本發(fā)明涉及一種玉米秸稈戊聚糖硫酸酯的制備工藝，屬于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造以及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多糖是廣泛存在于植物、海洋生物、微生物中的天然大分子物質(zhì)，是由單糖之間脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連接而成醛糖或酮糖的鏈狀聚合物，又稱多聚糖。由于單糖殘基的組成不同、糖苷鍵的類型不同、分支點(diǎn)的位置以及數(shù)量的差異，使多糖的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。近年來(lái)，來(lái)源于植物、海洋生物及微生物的多糖及其衍生物的生物活性研究己經(jīng)取得很大的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)很多天然多糖及其衍生物在細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒等方面具有顯著的生物學(xué)活性，是優(yōu)良的廣譜免疫促進(jìn)劑和藥物來(lái)源。

戊聚糖(pentosan)是多糖的一種主要形式，戊聚糖是一種非淀粉多糖，除了含有大量的戊糖聚合物外，還可能含有一定量的己糖、酚類物質(zhì)和雜多糖等。戊聚糖在谷物（如小麥、黑麥、高粱等）中廣泛存在，但含量極少。它是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要成分，大多數(shù)谷物的糊粉層細(xì)胞外薄壁和胚乳層細(xì)胞外薄壁的60%～70%是由戊聚糖構(gòu)成。戊聚糖對(duì)維持植物生命具有極其重要的作用。

玉米秸稈是一種可再生的生物質(zhì)能，我國(guó)的玉米種植面積有3億畝左右，每到秋冬之交，玉米秸稈會(huì)被大量焚燒，會(huì)形成霧霾，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，不僅是資源浪費(fèi)，而且大量焚燒也含有很多不安全因素。玉米秸稈的主要成分有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，戊聚糖是半纖維素多糖的一種。

雖然戊聚糖本身具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，但由于分子量較大，在生物活性方面的應(yīng)用受到諸多限制，故對(duì)戊聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定程度的修飾以改變其活性，進(jìn)而獲得較高活性的戊聚糖衍生物是非常必要的。目前，對(duì)戊聚糖的化學(xué)修飾主要在羥基上進(jìn)行，包括交聯(lián)、羧酸酯化、硫酸酯化、醚化、丙基化、烷基化、季銨化、甲基化、羧甲基化等。其中，硫酸化修飾的戊聚糖因具有多種生物活性而成為戊聚糖衍生物的研究熱點(diǎn)。多硫酸化戊聚糖主要有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血等生物活性。

常用的硫酸酯化方法有氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-二甲基甲酰胺法、吡啶-N-磺酸-二甲亞砜法、三氧化硫復(fù)合物-吡啶法、濃硫酸法等。常用的磺化試劑有氯磺酸、三氧化硫、濃硫酸、二氧化硫和氧氣、硫酰氯及亞硫酸鹽等，但是這些酯化方法采用強(qiáng)酸對(duì)設(shè)備要求高，需要嚴(yán)格無(wú)水操作，并且所得酯化產(chǎn)物硫酸取代度不是很高。

本發(fā)明以玉米秸稈為原料，采用堿式醇沉法提取出戊聚糖并進(jìn)行純化，采用氨基三磺酸鈉水相法合成戊聚糖硫酸酯(pentosanpolysulfate)，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于用廉價(jià)的玉米秸稈為原料合成戊聚糖，然后采用氨基三磺酸鈉水相合成法制備戊聚糖硫酸酯，以提高玉米秸稈戊聚糖的生物活性，以期作為合成抗凝血活性藥物的原料。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

1）采用堿式醇沉法從玉米秸稈中提取戊聚糖，并對(duì)其進(jìn)行純化；

2）對(duì)純化后的戊聚糖進(jìn)行硫酸酯化，酯化粗產(chǎn)品進(jìn)一步純化。

按NaOH溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω為8%~12%）體積（mL）與粉碎的玉米秸稈（經(jīng)60目的標(biāo)準(zhǔn)篩篩選后）質(zhì)量（g）比為25:1~35:1，在60~80℃下，反應(yīng)5~7h。冷卻至室溫，抽濾，濾液加入3倍濾液體積的無(wú)水乙醇，在0℃下沉降8~10h，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇（無(wú)水乙醇體積與反應(yīng)玉米秸稈質(zhì)量比為3:1~5:1）淋洗，濾餅在30℃真空干燥箱中干燥12 h，得戊聚糖粗品。

戊聚糖粗品加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）為5%的NaOH溶液（NaOH體積與反應(yīng)玉米秸稈質(zhì)量比為10:1~15:1）中攪拌溶解，抽濾，向?yàn)V液中滴加HCl（ω為8%~10%）調(diào)節(jié)溶液pH至7，真空濃縮（濃縮液體積與反應(yīng)玉米秸稈質(zhì)量比為3:1~5:1），冷卻后加入3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，沉降8~10h，抽濾得濾餅，濾餅在30℃真空干燥箱中干燥12 h，重復(fù)操作2~4次。采用3500 Da（分子量）的透析袋（預(yù)先在90℃下蒸煮10min）將溶解好的戊聚糖粗品透析72h，透析袋中液體經(jīng)真空濃縮（濃縮液體積與反應(yīng)玉米秸稈質(zhì)量比為3:1~5:1）后冷凍干燥，得戊聚糖產(chǎn)品。

在40~60℃下將戊聚糖緩慢加入到酯化試劑中，戊聚糖質(zhì)量（g）與氨基三磺酸鈉體積（mL）比為1:20~1:30。反應(yīng)4~6h，冷卻至室溫，加入三倍反應(yīng)液體積的無(wú)水乙醇沉降2h，抽濾得濾餅，加蒸餾水溶解，濾餅質(zhì)量（g）與蒸餾水體積（mL）比為1:8~1:10，然后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）為18%HCl（HCl體積與反應(yīng)玉米秸稈質(zhì)量比為1:1~2:1）酸化30min，加入3倍酸化后液體體積的無(wú)水乙醇沉降，抽濾，濾餅即為戊聚糖硫酸酯粗品，再經(jīng)3500 Da（分子量）的透析袋（預(yù)先在90℃下蒸煮10min）將溶解好的戊聚糖粗品透析72h，透析袋中液體經(jīng)真空濃縮后冷凍干燥，得戊聚糖硫酸酯產(chǎn)品。

所述酯化試劑由體積比為3:1~5:1的亞硫酸氫鈉（ω為30%~35%）和亞硝酸鈉（ω為18%~22%）在90℃下水相中反應(yīng)1.5h制得（質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω為15%~20%）的氨基三磺酸鈉溶液。

本發(fā)明采用BaCl₂-明膠法測(cè)戊聚糖硫酸酯的硫酸取代度。取代度DS的計(jì)算公式為： 式中：SO₄%—樣品中硫酸基團(tuán)的百分含量。

有益效果：本發(fā)明經(jīng)兩步反應(yīng)合成目標(biāo)產(chǎn)物戊聚糖硫酸酯，具有操作簡(jiǎn)便，污染小，硫酸化程度高等特點(diǎn)，且原料來(lái)源廣泛，該戊聚糖硫酸酯分子結(jié)構(gòu)與肝素相似，可用作合成抗凝血活性藥物的原料，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1戊聚糖IR圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施2戊聚糖硫酸酯IR圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1戊聚糖¹³C NMR圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2戊聚糖硫酸酯¹³C NMR圖。

具體實(shí)施方式

下面給出實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，但值得指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1. 玉米秸稈戊聚糖的提取

將4g玉米秸稈（經(jīng)60目的標(biāo)準(zhǔn)篩篩選后）加入到120mLNaOH溶液（ω為10%）中，70℃下反應(yīng)6h。抽濾，濾液用HCl（ω為9%）調(diào)PH至7，真空濃縮至80mL，冷卻至室溫，加入240mL無(wú)水乙醇沉降，0℃沉降9h。抽濾，濾餅用20mL無(wú)水乙醇洗滌3次，濾餅于30℃真空干燥箱中干燥12h，得到戊聚糖粗品。

2. 玉米秸稈戊聚糖的純化

（1）重結(jié)晶：將實(shí)施例1中戊聚糖粗品加入到50 mL NaOH溶液（ω為5%）中攪拌溶解，抽濾，向?yàn)V液中滴加HCl（ω為9%）調(diào)節(jié)溶液pH至7，真空濃縮至30 mL，冷卻后加入90mL無(wú)水乙醇，產(chǎn)生大量白色晶體，沉降8h，抽濾得濾餅，共重結(jié)晶三次，濾餅于30℃真空干燥箱中烘干。

（2）透析：將重結(jié)晶后的粗產(chǎn)品用蒸餾水溶解，配成500 mg/mL濃度溶液，放入3500 Da的透析袋（90℃下煮10min）中，透析72h，最后滴加AgNO₃溶液（ω為1%）直到?jīng)]有白色沉淀產(chǎn)生，表明NaCl被完全除去。

（3）凍干：將實(shí)施例1中透析過(guò)的溶液真空濃縮至15mL，進(jìn)行冷凍干燥。

實(shí)施例2：

1.戊聚糖硫酸酯的制備

（1）將40mLNaHSO₃溶液（ω為32.5%）加入到帶有溫度計(jì)和冷凝管的100mL三口燒瓶中，在攪拌下，緩慢滴加10mLNaNO₂溶液（ω為20%），控制滴加速度，20min滴加完畢。在90℃下反應(yīng)1.5h，得到酯化試劑氨基三磺酸鈉溶液（ω為18.7%）。

（2）用NaOH（ω為5%）將步驟（1）所得氨基三磺酸鈉溶液的pH調(diào)至9，加入2g實(shí)施例1戊聚糖，在50℃下反應(yīng)5h。

（3）將步驟（2）所得反應(yīng)液真空濃縮至20mL，加入60mL無(wú)水乙醇，沉降1h，抽濾，并用20mL無(wú)水乙醇反復(fù)淋洗濾餅3次。

（4）將步驟（3）所得濾餅，加入20mL蒸餾水，攪拌溶解，再滴加HCl（ω為18%）5mL進(jìn)行酸化，緩慢滴加，完畢后，繼續(xù)攪拌30min。

（5）在步驟（4）所得溶液中加入60mL無(wú)水乙醇，沉降3h，待沉淀析出后抽濾，加入20mL無(wú)水乙醇反復(fù)淋洗，抽濾，濾餅在30℃真空干燥箱中干燥至恒重，即為玉米秸稈戊聚糖硫酸酯粗品。

2.戊聚糖硫酸酯的純化

（1）透析：將實(shí)施例2中所得戊聚糖硫酸酯粗品用蒸餾水溶解，配成500 mg/mL濃度溶液，放入3500 Da的透析袋（90℃下煮10min）中，透析72h，最后滴加AgNO₃溶液（ω為1%）直到?jīng)]有白色沉淀產(chǎn)生，表明NaCl被完全除去。

（2）凍干：將實(shí)施例2中透析過(guò)的溶液真空濃縮至10mL，進(jìn)行冷凍干燥。得到戊聚糖硫酸酯產(chǎn)品。

用BaCl₂-明膠法測(cè)步實(shí)施例2中所得戊聚糖硫酸酯產(chǎn)品的硫酸取代度，得其硫酸取代度為1.59。

附圖解釋

由圖1可以看出，玉米秸稈提取戊聚糖的紅外光譜圖中，所的產(chǎn)物在3440 cm^-1和1050cm^-1各有一個(gè)相對(duì)強(qiáng)的吸收峰，為多糖羥基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，說(shuō)明用堿式醇沉法提取玉米秸稈中的戊聚糖是成功的。

圖2與圖1紅外光譜圖對(duì)比可以看出，所得產(chǎn)物在805 cm^-1和1251 cm^-1各有一個(gè)相對(duì)強(qiáng)的吸收峰。805cm^-1附近的峰是S-O-C鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，1251cm^-1附近的峰是硫酸基團(tuán)-SO₃-中的S=O伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生，說(shuō)明玉米秸稈戊聚糖上的羥基部分已被硫酸基取代，有硫酸酯化產(chǎn)物生成。

由圖3可以看出，玉米秸稈提取戊聚糖的¹³C NMR圖中，在100ppm左右是C-1的化學(xué)位移，60ppm附近是C-6的化學(xué)位移。60-80ppm是C-2至C-5的化學(xué)位移，說(shuō)明用堿式醇沉法提取玉米秸稈中的戊聚糖是成功的。

圖4與圖3對(duì)比可以看出，經(jīng)過(guò)硫酸酯化之后，C-2和C-3位的化學(xué)位移變的更加復(fù)雜，這是由于它們直接連接上帶有電負(fù)性的硫酸基團(tuán)使其化學(xué)位移變低，然而C-4和C-5由于直接連有硫酸酯基，使其化學(xué)位移變高。除此之外，不完全硫酸化的羥基基團(tuán)也是C-2和C-3的化學(xué)位移發(fā)生變化。所有的化學(xué)位移均表示，已經(jīng)成功合成了戊聚糖硫酸酯。