其結(jié)構見圖7b。

將序列5所示的cry30fa1蛋白的編碼基因序列插入pet28b載體的bamhi和hindiii酶切位點間，且保持pet28b載體的其他序列不變得到的載體，將其命名為pet28b30fa1。

2、重組菌的構建及目的蛋白的表達和純化

將上述重組載體pet28b30t轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株transbl21(de3)(貨號：cd601)，轉(zhuǎn)化操作按照產(chǎn)品說明進行操作，得到重組菌bl21(de3)/pet28b30t。

采用同樣的方法將pet28b空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株transbl21(de3)中，得到重組菌bl21(de3)/pet28b。

采用同樣的方法將pet28b30fa1轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株transbl21(de3)中，得到重組菌bl21(de3)/pet28b30fa1。

第二天分別挑選重組菌bl21(de3)/pet28b30t、bl21(de3)/pet28b和bl21(de3)/pet28b30fa1單克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含瓊脂的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌12h。然后按照1:100接入新鮮的含50mg/μlkanamycin的100mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌，2h左右檢測od600值，當od600＝0.6時取500ul未誘導樣品作為陰性對照。加入終濃度為1mm的iptg，并每2h取500ul 誘導樣品，重組菌bl21(de3)/pet28b的樣品只取第6個小時的樣品。誘導6個小時后將各樣品12000rpm離心1min加50μl1×pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,ph7.4)渦旋混勻，加50μl2×sds-pageloadingbuffer(120mmtris-hcl6.8,20％glycerol,4％sds,3％β-mercaptoethanol,0.02％bromophenolblue)混勻，沸水浴5min，8％sds-page凝膠電泳檢測。

結(jié)果如圖8所示，其中，m:proteinmarkeri；28b-:pet28b空載體未誘導對照；28b+:pet28b空載體誘導對照；0:pet28b30t未誘導對照；2～8：pet28b30t誘導結(jié)果。誘導條帶大小為71.3kda，與理論相符，說明蛋白cry30t蛋白在大腸桿菌中得到誘導表達。而重組菌bl21(de3)/pet28b30fa1未誘導表達出蛋白。

上述純化過程為：挑選單克隆于10ml含50mg/μlkanamycin不含瓊脂的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌12h。然后按照1:100接入新鮮的含50mg/μlkanamycin的200mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌，2h左右檢測od600值，當od600＝0.6時加入終濃度為1mm的iptg，16℃，200rpm誘導過夜。收集過夜誘導表達菌體，10,000g離心10min收集菌體。棄上清，用20ml1×ni-nta結(jié)合緩沖液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,10mm咪唑)重懸。并將重懸液置于大小合適的容器中，200w，10s，10s，超聲至澄清。裂解物14,000g離心20min去除細胞碎片。離心后上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾(nmlsyringefilters-17598)，與ni-ntahis·bind樹脂混合，旋轉(zhuǎn)混合器200rpm，4℃結(jié)合1h。用4ml1×ni-nta漂洗緩沖液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,20mm咪唑)漂洗2次，用1ml1×ni-nta洗脫緩沖液(50mmnah2po4,ph8.0,300mmnacl,250mm咪唑)洗脫，收集洗脫液。

將洗脫液用sds-page檢測，結(jié)果如圖9。洗脫后的蛋白用1×pbs透析緩沖液(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,10％v/v甘油,ph10.0)，4℃透析12h，中間換兩次緩沖液。透析后的蛋白加入終濃度為10％的無菌甘油保存于-80℃。將bsa標準品倍比稀釋成1mg/ml,0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.125mg/ml,0.0625mg/ml共5個濃度梯度，將標準品及待測樣品均上樣10μl，根據(jù)bsa標準品建立標準曲線，并根據(jù)擬合公式計算出cry30t的濃度為250ng/μl。

實施例2、殺蟲晶體蛋白cry30t抗蟲生物活性測定

供試蟲源：水稻褐飛虱(nilapavatalugens)為中國水稻所，賴鳳香老師實驗室提供。

供試樣品：實施例1制備的抗稻褐飛虱蛋白cry30t，為原核表達純化可溶蛋白，-80℃保存；對照(ck)：純?nèi)斯わ暳稀?/p>

實驗地點：委托中國水稻所賴鳳香老師實驗室進行。

實驗方法：實驗于中國水稻所人工氣候培養(yǎng)室進行，環(huán)境溫度為：27±1℃。飛虱飼喂采用全人工飼料，飼育器為長15cm，直徑2.5cm的無底的圓筒形玻璃器皿，飼料室由雙層拉薄的parafilm膜夾飼料液滴組成。

生測時將各待測樣品進行50μg/μl、100μg/μl及200μg/μl終濃度的梯度稀釋混入人工飼料飼喂飛虱，并設定無蛋白添加的純陰性對照(ck)。

實驗具體方案為：每管接初孵(1齡)若蟲25頭后用紗布封口，平放，用黑布遮光保濕，只露出parafilm膜封口端。每處理設4次重復，每2天查蟲，記錄活蟲數(shù)。以第6天統(tǒng)計數(shù)據(jù)計算其對褐飛虱的半數(shù)致死濃度lc50，具體結(jié)果見表3。

表3、30t及54t蛋白的褐飛虱生物活性測試

以上結(jié)果表明，殺蟲蛋白cry30t對水稻褐飛虱具有較強的殺蟲活性。