本發(fā)明涉及多糖提取技術領域，具體是一種從海藻中提取活性多糖的方法。

背景技術：

近年來，數(shù)量龐大，種類繁多的海洋生物在食品、藥物、化妝品和生物材料等領域得到廣泛應用，從海洋生物中提取分離生物活性物質(zhì)己成為天然產(chǎn)物研究的熱點。海洋生物最引人注目的是其豐富的藥用資源，科學家已從海洋生物中分離和鑒定出多種海洋天然活性物質(zhì)，其中許多具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗凝血等生物活性作用，為研制開發(fā)海洋新藥奠定基礎。與蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等其他生物大分子相比，糖類具有更強的親水性。海洋生物通過合成多糖類物質(zhì)，以保持體內(nèi)生命活動所需要的自由水分，來適應海洋這個特殊的環(huán)境。多糖廣泛參與細胞識別、細胞生長、分化、代謝、胚胎發(fā)育、細胞癌變、病毒感染和免疫應答等各項生命活動，具有抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、抗突變、抗?jié)儭⒖寡趸?、降血糖和降血脂等生物活性，成為現(xiàn)代醫(yī)學和功能食品工作者共同關注的焦點。海藻多糖是海藻所含的各種高分子碳水化合物，占干重的20 ~ 70%，是海藻的主要成分。20世紀60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)海藻多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、活血化癖、抗衰老和保護肌體細胞等，且多數(shù)無毒，在開發(fā)成為海洋藥物方面有較大的潛力。

現(xiàn)在已有很多關于多糖提取的報導，現(xiàn)有技術如授權公告號為CN103497258B的中國發(fā)明專利，公開了一種小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，其步驟包括 ：預處理、脫脂、多糖提取和粗多糖精制，最后對提取的粗品和純化后組分的得率、化學組成以及免疫調(diào)節(jié)活性進行了分析。該小麥麩皮活性多糖的提取純化方法，是利用水提醇沉法制得小麥麩皮多糖粗品，再利用瓊脂糖凝膠柱純化得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖，其提取方法簡單，運行成本低，所得的小麥麩皮粗多糖其得率為 5.0%，經(jīng)過純化小麥麩皮活性多糖其得率為5.6%，且具有較強的免疫調(diào)節(jié)活性。

現(xiàn)有技術如授權公告號為CN103265644B的中國發(fā)明專利，公開了一種白僵蠶抗癌活性多糖BBPW-2的制備方法。白僵蠶粉經(jīng)丙酮 - 石油醚回流脫脂和 80% 乙醇回流除去苷類和生物堿后，用蒸餾水于 80~100℃下提取出粗多糖。粗多糖經(jīng) Sevag法去除蛋白質(zhì)后，用 DEAE 瓊脂糖凝膠離子交換層析分離出中性多糖組分，再經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠S-300 層析，取第 2 個洗脫峰，減壓濃縮后經(jīng)丙烯葡聚糖凝膠 S-200 層析進一步純化，冷凍干燥得到白僵蠶抗癌活性多糖 BBPW-2。該方法制備的產(chǎn)物，純度均一，分子量為 2.0×10 ³ Da，對人宮頸癌細胞Hela和人肝癌細胞HepG2的生長均有抑制作用，對正常細胞人胚胎腎細胞 HEK293 和小鼠巨噬細胞 RAW264.7 生長均無不良影響，可用于抗癌產(chǎn)品開發(fā)。這兩種方法多糖的提取率低，有機溶劑用量大，對環(huán)境的污染大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多糖提取率高，純度高，活性強，有機溶劑用量較少的從海藻中提取活性多糖的方法。

本發(fā)明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：

從海藻中提取活性多糖的方法，具體步驟為：

1）脫脂、脫苷：將海藻洗凈，粉碎，過篩得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脫脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液體積比為1:10~15，丙酮：石油醚體積比為1：1.2~1:1.6。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脫脂率高。抽濾，濾渣中加入乙醇回流，乙醇濃度為85~90%，濾渣：乙醇體積比為1:12~16，抽濾，濾渣烘干。海藻中的苷類和生物堿在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除雜的過程中多糖損失率少；

2）酶解：在步驟1最后得到的濾渣中加入蒸餾水，濾渣：蒸餾水體積比:1：25~28。復合酶制劑酶解，復合酶加入量為3~5%，酶解溫度為52~56℃，pH為2.7~3.4，酶解時間為2.2~2.7h。復合酶制劑成份及其重量份為：10~20份纖維素酶、10~15份果膠酶、1~3份NaCl、0.001~0.002份焦磷酸鉀、0.5~1份硫酸鎂、0.004~0.006份聚磷酸銨和0.2~0.8份磷酸二氫鈣。上述復合酶制劑酶解纖維素和果膠的效率高，并且酶解充分，對細胞壁的破壞率高。超聲波助溶，超聲頻率為260~320W，超聲時間為20~30min。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，取濾液。酶解將纖維素與果膠水解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，并且輔以超聲波提取，活性多糖從海藻細胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；

3）去蛋白：在濾液中加入Sevage 試劑，Sevage 試劑：濾液體積比為1:3~5，蛋白質(zhì)在Sevage 試劑中會變性，在水中溶解度下降，攪拌，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇，乙醇濃度為90~98%，上層液體：乙醇體積比為1:3.7~4.5。攪拌，抽濾取濾渣，先用濾渣體積35~40倍的無水乙醇洗滌，再用30~32倍的無水丙酮洗滌，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；

4）超濾：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸餾水，超濾，濾膜規(guī)格為3500~4000Da，活性多糖分子量大于3500~4000Da，超濾可除去溶于水的小分子雜質(zhì)。取未濾過液，干燥得到粉末；

5）凝膠層析：粉末中加入蒸餾水，粉末：蒸餾水體積比為1:0.02~0.05，注入 DEAE- 瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，先用蒸餾水1.2~1.4mL/min沖洗4.2~4.6h，再用0.5MNaCl 以同樣流速繼續(xù)沖洗2.2~2.5h。不同成分分子量大小不同，凝膠層析根據(jù)分子量的大小將海藻多糖水溶液中各成分分離開來，采用苯酚 - 硫酸法檢測，收集有顯色反應的洗脫液，對海藻活性多糖進一步分離純化；

6）去鹽、干燥：將洗脫液置于透析袋中透析，濾膜規(guī)格為3500~4000Da取未濾過液，將凝膠層析時引入的NaCl除去。減壓濃縮，減壓濃縮至未濾過液體積的1/100~1/200，冷凍干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的純度很高，活性強，無有機溶劑殘留，綠色健康，適合應用到化妝品、醫(yī)藥、食品領域。制備過程中用到的有機溶劑可回收再利用，對環(huán)境的污染小。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：用丙酮-石油醚混合液回流脫脂，用乙醇回流脫苷類和生物堿，進行除雜；復合酶制劑酶解纖維素和果膠的效率高，并且酶解充分，對細胞壁的破壞率高；酶解將纖維素與果膠水解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，并且輔以超聲波提取，焦磷酸鉀和聚磷酸銨通過硫酸鎂醋精產(chǎn)生意想不到的效果，促進活性多糖從海藻細胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；用Sevage 試劑使蛋白質(zhì)變性，去除蛋白；采用超濾、凝膠層析和透析對粗制海藻活性多糖粉末進行分離純化，最后得到的海藻活性多糖純度很高，活性強，無有機溶劑殘留，綠色健康，適合應用到化妝品、醫(yī)藥、食品領域；制備過程中用到的有機溶劑可回收再利用，對環(huán)境的污染小；成本低廉，活性多糖經(jīng)濟價值高，適合工廠化生產(chǎn)。

具體實施例

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：

實施例1：

從海藻中提取活性多糖的方法，具體步驟為：

1）脫脂、脫苷：將海藻洗凈，粉碎，過篩得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脫脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液體積比為1:10~15，丙酮：石油醚體積比為1：1.2~1:1.6。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脫脂率高。抽濾，濾渣中加入乙醇回流，乙醇濃度為85~90%，濾渣：乙醇體積比為1:12~16，抽濾，濾渣烘干。海藻中的苷類和生物堿在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除雜的過程中多糖損失率少；

2）酶解：在步驟1最后得到的濾渣中加入蒸餾水，濾渣：蒸餾水體積比:1：25~28。復合酶制劑酶解，復合酶加入量為3~5%，酶解溫度為52~56℃，pH為2.7~3.4，酶解時間為2.2~2.7h。復合酶制劑成份及其重量份為：10~20份纖維素酶、10~15份果膠酶、1~3份NaCl、0.001~0.002份焦磷酸鉀、0.5~1份硫酸鎂、0.004~0.006份聚磷酸銨和0.2~0.8份磷酸二氫鈣。上述復合酶制劑酶解纖維素和果膠的效率高，并且酶解充分，對細胞壁的破壞率高。超聲波助溶，超聲頻率為260~320W，超聲時間為20~30min。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，取濾液。酶解將纖維素與果膠水解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，并且輔以超聲波提取，活性多糖從海藻細胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；

3）去蛋白：在濾液中加入Sevage 試劑，Sevage 試劑：濾液體積比為1:3~5，蛋白質(zhì)在Sevage 試劑中會變性，在水中溶解度下降，攪拌，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇，乙醇濃度為90~98%，上層液體：乙醇體積比為1:3.7~4.5。攪拌，抽濾取濾渣，先用濾渣體積35~40倍的無水乙醇洗滌，再用30~32倍的無水丙酮洗滌，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；

4）超濾：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸餾水，超濾，濾膜規(guī)格為3500~4000Da，活性多糖分子量大于3500~4000Da，超濾可除去溶于水的小分子雜質(zhì)。取未濾過液，干燥得到粉末；

5）凝膠層析：粉末中加入蒸餾水，粉末：蒸餾水體積比為1:0.02~0.05，注入 DEAE- 瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，先用蒸餾水1.2~1.4mL/min沖洗4.2~4.6h，再用0.5MNaCl 以同樣流速繼續(xù)沖洗2.2~2.5h。不同成分分子量大小不同，凝膠層析根據(jù)分子量的大小將海藻多糖水溶液中各成分分離開來，采用苯酚 - 硫酸法檢測，收集有顯色反應的洗脫液，對海藻活性多糖進一步分離純化；

6）去鹽、干燥：將洗脫液置于透析袋中透析，濾膜規(guī)格為3500~4000Da取未濾過液，將凝膠層析時引入的NaCl除去。減壓濃縮，減壓濃縮至未濾過液體積的1/100~1/200，冷凍干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的純度很高，活性強，無有機溶劑殘留，綠色健康，適合應用到化妝品、醫(yī)藥、食品領域。制備過程中用到的有機溶劑可回收再利用，對環(huán)境的污染小。

實施例2：

從海藻中提取活性多糖的方法，最優(yōu)選步驟為：

1）脫脂、脫苷：將海藻洗凈，粉碎，過篩得到海藻粉末，加入丙酮-石油醚混合液回流脫脂，海藻粉末：丙酮-石油醚混合液體積比為1:12，丙酮：石油醚體積比為1：1.4。海藻中油脂在丙酮-石油醚混合液中溶解度大，海藻脫脂率高。抽濾，濾渣中加入乙醇回流，乙醇濃度為88%，濾渣：乙醇體積比為1:15，抽濾，濾渣烘干。海藻中的苷類和生物堿在乙醇中溶解度高，多糖不溶于乙醇，在除雜的過程中多糖損失率少；

2）酶解：在步驟1最后得到的濾渣中加入蒸餾水，濾渣：蒸餾水體積比為1：27。復合酶制劑酶解，復合酶加入量為4%，酶解溫度為54℃，pH為3.1，酶解時間為2.5h。復合酶制劑成份及其最優(yōu)選重量份為：17份纖維素酶、12份果膠酶、2份NaCl、0.002份焦磷酸鉀、0.7份硫酸鎂、0.005份聚磷酸銨和0.5份磷酸二氫鈣。上述復合酶制劑酶解纖維素和果膠的效率高，并且酶解充分，對細胞壁的破壞率高。超聲波助溶，超聲頻率為290W，超聲時間為24min。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾，取濾液。酶解將纖維素與果膠水解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，并且輔以超聲波提取，活性多糖從海藻細胞中流出溶解于水中，活性多糖的提取率高；

3）去蛋白：在濾液中加入Sevage 試劑，Sevage 試劑：濾液體積比為1:4，蛋白質(zhì)在Sevage 試劑中會變性，在水中溶解度下降，攪拌，去除下層液體及絮狀沉淀物，在上層液體中加入乙醇，乙醇濃度為95%，上層液體：乙醇體積比為1:4.2。攪拌，抽濾取濾渣，先用濾渣體積37倍的無水乙醇洗滌，再用31倍的無水丙酮洗滌，旋蒸干燥得到粗制海藻活性多糖粉末；

4）超濾：粗制海藻活性多糖粉末中加入蒸餾水，超濾，濾膜規(guī)格為3500Da，活性多糖分子量大于3500Da，超濾可除去溶于水的小分子雜質(zhì)。取未濾過液，干燥得到粉末；

5）凝膠層析：粉末中加入蒸餾水，粉末：蒸餾水體積比為1:0.03，注入 DEAE- 瓊脂糖凝膠柱中色譜分離，先用蒸餾水1.3mL/min沖洗4.4h，再用0.5MNaCl 以同樣流速繼續(xù)沖洗2.4h。不同成分分子量大小不同，凝膠層析根據(jù)分子量的大小將海藻多糖水溶液中各成分分離開來，采用苯酚 - 硫酸法檢測，收集有顯色反應的洗脫液，對海藻活性多糖進一步分離純化；

6）去鹽、干燥：將洗脫液置于透析袋中透析，濾膜規(guī)格為3500Da取未濾過液，將凝膠層析時引入的NaCl除去。減壓濃縮，減壓濃縮至未濾過液體積的1/140，冷凍干燥得到活性多糖粉末。得到的活性多糖粉末的純度很高，活性強，無有機溶劑殘留，綠色健康，適合應用到化妝品、醫(yī)藥、食品領域。制備過程中用到的有機溶劑可回收再利用，對環(huán)境的污染小。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。