本發(fā)明涉及抗輻射藥物領(lǐng)域，具體指一種山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑及制備方法。
背景技術(shù)：
輻射用于腫瘤的治療在已有幾十年的歷史，目前臨床上所用的輻射是由60co產(chǎn)生的γ-射線，這種射線是一種高能射線。中醫(yī)認(rèn)為經(jīng)這種高能射線照射后，患者的機(jī)體會(huì)產(chǎn)生陰虛癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為輻射后患者的白細(xì)胞數(shù)量會(huì)減少、人體的造血系統(tǒng)會(huì)受到損傷、細(xì)胞的dna會(huì)受到破壞。臨床上的pet-ct檢查、x光檢查、腫瘤的輻射治療等都會(huì)對(duì)人體造成不同程度的傷害。
目前市場(chǎng)上具有抗輻射作用的產(chǎn)品中一類是茶葉、黑芝麻、螺旋藻、大蒜等具有一定抗輻射保健效果的原植物或其組合物，這些產(chǎn)品雖然有一定的抗輻射作用，但是對(duì)腫瘤類疾病的大劑量放射治療沒有明顯效果。另一類則是從人參、靈芝、松茸等名貴材料中提取制成的，雖然具有較好的抗輻射作用，但價(jià)格極其昂貴，目前市場(chǎng)上缺乏效果可靠且價(jià)格合理的同類產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種具有可靠抗輻射效果且成本較低的制劑，即一種山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑。
本發(fā)明所述山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑含有以下質(zhì)量比例的組分：原料枇杷葉提取物1份，原料山藥多糖0.5～8份，載體磷脂1～5份，輔料乳糖1～30份，輔料木糖醇1～30份。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選配比范圍方案，所述山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑含有以下質(zhì)量比例的組分：原料枇杷葉提取物1份，原料山藥多糖3～6份，載體磷脂3～5份，輔料乳糖3～20份，輔料木糖醇3～20份。
作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選配比方案，所述山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑含有一下質(zhì)量比例的組分：原料枇杷葉提取物1份，原料山藥多糖5份，載 體磷脂4份，輔料乳糖15份，輔料木糖醇15份。
本發(fā)明還包括一種山藥、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑的制備方法，包括下列步驟：
a.枇杷葉提取物的制備：將枇杷葉粉碎過篩后加水煎煮2～4次，過濾后保留濾渣，濾渣經(jīng)干燥后用無水乙醇在70℃下回流提取，回收提取液中的乙醇后得到原料枇杷葉提取物；
c.抗輻射口服制劑的制備：取1份步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，1～5份載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入0.5～8份原料山藥多糖，1～30份輔料乳糖，1～30份輔料木糖醇，充分混合，再經(jīng)烘干、粉碎及分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
所述步驟a中過篩的目數(shù)為40目。
所述步驟a中回流提取的液固相比為10ml/g。
所述步驟a中的回流提取時(shí)間為8h。
所述步驟b中的混合方式為100w功率下超聲震蕩10～20min。
山藥是藥食同源型植物，其主要活性成分山藥多糖具有健脾、潤(rùn)肺、補(bǔ)腎的功效。動(dòng)物試驗(yàn)表明山藥多糖具有提高機(jī)體免疫功能及抗衰老等作用。出于成本控制方面的考慮，本發(fā)明所述抗輻射口服制劑中用到的山藥多糖可以是市售的山藥多糖成品，也可以是自行從原植物中提取得到的山藥多糖產(chǎn)品。
通過本發(fā)明所述方法得到的枇杷葉提取物經(jīng)檢測(cè)含有熊果酸、齊墩果酸等三萜類有效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤形成等多種生理功能。這些成分在水中的溶解度較低，直接口服溶出較慢，本發(fā)明將其制成以磷脂修飾的脂質(zhì)體后，可顯著提高其生物利用度，另外口服類制劑也較易于施用。
本發(fā)明所述抗輻射口服制劑中的有效成分取自山藥和枇杷葉，藥理作用清楚可靠，具有較好的抗輻射效果，成本較低且毒副作用小；枇杷葉提取物中的有效成分以脂質(zhì)體形式存在，生物利用度高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述山藥多糖、枇杷葉提取物抗輻射口服制劑及制備方法作進(jìn)一步說明。下述各實(shí)施例中如無特別說明，所用到的原料山藥多 糖均為市售山藥多糖成品(生產(chǎn)廠家為武漢凌創(chuàng)食品有限公司，批號(hào)為20151001)。
實(shí)施例一
a.枇杷葉提取物的制備：將枇杷葉粉碎并過40目篩后加水煎煮2次，過濾后保留濾渣，濾渣經(jīng)干燥后按照10ml/g的液固相比加入無水乙醇，70℃下回流提取8h，回收提取液中的乙醇后得到原料枇杷葉提取物；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，20g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入25g原料山藥多糖，75g輔料乳糖，75g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩15min，再經(jīng)烘干、粉碎及分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
實(shí)施例二
a.枇杷葉提取物的制備：與實(shí)施例一中的原料枇杷葉提取物制備方法相同；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，5g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入15g原料山藥多糖，15g輔料乳糖，15g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩15min，再經(jīng)烘干、粉碎并分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
實(shí)施例三
a.枇杷葉提取物的制備：與實(shí)施例一中的原料枇杷葉提取物制備方法基本相同，區(qū)別僅在于加水煎煮的次數(shù)為3次；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，15g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入2.5g原料山藥多糖，100g輔料乳糖，125g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩10min，再經(jīng)烘干、粉碎并分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
實(shí)施例四
a.枇杷葉提取物的制備：與實(shí)施例三中的原料枇杷葉提取物制備方法相同；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，25g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入30g原料山藥多糖，150g輔料乳糖，100g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩20min，再經(jīng)烘干、粉碎并分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
本實(shí)施例中使用的原料山藥多糖是從原植物中自行提取的，具體提取方法如下：
將山藥切碎后按照1：10的料液比加水混合后在100℃下回流提取2次，每次4h，合并水提液，過濾后將濾液減壓濃縮至原體積的1/3，濃縮液中加入乙醇至溶液中醇濃度達(dá)到80％，醇沉12h，沉淀部分經(jīng)干燥后得到原料山藥多糖。
實(shí)施例五
a.枇杷葉提取物的制備：與實(shí)施例一中的原料枇杷葉提取物制備方法基本相同，區(qū)別僅在于加水煎煮的次數(shù)為4次；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟a中制備的原料枇杷葉提取物，25g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入40g原料山藥多糖，125g輔料乳糖，150g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩18min，再經(jīng)烘干、粉碎并分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
本實(shí)施例中使用的原料山藥多糖是從原植物中自行提取的，提取方法同實(shí)施例四。
實(shí)施例六
a.枇杷葉提取物的制備：與實(shí)施例五中的原料枇杷葉提取物制備方法相同；
b.抗輻射口服制劑的制備：取5g步驟b中制備的原料枇杷葉提取物，10g載體磷脂，加入無水乙醇中溶解后再加入5g原料山藥多糖，5g輔料乳糖，5g輔料木糖醇，在100w功率下超聲震蕩20min，再經(jīng)烘干、粉碎并分裝后得到成品抗輻射口服制劑。
本實(shí)施例中使用的原料山藥多糖是從原植物中自行提取的，提取方法同實(shí)施例四。
產(chǎn)品質(zhì)量實(shí)驗(yàn)
1、含量測(cè)定
本發(fā)明制得的產(chǎn)品中的有效成分以熊果酸計(jì)，選用高效液相色譜法測(cè)定成品中有效成分的含量。
色譜條件：選用甲醇：水(90:10，v/v)作為流動(dòng)相，用三乙胺(每10ml水中加入0.06ml三乙胺)和冰醋酸作為緩沖液調(diào)節(jié)ph至6.5。選用c18柱(4.6×250mm，5μm)作為含量測(cè)定的色譜柱，選用210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
測(cè)定方法：精密稱取熊果酸對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，并配制成約30μg/ml的溶液，作為外標(biāo)溶液。取若干袋本發(fā)明制備的產(chǎn)品(約含熊果酸150mg)，倒出內(nèi)容物，混勻，取約相當(dāng)于30mg熊果酸的產(chǎn)品作為樣品，精密稱定，用50％甲醇溶解至100ml，過濾，精密吸取濾液1ml至10ml容量瓶，用流動(dòng)相定容，作為樣品溶液。分別取外標(biāo)溶液和樣品溶液20μl注入hplc中，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算本品中熊果酸的含量。
通過上述實(shí)驗(yàn)測(cè)得前述各實(shí)施例所制備的產(chǎn)品含量的范圍在90～105％。
2、包封率的測(cè)定
取若干袋本發(fā)明制備的產(chǎn)品(約含熊果酸150mg)，倒出內(nèi)容物，混勻，取約相當(dāng)于30mg熊果酸的產(chǎn)品作為樣品，加水至約100ml。取5ml至離心管中，70000rpm離心2小時(shí)，取上清液1ml至10ml容量瓶，流動(dòng)相定容。另取未離心的原液1ml至10ml容量瓶，并以流動(dòng)相定容。照前述含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件，取20μl注入hplc中，記錄色譜圖，按以下公式計(jì)算包封率：
包封率＝(總藥量-游離藥量)/總藥量×100％＝(原液主峰面積-上清液主峰面積)/原液主峰面積×100％。
通過上述實(shí)驗(yàn)測(cè)得前述各實(shí)施例制備的產(chǎn)品包封率的范圍在90～98％。
3、粒子大小的測(cè)定
取本發(fā)明制備的產(chǎn)品1g，加水約200ml溶解，采用電子顯微鏡或激光粒度儀測(cè)定本品的粒徑大小和粒度分布。
通過上述實(shí)驗(yàn)測(cè)得前述各實(shí)施例制備的產(chǎn)品平均粒徑的范圍在220～300nm。
生物利用度比較實(shí)驗(yàn)
材料與儀器：高效液相色譜儀；電子分析天平、ph計(jì)、超聲清洗器、離心機(jī)、渦旋混合器、氮?dú)獯蹈善鳌⒈景l(fā)明制備的產(chǎn)品、枇杷葉提取物、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸乙酯、甲醇、乙腈。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與給藥方法：sd大鼠12只，雌雄不拘，體重200±20g，實(shí)驗(yàn)前禁食12h后，隨機(jī)分成2組，采用灌胃方式分別施予本發(fā)明制得的產(chǎn)品(相當(dāng)于齊墩果酸30mg/kg)和相應(yīng)劑量的枇杷葉提取物水混懸液。灌胃后分別在0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、12、24h時(shí)間點(diǎn)從大鼠眼眶取血0.3ml與肝素抗凝的試管中，10000r/min離心10min，小心吸取血漿，-20℃低溫保存，3天內(nèi)完成齊墩果 酸血藥濃度的測(cè)定。
血漿樣品分析方法：a、樣品處理方法：精取待測(cè)血漿100μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液30μl及乙酸乙酯2ml漩渦混合3min后在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，精取乙酸乙酯層1.5ml于另一離心管，并在50℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl甲醇溶解并在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，取上清液40μl進(jìn)樣。b、色譜條件：選用4.6×250mm的c18柱，流動(dòng)相為乙腈：磷酸鹽緩沖液(ph3.5)＝80:20(每500ml流動(dòng)相中含9mmol的γ環(huán)糊精)；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流速1ml/min，采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血漿中齊墩果酸的含量。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：達(dá)峰時(shí)間tmax(h)及縫制濃度cmax(μl/ml)取實(shí)際值，用藥-時(shí)曲線尾部幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度(c)取對(duì)數(shù)后對(duì)時(shí)間(t)進(jìn)行回歸，采用梯形法計(jì)算曲線下面積auc，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
表1：受試大鼠單劑量灌胃后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)對(duì)比(
從表1可以看出，枇杷葉提取物中的有效成分在水中的溶解度較低，口服后溶出較慢，影響其在體內(nèi)的吸收。本發(fā)明將枇杷葉提取物中的有效成分制成脂質(zhì)體后，可顯著改善有效成分的口服生物利用度。由結(jié)果可見，本發(fā)明制得的產(chǎn)品與枇杷葉提取物相比，單次灌胃給藥后，齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的相對(duì)生物度為771％。
抗輻射效果實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明所制備產(chǎn)品的成人推薦量為每日150mg。按成人60kg體重計(jì)，即2.5mg/kg·bw，按人體推薦攝入量的10倍、20倍(分別為25、50mg/kg·bw)施予受試物，并設(shè)置輻射對(duì)照組及枇杷葉提取物組。產(chǎn)品組以蒸餾水將本發(fā)明制備的產(chǎn)品配制成所需濃度灌胃，枇杷葉提取物組所含的有效成分和使用量與產(chǎn)品組相同。
材料與儀器：電子天平，顯微鏡，722分光光度計(jì)，微量冷凍離心機(jī)等，鹽酸、giemsa染液，甲醇，小牛血清，sod試劑盒(南京建成生物工程研究所)， 乙醇，三氯甲烷等。
統(tǒng)計(jì)方法：計(jì)量資料采用方差分析和q檢驗(yàn)法，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)(sas8.1)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取體重18～22g的昆明種雄性小鼠(合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字19-006號(hào))作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行下述各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
1、白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)：取50只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)后采血計(jì)數(shù)白細(xì)胞，再按白細(xì)胞水平，并參考體重隨機(jī)分為4個(gè)劑量組和1個(gè)輻射對(duì)照組，每組10只。劑量組分別按人體推薦攝入量(2.5mg/kg.bw)的10倍、20倍(即25、50mg/kg.bw)給予受試物，輻射對(duì)照組給予蒸餾水。各組小鼠灌胃容量均為0.20ml/kg.bw，連續(xù)灌胃30天后，接受60co-γ射線5.0gy的照射。輻照后各組動(dòng)物繼續(xù)給予受試物或?qū)φ瘴?，并分別于照射后3天和14天再次采血計(jì)數(shù)白細(xì)胞，以觀察白細(xì)胞的變化。小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2：本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)輻照后小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響
注：*標(biāo)示與輻射對(duì)照組相比，有顯著性差異(p＜0.05)
從表2可以看出，輻照前各組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有明顯差異，輻照后小鼠白細(xì)胞數(shù)顯著下降，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸回升。輻照后3天各劑量組白細(xì)胞數(shù)高于同期對(duì)照組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。輻照后14天產(chǎn)品10倍、20倍劑量組顯著高于同期對(duì)照。枇杷葉提取物的10倍劑量組與對(duì)照組相比沒有明顯差異，20倍劑量組與對(duì)照組相比有明顯差異。該結(jié)果表明本發(fā)明制備的產(chǎn)品所含有效成分的脂質(zhì)體有明顯促進(jìn)輻照后小鼠白細(xì)胞回升的作用，其效果優(yōu)于枇杷葉提取物組。
2、骨髓細(xì)胞微核率試驗(yàn)：取50只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4個(gè)劑量組和1個(gè)輻射對(duì)照組，每組10只。劑量組和對(duì)照組的劑量設(shè)置及灌胃容量同白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。各組小鼠連續(xù)灌胃30天后，接受60co-γ射線5.0gy的照射。輻照后各組動(dòng)物繼續(xù)給予受試物或?qū)φ瘴?，并于照射?天頸椎脫臼處死，取胸骨骨髓涂片，甲醇固定，giemsa染液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)每片1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中的微核細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算微核率和抑制率。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3：本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)輻照小鼠微核率的影響
注：**標(biāo)示與輻射對(duì)照組相比，有極顯著性差異(p＜0.01)差異
從表3可以看出，施予本發(fā)明制備的產(chǎn)品后，輻照小鼠的微核率有明顯下降，其中的兩個(gè)產(chǎn)品劑量組小鼠微核率與輻射對(duì)照組相比均有極顯著性差異。枇杷葉提取物的兩個(gè)劑量組中，只有高劑量組與輻射對(duì)照組相比有極顯著性差異，低劑量組沒有顯著性差異，表明本發(fā)明制備的產(chǎn)品所含有效成分的脂質(zhì)體具有降低輻照小鼠胸骨骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的作用，其效果優(yōu)于枇杷葉提取物組。
3、紅細(xì)胞sod活性試驗(yàn)：取50只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4個(gè)劑量組和1個(gè)輻射對(duì)照組，每組10只。劑量組和對(duì)照組的劑量設(shè)置及灌胃容量同白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。各組小鼠連續(xù)灌胃30天后，接受60co-γ射線7.0gy的照射。輻照后各組動(dòng)物繼續(xù)給予受試物或?qū)φ瘴?，并于輻照?天采血，測(cè)定血紅蛋白含量和紅細(xì)胞sod活性。小鼠紅細(xì)胞sod活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4：本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)輻照小鼠紅細(xì)胞sod活性的影響
注：*分別表示與輻射對(duì)照組相比，有顯著性(p＜0.05)差異
從表4可以看出，施予本發(fā)明制備的產(chǎn)品后，產(chǎn)品劑量組的小鼠紅細(xì)胞sod活性高于輻射對(duì)照組，產(chǎn)品10倍、20倍兩個(gè)劑量組與輻射對(duì)照組相比有顯著性差異，表明本發(fā)明制備的產(chǎn)品具有升高輻照小鼠紅細(xì)胞sod活性的作用，而枇杷葉提取物在兩種劑量下對(duì)輻照小鼠紅細(xì)胞sod的活性均沒有作用。
4、血清溶血素水平試驗(yàn)：取50只動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4個(gè)劑量組和1個(gè)輻射對(duì)照組，每組10只。劑量組和對(duì)照組的劑量設(shè)置及灌胃容量同白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。各組小鼠連續(xù)灌胃30天后，接受60co-γ射線2.0gy的照射。輻照后各組動(dòng)物繼續(xù)給予受試物或?qū)φ瘴?，并于輻照?天采血，測(cè)定血清的半數(shù)溶血值(hc50)。小鼠血清溶血素水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5：本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)輻照小鼠血清溶血素水平(hc50)的影響
注：**分別表示與輻射對(duì)照組相比，有極顯著性(p＜0.01)差異
從表5可以看出，給予本發(fā)明制備的產(chǎn)品后，10倍、20倍兩個(gè)劑量組小鼠血清溶血素水平極顯著高于輻射對(duì)照組，表明本發(fā)明制備的產(chǎn)品具有升高輻照小 鼠血清溶血素水平的作用。枇杷葉提取物的兩個(gè)劑量組與輻射對(duì)照組相比沒有顯著性差異。
從上述四個(gè)抗輻射效果實(shí)驗(yàn)可以看出本發(fā)明制備的產(chǎn)品對(duì)60co-γ射線一次性高劑量照射后的小鼠，有顯著升高小鼠白細(xì)胞數(shù)、降低骨髓細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞微核率、提高紅細(xì)胞sod活性和血清溶血素水平的作用，并且其作用明顯優(yōu)于枇杷葉提取物。