三葉青藤多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及三葉青藤多糖提取物的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三葉青藤多糖提取物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)為葡萄科崖爬藤屬三葉 崖爬藤，生于陰濕的山坡、山谷或溪旁的林下，主要分布于我國西南以及浙江、安徽、江西、 福建、廣西等省區(qū)。三葉青主要以塊根，也有用全草入藥，但無特別說明，目前藥房出售的三 葉青和市售的三葉青中藥飲片粉劑均為三葉青塊根部位，藥典和文獻(xiàn)中的三葉青也大多是 指三葉青的塊根部位。三葉青的塊根具有提高免疫力、抗病毒、增強(qiáng)肝功能等作用，尤其對 乙肝、多種腫瘤、癌癥、小兒高熱驚厥、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、病毒性腦炎等具有獨(dú)特的療 效，被中醫(yī)藥界譽(yù)為極品中草藥。目前市場上三葉青塊根的鮮藥價格高達(dá)每千克2000元， 中藥飲片三葉青塊根粉的市場價格達(dá)每克10元，供不應(yīng)求。
[0003] 三葉青塊根的市場需求旺盛，而三葉青的藤和葉的部位的藥理學(xué)研究相對較少， 市場需求量也不大，大部分的三葉青的藤和葉被當(dāng)做廢料扔棄。因此對于積極開發(fā)三葉青 藤和葉在藥理學(xué)上面的應(yīng)用，可以有效提高三葉青各部位的綜合利用，提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 三葉青因?yàn)閷Σ幻髟虻母邿?、小兒高熱驚厥、各類炎性水腫有獨(dú)特療效，民間素 有"植物抗生素"的美譽(yù)。但現(xiàn)有藥典和文獻(xiàn)記載的都針對三葉青退熱和消炎的功能，對于 三葉青能直接抑制細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌的作用未見記載，特別是三葉青抑制細(xì)菌生長和殺 死細(xì)菌的作用的藥效部位未見報道。
[0005][0006] 申請公布號為CN 103381222A(申請?zhí)枮?01210144289. 5)的中國發(fā)明專利申請 公開了一種植物三葉青氣體制劑及制備方法，其中，三葉青原液成分提取方法包括：三葉青 原藥IKg乙醇50% 3~4倍浸取兩次，將兩次提取的上清液混合，回收乙醇制成1 :1原液 備用。該技術(shù)方案通過以下重量百分含量的組分制成噴霧劑，配制組分如下：三葉青原液 10%~30%、聚維酮3%~6%、泊洛沙姆0· 3%~5%、甘油1 %~3%、乙醇2%~6%、薄 荷腦0. 02 %~0. 05 %、木糖醇2 %~4%、純化水余量。該噴霧劑通過上述組分的復(fù)配可用 于抗病毒、鎮(zhèn)痛消腫，可具體用于治療上感風(fēng)寒、口腔等粘膜部分的上呼吸道感染、以及外 用于治療痔瘡膿腫。但是如何通過提取液，提取出抗菌性最好的三葉青原液，該專利申請說 明書并未公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了 一種二葉青藤多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用，二葉青藤多糖提取 物極易溶于水，能夠有效抑制細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌。
[0008] -種三葉青藤多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)取干燥的三葉青的藤粉碎得到干粉，用水提取，過濾，濾液經(jīng)干燥后得到三葉青 藤的水提物；
[0010] 2)將步驟1)中的三葉青藤的水提物用水溶解，形成前置溶液，加體積百分?jǐn)?shù) 70% -95%的乙醇水溶液于2-8°C條件下沉淀6-48h，干燥沉淀物得到三葉青藤的粗多糖提 取物；
[0011] 3)將步驟2)中的三葉青藤的粗多糖提取物用雙水相萃取，進(jìn)一步得到三葉青藤 多糖提取物。
[0012] 本發(fā)明中，通過水作為溶劑提取，將三葉青的藤中的多糖提取出來，通過乙醇沉 淀，雙水相萃取最終得到三葉青藤多糖提取物，得到的三葉青藤多糖提取物能夠有效抑制 細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌。
[0013] 步驟1)中，用水提取60min~120min。上述條件下能夠更好地提取三葉青藤中抑 菌和殺菌成分。進(jìn)一步優(yōu)選，用水提取90min，該提取時間有利于三葉青的藤中抑菌和殺菌 成分的提取。
[0014] 所述的水（即提取溶劑）的用量為干粉質(zhì)量的〇· Ι-lOOmL/g。即所述的干粉的質(zhì) 量與水的體積之比為Ig :〇. Ι-lOOmL，即每克干粉加入0.1 -IOOmL的水。進(jìn)一步優(yōu)選，所述 的水的用量為干粉質(zhì)量的5-40mL/g，更優(yōu)選為40mL/g。
[0015] 步驟2)中，所述的乙醇水溶液與前置溶液的體積比為1-20 :1。
[0016] 步驟3)中，所述的雙水相萃取，包括：
[0017] 將水、三葉青藤的粗多糖提取物、離子液體[C4min]Cl以及K3PO 4或者K2HPO4混合， 形成雙水相溶液，雙水相溶液在20-35°C條件下靜置20-60min，3000-5000rpm離心5-20min 后分成上下兩相，下相液體用1-20倍體積的體積百分?jǐn)?shù)70% -95%的乙醇水溶液于2-8°C 條件下沉淀6-48h后干燥，得到三葉青藤多糖提取物。上相為包含離子液體[C4min]Cl，蛋 白質(zhì)，礦物質(zhì)，下相包含三葉青多糖。
[0018] 所述的雙水相溶液采用以下比例混合：
[0019] 水5mL，三葉青藤的粗多糖提取物0· 001-10g，離子液體[C4min]C10. 1-lOmL，K3PO4 或者K2HPO40.00 1-10g。雙水相溶液的體積可等比例放大或者縮小。
[0020] 得到的二葉青藤多糖提取物，用苯酸-硫酸法（《中藥提取物 鑒別與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 參考》，陳沖主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2013年818頁）測得三葉青藤多糖提取物中多糖的含量 (重量含量）為53. 7% -97.8%。
[0021] -種抗菌藥液的制備方法，包括以下步驟：
[0022] 將三葉青藤多糖提取物溶解于水中，經(jīng)0. 2~0. 5 μπι的濾膜過濾除菌后，制得抗 菌藥液；
[0023] 所述的三葉青藤多糖提取物的質(zhì)量與水的體積之比為l_128mg :lmL。
[0024] 作為優(yōu)選，所述的三葉青藤多糖提取物的質(zhì)量與水的體積之比為55_75mg :lmL。 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的三葉青藤多糖提取物的質(zhì)量與水的體積之比為64mg :lmL。
[0025] 經(jīng)0· 2~0· 5 μπι的濾膜除去雜質(zhì)，雜質(zhì)主要為不能溶解（無抗菌功效）的雜質(zhì)。 本發(fā)明最大限度地將抗菌和殺菌成分保留在抗菌藥液中，使得本發(fā)明制得的抗菌藥液對抑 制細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌具有較好的作用。
[0026] 所述的抗菌藥液可用于制備抑菌殺菌用品，用于藥物、化妝品、保健食品、食品以 及用于人、動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的抑菌和抗菌。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 本發(fā)明中，通過水作為溶劑提取，將三葉青的藤中抑菌和殺菌成分提取出來，通過 乙醇沉淀和雙水相萃取最后得到三葉青藤多糖提取物，得到的三葉青藤多糖提取物能夠有 效抑制細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌。
[0029] 本發(fā)明方法制備的三葉青藤多糖提取物具有抗菌殺菌作用，可用于制備抑菌殺菌 用品。如制成抗菌藥液，最大限度地將抗菌和殺菌成分保留在抗菌藥液中，使得本發(fā)明制得 的抗菌藥液對抑制細(xì)菌生長和殺死細(xì)菌具有較好的作用。該藥液可作為成分用于藥物、化 妝品、保健食品、食品以及用于人、動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的抑菌和抗菌。本發(fā)明為三葉青原 有公開功效外的新的藥物、化妝品、保健食品以及食品的用途，具有抑菌抗菌作用，具備廣 闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1
[0031] (1)取干燥的三葉青的藤50g粉碎得到干粉，用250mL水為溶劑提取90min，過濾， 濾液干燥得到三葉青藤的水提物；三葉青藤的水提物用5mL的水溶解，加入40mL的體積百 分?jǐn)?shù)90%的乙醇水溶液于4°C條件下沉淀12h，干燥沉淀物得到三葉青藤的粗多糖提取物。 5mL水中加入三葉青藤的粗多糖提取物50mg，離子液體[C 4min]Cl 10mL，K3P04lg，在35°C條 件下靜置20min，3000rpm離心10min后分成上下兩相。取下相液體，用5倍體積的體積百 分?jǐn)?shù)90%的乙醇水溶液于4°C條件下沉淀12h，得到三葉青藤多糖提取物，用苯酚-硫酸法 測得三葉青藤多糖的含量為87. 7%。三葉青藤多糖提取物以64mg/mL的溶度溶解于水中， 0. 45 μ m的濾膜過濾除菌后，制得抗菌藥液，各藥液在4°C條件下備用。
[0032] (2)檢測各藥液對細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC)。即細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中于37°C條件 下過夜培養(yǎng)，1:15轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)到OD 62q= 0. 2±0. 02。細(xì)菌1:10000稀 釋到LB培養(yǎng)基中，加入等體積的藥液，混勻后取相同體積的混合物加入到下一個稀釋度， 一直對倍稀釋到最后一個濃度。陰性對照加入等體積的水。
[0033] (3)細(xì)菌在37°C條件下培養(yǎng)18-20小時，讀取0D62。，OD62。小于0. 1 (即小于本底數(shù) 值）判定為無細(xì)菌生長。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0034] 表 1
[0035]

[0036] 上述結(jié)果表明，當(dāng)三葉青藤多糖提取物的濃度大于等于lmg/mL時，能夠抑制金 黃色葡萄球菌ATCC6538和副溶血弧菌ATCC17082的生長；當(dāng)濃度大于等于2mg/mL，能夠 抑制單核細(xì)胞增多性李斯特菌NCTC7973的生長；當(dāng)濃度大于等于4mg/mL，能夠抑制大腸 桿菌ATCC8739、腸炎沙門氏菌CGMCC50760、銅綠假單胞菌ATCC9027和鼠傷寒沙門氏菌 ATCC14028的生長。以上結(jié)果說明三葉青藤多糖提取物對細(xì)菌具有較好的抑制作用，具有抑 菌殺菌作用。
[0037] 實(shí)施例2
[0038] (1)取干燥的三葉青的藤50g粉碎得到干粉，用2L水為溶劑提取90min，過濾，濾 液干燥得到三葉青藤的水提物；三葉青藤的水提物用IOmL的水溶解，加入40mL的體積百 分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液于4°C條件下沉淀12h得到三葉青藤的粗多糖提取物。5mL水中加 入三葉青藤的粗多糖提取物l〇mg，離子液體[C 4min]Cl lmL，K2HPO4Ig,在20°C條件下靜置 60min，5000rpm離心20min后分成上下兩相。取下相液體，用4倍體積的體積百分?jǐn)?shù)80% 的乙醇水溶液于4°C條件下沉淀12h，得到三葉青藤多糖提取物，用苯酚-硫酸法測得三葉 青藤多糖的含量為92. 3%。三葉青藤多糖提取物以64mg/mL的溶度溶解于水中，0. 22 μ