本發(fā)明屬于海洋活性物質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海藻多糖提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

海洋面積遼闊，海洋藻類植物來源豐富，海藻多糖正逐步成為生物多糖的主要來源之一。由于海藻生存環(huán)境特異，海藻多糖具有某些獨(dú)特的生理活性，如：海帶多糖可降低脾臟內(nèi)過氧化物含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性，達(dá)到抗腫瘤的目的；紫菜多糖、硫酸甘糖酯等具有抗血栓、改善微循環(huán)等作用；海帶多糖、紫菜多糖等對(duì)機(jī)體細(xì)胞有保護(hù)功能。越來越多的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出海藻多糖具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，褐藻多糖是其中的重要組成部份，它包括褐藻糖膠(Fucoidan)、褐藻膠(Algin)與褐藻淀粉(Laminaran)。褐藻糖膠是水溶性多糖，存在于細(xì)胞間組織中，為組成相似的雜多糖混合物，其主要成分為L(zhǎng)-巖藻糖-4-硫酸酯，還伴隨少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等，褐藻糖膠通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，分級(jí)純化較困難(海藻化學(xué).紀(jì)明侯.北京：科學(xué)出版社.1997.p12-17)，褐藻糖膠的衍生物在抗艾滋病毒、治療腎衰竭、降血糖等方面已逐漸顯示出了巨大潛力。

海藻多糖提取過程中的浸提及沉淀是兩個(gè)最關(guān)鍵的步驟。浸提是將海藻用機(jī)械或化學(xué)方法破碎后，在常溫或加熱條件下，用堿性、中性或酸性溶液浸泡，但一般存在浸提時(shí)間較長(zhǎng)、浸提回收率較低等問題。在浸提之前可以采取一些預(yù)處理及凈化方法減少浸提液中其它雜質(zhì)含量，如用Sevage法、高濃度醇類及甲醛溶液等預(yù)處理除去蛋白質(zhì)，或者采用酸或堿處理藻體，但預(yù)處理往往會(huì)造成多糖損失、降低多糖回收率。

得到的含有海藻多糖浸提液后，一般采用減壓濃縮提取液的辦法減少后續(xù)的處理體積，或用透析的方法濃縮提取液。也有采用常壓下水浴蒸發(fā)濃縮提取液和壓濾的方法(周志剛等，極大螺旋藻多糖的分離、純化及其抗氧化的特性，植物學(xué)報(bào)，1997，39(1)：77-81；紀(jì)明侯等，用13C-NMR光譜法研究幾種紅藻含硫半聚糖的結(jié)構(gòu)特征，海洋與湖沼，1996，27(3)：330-335)。

從浸提液中提取分離海洋生物活性多糖目前幾乎都是采用沉淀法，如乙醇沉淀、氯化十六烷基吡啶(CPC)或溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)沉淀等。而海藻多糖的提取分離現(xiàn)在幾乎都是乙醇沉淀法，如滸苔多糖、螺旋藻多糖、螺旋藻粘多糖、褐藻多糖硫酸酯、蜈蚣藻卡拉膠等均采用乙醇沉淀法提取。比如，B.Ray等采用水煮法從石莼(Ulva rigida)中連續(xù)提取、乙醇沉淀提取分離細(xì)胞壁多糖(1995)；張爾賢等經(jīng)水煮后從鼠尾藻和銅藻中用乙醇沉淀法提取分離海藻多糖(1995)；周志剛等用蒸餾水水煮-乙醇沉淀法提取分離了培養(yǎng)的三種(極大、鈍頂和鹽澤)螺旋藻的胞外、胞內(nèi)多糖(1997)；螺旋藻多糖的一般提取分離也是將海藻經(jīng)80℃熱水提取后，用95％乙醇沉淀分離(徐惠等：中國(guó)生化藥物雜志，1997，18，72；曾和平等：藥物學(xué)報(bào)，1995，330，858；左紹遠(yuǎn)等：藥物生物技術(shù)，1996，3，158)。

乙醇沉淀法雖然易于大規(guī)模生產(chǎn)，但它存在如下問題：

1、一般只能得到多糖含量較低的粗產(chǎn)品(＜50％)，由于產(chǎn)品含大量變性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，增加了后續(xù)的乙醇重沉淀、離子交換、層析等純化過程的難度；

2、每公斤粗多糖需消耗工業(yè)乙醇50-60公斤，而總回收率一般僅為10-30％，造成產(chǎn)品成本高；

3、乙醇回收系統(tǒng)投資大、流程較復(fù)雜、能耗高；而且整個(gè)提取過程在工程放大時(shí)不易實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、自動(dòng)化。

目前盡管進(jìn)行了一些其它方法的研究，但仍是沉淀法，如氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)沉淀、氫氧化鋁與氫氧化鉛絡(luò)合物沉淀等，同樣存在與乙醇沉淀法相同的問題。

電場(chǎng)絮凝用于生物活性物質(zhì)的回收處理是一個(gè)引人注目的話題。Kumay等(Kumay H D et.al.Electrical flocculation ofthe unicellular green Algachlorella Vulgaris.Aquatic Botany.1981，11：187-195)研究電場(chǎng)絮凝單細(xì)胞綠藻時(shí)發(fā)現(xiàn)：電流通過懸浮液時(shí)；綠藻凝聚上?。?V/cm電場(chǎng)，30分鐘，pH值＝7.0時(shí)，可將近90％綠藻從水中分離；趙兵等人(ZL90100012.4，1990)利用電場(chǎng)絮凝方法提取了α-淀粉酶、堿性蛋白酶和糖化酶。但迄今為止，尚無(wú)絮凝提取海藻多糖的工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有海藻多糖提取存在的回收率低，以及活性低的問題，本發(fā)明提出一種海藻多糖提取物的制備方法，該制備方法便于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種海藻多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)將海藻洗凈后干燥，經(jīng)用機(jī)械粉碎，再用循環(huán)超聲破碎確保海藻細(xì)胞被完全破壞，得到海藻粉末；

2)將步驟1)的粉末放入提取罐中攪拌采用罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法進(jìn)行提取，得到提取液與海藻廢渣；

3)將步驟2)的海藻廢渣放入60～100℃熱水中，進(jìn)行超聲波提取，得到浸提液；

4)將步驟2)得到提取液以及步驟3)的浸提液置入攪拌反應(yīng)容器中，調(diào)節(jié)攪拌反應(yīng)器內(nèi)提取溫度為20～60℃，pH值為5～8；

5)向步驟4)的攪拌反應(yīng)容器中加入600～900ppm的絮凝劑，其攪拌及絮凝提取時(shí)間為20～30min；

6)絮凝提取完成后，對(duì)絮凝提取液進(jìn)行澄清或離心過濾，得到海藻多糖粗產(chǎn)品；

7)將得到的海藻多糖粗產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到海藻多糖產(chǎn)品。

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述步驟2)的罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法具體為：

a、以數(shù)罐為一組，罐組在正式循環(huán)提取之前，先對(duì)第一罐內(nèi)的海藻粉末投入溫度為60～80℃水，其第一次的提取液送入儲(chǔ)罐；其后第二次投入溫度為60～80℃水的提取液作為第二罐同樣海藻粉末提取的溶媒，第二罐第一次的提取液送入儲(chǔ)罐，第二罐第二次的提取液作為第三罐同樣海藻粉末提取的溶媒，第三罐的初次提取液送入儲(chǔ)罐；第一罐第三次投入溫度為60～80℃水，其提取液作為第二罐同樣海藻粉末的提取溶媒，第二罐第三次投入溫度為60～80℃水，其提取液作為第三罐同樣海藻粉末的提取溶媒；

b、罐組在正式循環(huán)提取過程中，對(duì)已經(jīng)多次提取、且是最后一次提取的罐內(nèi)海藻粉末投入溫度為60～80℃水，其提取液依次作為其后各罐海藻粉末提取的溶媒。

c、最后一次提取的罐內(nèi)在排出海藻廢渣后，再投入同樣的海藻粉末，作為下一輪罐組依次循環(huán)提取的最末罐，其再次投入海藻粉末后的第一次提取液送入儲(chǔ)罐；

d、每罐海藻粉末每次的提取液在提取過程中均經(jīng)過多次動(dòng)態(tài)逆流提取后獲得。

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述步驟3)的超聲條件為：超聲功率為400w～500w，時(shí)間20min～30min。

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述絮凝劑為具有活性氨基與羥基的陽(yáng)離子生物絮凝劑或溶于水時(shí)電離出磺酸根離子的陰離子型絮凝劑或?yàn)樗鼈兓旌闲跄齽?/p>

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述具有活性氨基與羥基的陽(yáng)離子生物絮凝劑為殼聚糖或改性淀粉；所述溶于水時(shí)電離出磺酸根離子的陰離子型絮凝劑為聚苯乙烯磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或磺甲基化聚丙烯酰胺。

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述步驟5)為：在1600～2300rpm攪拌速度下，加入絮凝劑，并在攪拌反應(yīng)器中設(shè)置一對(duì)平板式電極，平板式電極的兩極端接入直流或交流電源，在電場(chǎng)強(qiáng)度為20～50V/cm條件下對(duì)含海藻多糖的浸提料液進(jìn)行電場(chǎng)絮凝提取，絮凝劑的加入量為600～900ppm，其攪拌及絮凝提取時(shí)間為20～30min。

作為優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述步驟7)的純化方法為徑向流色譜進(jìn)行純化。

本發(fā)明的有益效果：

1、通過機(jī)械破碎結(jié)合循環(huán)超聲破碎，可以有效地將細(xì)胞進(jìn)行破碎，將細(xì)胞里面的多糖釋放出來。

2、通過罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法能夠有效地將海藻細(xì)胞里面的多糖提取出來，該方式較傳統(tǒng)的加熱浸提，提取回收率更高。

3、為了更好地提高多糖回收率，將海藻廢渣進(jìn)行超聲波輔助提取，將廢渣中的殘留多糖進(jìn)行二次提取，提高回收率。

4、加入絮凝劑，在電場(chǎng)或非電場(chǎng)的情況下進(jìn)行絮凝提取，并以電場(chǎng)絮凝提取效果更好，其絮凝劑的加入僅起到絮凝核心的形成作用，海藻多糖的絮凝析出主要靠電場(chǎng)作用和陰極提供的微電流，因而絮凝劑用量?jī)H為幾百ppm(絮凝料液中)，絮凝劑成本僅為乙醇沉淀的幾分之一到幾十分之一，從而顯著降低海藻多糖提取成本，而且產(chǎn)品純度高。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法具體為：

a、以數(shù)罐為一組，罐組在正式循環(huán)提取之前，先對(duì)第一罐內(nèi)的海藻粉末投入溫度為65℃水，其第一次的提取液送入儲(chǔ)罐；其后第二次投入溫度為65℃水的提取液作為第二罐同樣海藻粉末提取的溶媒，第二罐第一次的提取液送入儲(chǔ)罐，第二罐第二次的提取液作為第三罐同樣海藻粉末提取的溶媒，第三罐的初次提取液送入儲(chǔ)罐；第一罐第三次投入溫度為65℃水，其提取液作為第二罐同樣海藻粉末的提取溶媒，第二罐第三次投入溫度為65℃水，其提取液作為第三罐同樣海藻粉末的提取溶媒；

b、罐組在正式循環(huán)提取過程中，對(duì)已經(jīng)多次提取、且是最后一次提取的罐內(nèi)海藻粉末投入溫度為65℃水，其提取液依次作為其后各罐海藻粉末提取的溶媒。

c、最后一次提取的罐內(nèi)在排出海藻廢渣后，再投入同樣的海藻粉末，作為下一輪罐組依次循環(huán)提取的最末罐，其再次投入海藻粉末后的第一次提取液送入儲(chǔ)罐；

d、每罐海藻粉末每次的提取液在提取過程中均經(jīng)過多次動(dòng)態(tài)逆流提取后獲得。

實(shí)施例2

罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于水的溫度為80℃。

實(shí)施例3

一種海藻多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)將海藻洗凈后干燥，經(jīng)用機(jī)械粉碎，再用循環(huán)超聲破碎確保海藻細(xì)胞被完全破壞，得到海藻粉末；

2)將步驟1)的粉末放入提取罐中攪拌采用罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法(實(shí)施例1)進(jìn)行提取，得到提取液與海藻廢渣；

3)將步驟2)的海藻廢渣放入60℃熱水中，進(jìn)行超聲波提取，超聲功率為400w，時(shí)間30min，得到浸提液；

4)將步驟2)得到提取液以及步驟3)的浸提液置入攪拌反應(yīng)容器中，調(diào)節(jié)攪拌反應(yīng)器內(nèi)提取溫度為40℃，pH值為7；

5)在1900rpm攪拌速度下，向步驟4)的攪拌反應(yīng)容器中加入十二烷基苯磺酸鈉絮凝劑，并在攪拌反應(yīng)器中設(shè)置一對(duì)平板式電極，平板式電極的兩極端接入直流或交流電源，在電場(chǎng)強(qiáng)度為30V/cm條件下對(duì)含海藻多糖的浸提料液進(jìn)行電場(chǎng)絮凝提取，絮凝劑的加入量為700ppm，其攪拌及絮凝提取時(shí)間為24min；其絮凝提取率為72.6％。

實(shí)施例4

一種海藻多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)將海藻洗凈后干燥，經(jīng)用機(jī)械粉碎，再用循環(huán)超聲破碎確保海藻細(xì)胞被完全破壞，得到海藻粉末；

2)將步驟1)的粉末放入提取罐中攪拌采用罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法(實(shí)施例2)進(jìn)行提取，得到提取液與海藻廢渣；

3)將步驟2)的海藻廢渣放入80℃熱水中，進(jìn)行超聲波提取，超聲功率為450w，時(shí)間26min，得到浸提液；

4)將步驟2)得到提取液以及步驟3)的浸提液置入攪拌反應(yīng)容器中，調(diào)節(jié)攪拌反應(yīng)器內(nèi)提取溫度為30℃，pH值為6；

5)在1600rpm攪拌速度下，向步驟4)的攪拌反應(yīng)容器中加入十二烷基苯磺酸鈉絮凝劑，并在攪拌反應(yīng)器中設(shè)置一對(duì)平板式電極，平板式電極的兩極端接入直流或交流電源，在電場(chǎng)強(qiáng)度為20V/cm條件下對(duì)含海藻多糖的浸提料液進(jìn)行電場(chǎng)絮凝提取，絮凝劑的加入量為600ppm，其攪拌及絮凝提取時(shí)間為30min；其絮凝提取率為68.1％。

實(shí)施例5

一種海藻多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：

1)將海藻洗凈后干燥，經(jīng)用機(jī)械粉碎，再用循環(huán)超聲破碎確保海藻細(xì)胞被完全破壞，得到海藻粉末；

2)將步驟1)的粉末放入提取罐中攪拌采用罐組式動(dòng)態(tài)逆流提取方法進(jìn)行提取，得到提取液與海藻廢渣；

3)將步驟2)的海藻廢渣放入100℃熱水中，進(jìn)行超聲波提取，得到浸提液；

4)將步驟2)得到提取液以及步驟3)的浸提液置入攪拌反應(yīng)容器中，調(diào)節(jié)攪拌反應(yīng)器內(nèi)提取溫度為60℃，pH值為8；

5)在1600～2300rpm攪拌速度下，向步驟4)的攪拌反應(yīng)容器中加入聚苯乙烯磺酸鈉絮凝劑，并在攪拌反應(yīng)器中設(shè)置一對(duì)平板式電極，平板式電極的兩極端接入直流或交流電源，在電場(chǎng)強(qiáng)度為50V/cm條件下對(duì)含海藻多糖的浸提料液進(jìn)行電場(chǎng)絮凝提取，絮凝劑的加入量為900ppm，其攪拌及絮凝提取時(shí)間為20min。其絮凝提取率為70.5％。

實(shí)施例6

按照閔玉濤、宋彥顯等2015年在《食品工業(yè)》第36卷第6期發(fā)表的題目為“海藻多糖的兩種提取方法及其降糖活性比較”，進(jìn)行降糖活性實(shí)驗(yàn)。以實(shí)施例1-3制備得到的海藻多糖粗品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)施例1-3對(duì)胰淀粉酶的抑制率分別為91.3％、89.2％以及90.5％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。