本發(fā)明屬于海藻多糖的提取技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法。
背景技術(shù)：
海藻是生長在海中的藻類，一般而言，藻類主要可分為綠藻、褐藻、紅藻及藍(lán)藻等四類，是植物界的隱花植物，藻類包括數(shù)種不同類以光合作用產(chǎn)生能量的生物。海藻富含營養(yǎng)成分和功能性成分，從海藻提煉出來的藻膠或海藻多糖具有特殊乳化性、凝膠性和藥用價值、有增強(qiáng)免疫力及抗癌活性，因而逐漸應(yīng)用于工業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中。
海藻多糖具有抑制病毒、降低膽固醇、降血糖及降血脂等效果。其中，褐藻糖膠是一種存在于所有褐藻中的細(xì)胞多糖。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補(bǔ)體激活及吸收重金屬等功能，為一種重要的機(jī)能性保健素材，可將其用于獸藥的制備。因此，如何從海藻中萃取出褐藻糖膠為一重要課題。
褐藻糖膠萃取方法，
一種是為用乙醇、丙酮和氯仿進(jìn)行預(yù)處理，接著將樣品經(jīng)脫脂、脫鹽和干燥后得干粉，再以熱水萃取得到粗萃物，最后將粗萃物進(jìn)一步純化可得褐藻糖膠。此方法所制備的褐藻糖膠的萃取率為干粉重量的6.5％。
一種是將藻體切成小片，浸在甲醛中，再以熱水萃取得到粗萃物，最后將粗萃物進(jìn)一步純化可得褐藻糖膠。
一種是用甲醇預(yù)處理后，以鹽酸萃取預(yù)處理物，離心后取沉淀物再次萃取，合并上清液，用氫氧化鈉中和，真空蒸發(fā)至干后溶于0.5公升水而制備為粗萃物，最后將粗萃物進(jìn)一步純化可得褐藻糖膠。此方法所制備的褐藻糖膠的萃取率為干粉重量的27．2％。
現(xiàn)有的提取方法存在以下不足：
（1）以上方法不能徹底破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，而使細(xì)胞壁內(nèi)的褐藻糖膠充分釋放出來，提取率低；
（2）產(chǎn)品外觀為淺黃色，不夠美觀，還留有藻腥味，影響制品的再次利用；
（3）使用大量的乙醇、丙酮、氯仿和甲醇等有機(jī)溶液無機(jī)溶液進(jìn)行處理，不夠環(huán)保。
生物酶解法具有針對性強(qiáng)，提取效率高的優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)利用生物酶解法提取褐藻糖膠方法還比較少，但也存在有效物質(zhì)含量低的缺陷。
因此，如何發(fā)展一種可改善上述技術(shù)缺陷的褐藻糖膠提取方法，為相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域急需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法。
本發(fā)明提供的褐藻糖膠提取方法，采用生物酶解法，基于海帶細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分基礎(chǔ)上，分階段，適量地加相關(guān)酶，以使細(xì)胞壁徹底地裂解，將其中的褐藻糖膠充分的釋放出來，以此提高褐藻糖膠的提取率；在提取過程中加入改性凹凸棒土進(jìn)行脫色和去除腥味，使制品外觀更加純凈；另外，簡化提取步驟，減少化學(xué)原料的使用，達(dá)到環(huán)保的目的。
根據(jù)本發(fā)明提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量5-7倍的水，攪拌均勻，浸泡12-36小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在4.5-6.5之間，溫度控制在45-55℃之間，反應(yīng)8-12小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.0-10.0之間，溫度控制在40-70℃之間，反應(yīng)7-12小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.0-9.0之間，溫度控制在30-60℃之間，反應(yīng)3-11小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5-7％的氯化鈉和重量10-15 倍的水，在50-80℃的溫度條件下，反應(yīng)120-160分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其0.2-5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味20-40min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)玫疆a(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為90-94％的酒精，脫水15-30min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1。
優(yōu)選地，所述步驟（3）中酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的9-11%。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中堿性果膠酶加入量為步驟（1）中加水后漿液重量的6-10%。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中蛋白酶加入量為步驟（1）中加水后漿液重量的3-7%。
優(yōu)選地，步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在5.5之間，溫度控制在48℃，反應(yīng)9小時。
優(yōu)選地，所述步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.5，溫度控制在52℃，反應(yīng)8小時。
優(yōu)選地，所述步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.9，溫度控制在42℃，反應(yīng)7小時。
優(yōu)選地，向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入700-800U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的10-15％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8-9％的NaOH溶液，調(diào)pH至7-9，在20-45℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3-4小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖。
優(yōu)選地，所述加入酒精質(zhì)量濃度為80-90%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
（1）本發(fā)明提供的褐藻糖膠提取方法，采用生物酶解法，基于海帶細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分基礎(chǔ)上，分階段，適量地加酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶，以使細(xì)胞壁徹底地裂解，將其中的褐藻糖膠充分的釋放出來，以此提高褐藻糖膠的提取率；
（2）本發(fā)明提取過程中使用到多種酶，如酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶等，由于酶的特性限制，其生物活性受到溫度、PH值的因素的影響，本發(fā)明在酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶各自最適溫度范圍和PH范圍條件下進(jìn)行生物酶解，在各類酶生物活性最大的條件下提取褐藻糖膠，可最大程度地將褐藻糖膠從海帶細(xì)胞壁中分離出來，提高提取率，且提取過程安全環(huán)保；
（3）本發(fā)明在提取過程中加入改性凹凸棒土進(jìn)行脫色和去除腥味，使制品外觀更加純凈；
（4）本發(fā)明簡化提取步驟，減少化學(xué)原料的使用，達(dá)到環(huán)保的目的；
（5）本發(fā)明中使用的改性凹凸棒土，凹凸棒土是一種具有特殊層鏈狀結(jié)構(gòu)的天然納米無機(jī)物，具有較大的比表面積，吸附性強(qiáng)，脫色能力強(qiáng)，吸附能力好，具有脫色率高、不含殘留酸等諸多優(yōu)點(diǎn)。凹凸棒石本身具有一定的L酸中心和B酸中心，通過改性后，可增強(qiáng)凹凸棒土的酸性，提高其與游離脂肪酸、蠟質(zhì)、色素等雜質(zhì)的結(jié)合能力，從而能有效地吸附油脂中的色素等雜質(zhì)，是一種性能優(yōu)異的吸附劑和脫色劑。本發(fā)明將其加入進(jìn)行脫色和除腥，可使提取的褐藻糖膠外觀好，無腥味；
（6）本發(fā)明提取的褐藻糖膠具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補(bǔ)體激活及吸收重金屬等作用，因此可用于獸藥的制備。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明提供的褐藻糖膠提取方法，采用生物酶解法，基于海帶細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分基礎(chǔ)上，分階段，適量地加相關(guān)酶，以使細(xì)胞壁徹底地裂解，將其中的褐藻糖膠充分的釋放出來，以此提高褐藻糖膠的提取率；在提取過程中加入改性凹凸棒土進(jìn)行脫色和去除腥味，使制品外觀更加純凈；另外，簡化提取步驟，減少化學(xué)原料的使用，達(dá)到環(huán)保的目的。
本發(fā)明提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量5-7倍的水，攪拌均勻，浸泡12-36小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在4.5-6.5之間，溫度控制在45-55℃之間，反應(yīng)8-12小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.0-10.0之間，溫度控制在40-70℃之間，反應(yīng)7-12小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.0-9.0之間，溫度控制在30-60℃之間，反應(yīng)3-11小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5-7％的氯化鈉和重量10-15 倍的水，在50-80℃的溫度條件下，反應(yīng)120-160分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其0.2-5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味20-40min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)玫疆a(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為90-94％的酒精，脫水15-30min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1。
優(yōu)選地，所述步驟（3）中酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的9-11%。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中堿性果膠酶加入量為步驟（1）中加水后漿液重量的6-10%。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中蛋白酶加入量為步驟（1）中加水后漿液重量的3-7%。
優(yōu)選地，步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在5.5，溫度控制在48℃，反應(yīng)9小時。
優(yōu)選地，所述步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.5，溫度控制在52℃，反應(yīng)8小時。
優(yōu)選地，所述步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.9，溫度控制在42℃，反應(yīng)7小時。
優(yōu)選地，向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入700-800U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的10-15％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8-9％的NaOH溶液，調(diào)pH至7-9，在20-45℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3-4小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖。
優(yōu)選地，所述加入酒精質(zhì)量濃度為80-90%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
（1）本發(fā)明提供的褐藻糖膠提取方法，采用生物酶解法，基于海帶細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分基礎(chǔ)上，分階段，適量地加酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶，以使細(xì)胞壁徹底地裂解，將其中的褐藻糖膠充分的釋放出來，以此提高褐藻糖膠的提取率；
（2）本發(fā)明提取過程中使用到多種酶，如酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶等，由于酶的特性限制，其生物活性受到溫度、PH值的因素的影響，本發(fā)明在酸性纖維素酶、半纖維素酶、堿性果膠酶、蛋白酶各自最適溫度范圍和PH范圍條件下進(jìn)行生物酶解，在各類酶生物活性最大的條件下提取褐藻糖膠，可最大程度地將褐藻糖膠從海帶細(xì)胞壁中分離出來，提高提取率，且提取過程安全環(huán)保；
（3）本發(fā)明在提取過程中加入改性凹凸棒土進(jìn)行脫色和去除腥味，使制品外觀更加純凈；
（4）本發(fā)明另外，簡化提取步驟，減少化學(xué)原料的使用，達(dá)到環(huán)保的目的；
（5）本發(fā)明中使用的改性凹凸棒土，凹凸棒土是一種具有特殊層鏈狀結(jié)構(gòu)的天然納米無機(jī)物，具有較大的比表面積，吸附性強(qiáng)，脫色能力強(qiáng)，吸附能力好，具有脫色率高、不含殘留酸等諸多優(yōu)點(diǎn)。凹凸棒石本身具有一定的L酸中心和B酸中心，通過改性后，可增強(qiáng)凹凸棒土的酸性，提高其與游離脂肪酸、蠟質(zhì)、色素等雜質(zhì)的結(jié)合能力，從而能有效地吸附油脂中的色素等雜質(zhì)，是一種性能優(yōu)異的吸附劑和脫色劑。本發(fā)明將其加入進(jìn)行脫色和除腥，可使提取的褐藻糖膠外觀好，無腥味；
（6）本發(fā)明提取的褐藻糖膠具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補(bǔ)體激活及吸收重金屬等作用，因此可用于獸藥的制備。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量7倍的水，攪拌均勻，浸泡12小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的11%，攪拌均勻，PH控制在4.5之間，溫度控制在55℃之間，反應(yīng)8小時，冷卻，得產(chǎn)品一，由于PH控制在6.5，溫度控制在45℃的時候，酸性纖維素酶、半纖維素酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可將細(xì)胞壁中含有的纖維素酶解，從而破壞細(xì)胞壁，而使其中的褐藻糖膠釋放出來；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的10%，攪拌均勻，PH控制在8.0，溫度控制在70℃，反應(yīng)7小時，冷卻，得產(chǎn)品二。細(xì)胞壁的化學(xué)組成是胞間層基本上是由果膠質(zhì)組成，果膠質(zhì)是細(xì)胞壁主要的成分，如果植物組織中的果膠質(zhì)用果膠酶分解掉，細(xì)胞就會離散，因此本發(fā)明用果膠酶來酶解果膠質(zhì)，使細(xì)胞壁離散，同時果膠酶的最高活性條件是PH在10.0，溫度控制在40℃，在此條件下，酶解反應(yīng)較為徹底，從而破壞細(xì)胞壁，而使其中的褐藻糖膠釋放出來；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的7%，攪拌均勻，PH控制在6.0，溫度控制在60℃，反應(yīng)3，冷卻，得產(chǎn)品三。蛋白質(zhì)也是細(xì)胞壁成分的重要組成部分，在PH為在9.0，溫度控制在30℃條件下，蛋白酶的活性也是最高的，可以充分分解細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞壁的離散，而使其中的褐藻糖膠釋放出來；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量6％的氯化鈉和重量11 倍的水，在60℃的溫度條件下，反應(yīng)135分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物。褐藻酸在一般情況下是不穩(wěn)定的，將其與鹽結(jié)合成鹽可穩(wěn)定存在；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其1.5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味25min，得產(chǎn)品四。一般工藝提取出來的褐藻糖膠是淡黃色的，外觀不好，且具有海藻腥味，加入改性凹凸棒進(jìn)行脫色和除腥，由于改性凹凸棒具有加大的比表面積，使其具有較強(qiáng)的吸附性，因此對褐藻糖膠的顏色和氣味上具有很好的調(diào)節(jié)效果；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)?，得到產(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六。由于前面提取步驟中有各種酶殘余，以及細(xì)胞壁離散后產(chǎn)生的雜質(zhì)，因此需要進(jìn)行離心除雜，以保留褐藻糖膠，保證其純度；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為92％的酒精，脫水28min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1，通過酒精脫水，可提取純度較高的褐藻糖膠。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入750U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的12％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8％的NaOH溶液，調(diào)pH至7，在28℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖，所述加入酒精質(zhì)量濃度為83%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。褐藻糖膠在褐藻糖膠裂解酶的作用下分解，可得到聚合度較低的低聚糖。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量5倍的水，攪拌均勻，浸泡12小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的9%，攪拌均勻，PH控制在6.5，溫度控制在45℃，反應(yīng)12小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的6%，攪拌均勻，PH控制在10.0，溫度控制在40℃，反應(yīng)12小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的7%，攪拌均勻，PH控制在9.0，溫度控制在30℃，反應(yīng)11小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5％的氯化鈉和重量13 倍的水，在55℃的溫度條件下，反應(yīng)130分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物。褐藻酸在一般情況下是不穩(wěn)定的，將其與鹽結(jié)合成鹽可穩(wěn)定存在；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其3.5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味35min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)?，得到產(chǎn)品五；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為93％的酒精，脫水20min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1，通過酒精脫水，可提取純度較高的褐藻糖膠。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入700-800U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的12％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8％的NaOH溶液，調(diào)pH至7-9，在35℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖，所述加入酒精質(zhì)量濃度為88%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。褐藻糖膠在褐藻糖膠裂解酶的作用下分解，可得到聚合度較低的低聚糖。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量5-7倍的水，攪拌均勻，浸泡12-36小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的9-11%，攪拌均勻，PH控制在4.5-6.5之間，溫度控制在45-55℃之間，反應(yīng)8-12小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的6-10%，攪拌均勻，PH控制在8.0-10.0之間，溫度控制在40-70℃之間，反應(yīng)7-12小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的3-7%，攪拌均勻，PH控制在6.0-9.0之間，溫度控制在30-60℃之間，反應(yīng)3-11小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5-7％的氯化鈉和重量10-15 倍的水，在50-80℃的溫度條件下，反應(yīng)120-160分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物。褐藻酸在一般情況下是不穩(wěn)定的，將其與鹽結(jié)合成鹽可穩(wěn)定存在；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其0.2-5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味20-40min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)玫疆a(chǎn)品五；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為90-94％的酒精，脫水15-30min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1，通過酒精脫水，可提取純度較高的褐藻糖膠。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入700-800U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的10-15％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8-9％的NaOH溶液，調(diào)pH至7-9，在20-45℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3-4小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖，所述加入酒精質(zhì)量濃度為80-90%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。褐藻糖膠在褐藻糖膠裂解酶的作用下分解，可得到聚合度較低的低聚糖。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量7倍的水，攪拌均勻，浸泡12小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在5.5之間，溫度控制在48℃，反應(yīng)9小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.5，溫度控制在52℃，反應(yīng)8小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.9，溫度控制在42℃，反應(yīng)7小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量7％的氯化鈉和重量10倍的水，在80℃的溫度條件下，反應(yīng)120分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其5％的改性凹凸棒土，脫色除腥味20min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)玫疆a(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為94％的酒精，脫水15min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1。
所述步驟（3）中酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的11%。
所述步驟（4）中堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的6%。
所述步驟（4）中蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的7%。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入800U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的10％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為9％的NaOH溶液，調(diào)pH至7，在45℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖。
優(yōu)選地，所述加入酒精質(zhì)量濃度為90%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。
實(shí)施例5
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量5倍的水，攪拌均勻，浸泡36小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在5.5之間，溫度控制在48℃，反應(yīng)9小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.5，溫度控制在52℃，反應(yīng)8小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.9，溫度控制在42℃，反應(yīng)7小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5％的氯化鈉和重量15 倍的水，在50℃的溫度條件下，反應(yīng)160分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其0.2％的改性凹凸棒土，脫色除腥味40min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)?，得到產(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為90％的酒精，脫水30min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1。
所述步驟（3）中酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的9%。
所述步驟（4）中堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的10%。
所述步驟（4）中蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的3-7%。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入700U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的15％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為8％的NaOH溶液，調(diào)pH至9，在20℃的溫度條件下酶解反應(yīng)4小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖。
所述加入酒精質(zhì)量濃度為80%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。
實(shí)施例6
本實(shí)施例提供的一種生物酶解法提取褐藻糖膠的方法，包括如下步驟：
步驟（1）：海帶預(yù)處理，清洗海帶，切成小段、研磨成漿液；
步驟（2）：向漿液中加入漿液重量6倍的水，攪拌均勻，浸泡30小時后，將漿液轉(zhuǎn)入酶解容器內(nèi)；
步驟（3）：向酶解容器內(nèi)加入酸性纖維素酶、半纖維素酶，攪拌均勻，PH控制在5.5之間，溫度控制在48℃，反應(yīng)9小時，冷卻，得產(chǎn)品一；
步驟（4）：向產(chǎn)品一加堿性果膠酶，攪拌均勻，PH控制在8.5，溫度控制在52℃，反應(yīng)8小時，冷卻，得產(chǎn)品二；
步驟（5）：向產(chǎn)品二加蛋白酶，攪拌均勻，PH控制在6.9，溫度控制在42℃，反應(yīng)7小時，冷卻，得產(chǎn)品三；
步驟（6）：向產(chǎn)品三中加入其重量5-7％的氯化鈉和重量13 倍的水，在560℃的溫度條件下，反應(yīng)140分鐘，得到褐藻酸鈉膠狀物；
步驟（7）：向褐藻酸鈉膠狀物加入重量為其3％的改性凹凸棒土，脫色除腥味30min，得產(chǎn)品四；
步驟（8）：將得到的產(chǎn)品四通過離心機(jī)分離出殘?jiān)?，得到產(chǎn)品五；用適量水洗滌殘?jiān)?，再次離心，得到產(chǎn)品六；
步驟（9）：向產(chǎn)品六加入質(zhì)量濃度為93％的酒精，脫水25min，得到固相褐藻糖膠，酒精與產(chǎn)品六的體積比為1.5∶1。
所述步驟（3）中酸性纖維素酶、半纖維素酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的10%。
所述步驟（4）中堿性果膠酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的7%。
所述步驟（4）中蛋白酶加入量分別為步驟（1）中加水后漿液重量的4%。
向所述步驟（7）得到的產(chǎn)品四中加入750U/g褐藻糖膠裂解酶進(jìn)行酶解，加入量為產(chǎn)品四重量的13％，攪拌均勻，再加質(zhì)量濃度為9％的NaOH溶液，調(diào)pH至8，在35℃的溫度條件下酶解反應(yīng)3小時，得到褐藻膠裂解酶酶解液，將褐藻膠裂解酶酶解液通過離心機(jī)分離獲得濾液，將濾液用酒精脫水得到固相褐藻糖膠寡糖。
所述加入酒精質(zhì)量濃度為85%，酒精與濾液的體積比為1.4∶1。
以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。