本發(fā)明屬于食品加工利用及功能性食品制造領域，主要應用色譜方法和化學方法從具有利用價值的或含有生物活性成分的生物材料中提取分離生物活性物質(zhì)或功能性成分，為研究此成分的活性機理或開發(fā)新產(chǎn)品等提供技術支撐。

背景技術：

火龍果(Hylocereus undulates Britt)被譽為“仙人果”、“吉祥果”，是一種營養(yǎng)豐富，老少皆宜的水果，含有多糖、有機酸、膳食纖維及鉀、鈣、鎂、磷等多種營養(yǎng)成分。據(jù)報道，火龍果多糖在促進腸道蠕動、預防便秘等方面具有很好的功能。

功能性多糖的提取分離是開發(fā)功能性食品的關鍵。目前現(xiàn)有的關于多糖的提取制備方法主要是采用凝膠柱色譜、膜分離、離子交換色譜等方法，其局限性是所使用的材料(填料或膜)價格貴、成本高、速度慢，并且每次分離的量有限。因此，現(xiàn)有的多糖分離技術難以滿足火龍果多糖的分離的需要。

目前已有應用逆流色譜分離海帶多糖、香菇多糖、螺旋藻多糖的報道，但根據(jù)報道的逆流色譜分離條件和方法不適用于分離火龍果多糖。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種無污染、快速高效、成本較低的從火龍果中提取制備多糖的方法。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法，包括以下步驟：

(1)將火龍果去皮后切片、冷凍干燥制成含水量≤0.05％的火龍果干片，將火龍果干片粉碎后沸水(100℃)浸提2～3h；

(2)將浸提液冷卻至室溫(10～30℃)后過濾，濾液依次進行濃縮、脫色素、脫蛋白，并再次進行濃縮，得濃縮液；

(3)在濃縮液中加入無水乙醇中進行沉淀，所得的沉淀物進行冷凍干燥，獲得火龍果粗多糖；

(4)取0.25～0.35g火龍果粗多糖溶于25±5ml的雙水相溶劑系統(tǒng)的下相中，并注入(緩慢注入)逆流色譜(例如選用HSCCC-1000型逆流色譜儀)；

所述雙水相溶劑系統(tǒng)由以下質(zhì)量含量的成分組成：4～6％聚乙二醇6000(PEG6000)、16～20％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、7～9％的磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、3～5％的硫酸鉀(K₂SO₄)，以及作為余量的水；

雙水相溶劑系統(tǒng)自然分層，從而形成雙水相溶劑系統(tǒng)的上相、雙水相溶劑系統(tǒng)的下相。

(5)、每500mL的雙水相溶劑系統(tǒng)的上相中分別加入5.0mL 0.05M HCl溶液、5.0mL 0.15M HCl溶液、2.78mL 0.01M NaOH溶液，從而分別作為流動相Ⅰ、流動相Ⅱ、流動相Ⅲ；

分別取300±30mL的流動相Ⅰ、流動相Ⅱ、流動相Ⅲ依次進行洗脫，流動相Ⅰ、流動相Ⅱ、流動相Ⅲ的流速均為3.0±0.2mL/min；

收集每種流動相下相同比移值的洗脫液，將收集的3類洗脫液分別經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥，從而分別獲得3種火龍果多糖。

備注說明：

流動相Ⅰ下收集的相同比移值為0.28；即，收集23～45；

流動相Ⅱ下收集的相同比移值為0.57；即，收集53～77；

流動相Ⅲ下收集的相同比移值為0.85。即，收集111～138管。

冷凍干燥為于-60～-80℃，50～100Pa條件下冷凍干燥120～240min。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的改進：

所述步驟(1)中：粉碎至過200～300目篩，浸提時的液料質(zhì)量比為35～50L/1kg(較佳為38～45L/1kg)；

浸提后所得的殘渣重復上述沸水浸提2～3次，合并所有的浸提液。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的進一步改進：

所述步驟(2)為：將濾液先濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空度0.05Mpa，溫度32～35℃)至原體積的1/10～1/5(較佳為1/6～1/8)，然后加入占濃縮液0.002～0.003重量倍的活性碳均勻混合，靜置3～5h吸附色素，過濾，所得的濾液Ⅱ中加入占濾液Ⅱ0.01倍體積的三氯乙酸進行混合、震蕩5～10分鐘(目的是使蛋白變性析出脫除蛋白)，離心(3000～3500×g)，所得的上清液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮)至為原體積的1/5～1/3；得濃縮液。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的進一步改進：

所述步驟(3)為：在濃縮液中加入2～5體積(較佳為3～5體積倍)的無水乙醇震蕩3～5分鐘，然后于4±1℃醇析24±2h(使火龍果多糖充分析出)，離心(2000～3000×g離心3～5分鐘)，所得的沉淀物冷凍干燥(-50～-80℃干燥2～8h)，得火龍果粗多糖。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的進一步改進：

所述雙水相溶劑系統(tǒng)由以下質(zhì)量含量的成分組成：5％聚乙二醇6000(PEG6000)、18％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、8％的磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、4％的硫酸鉀(K₂SO₄)，65％水。

即，PEG6000:PVP:KH₂PO₄:K₂SO₄:H₂O＝0.5:1.8:0.8:0.4:6.5。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的進一步改進，所述步驟(5)中：

用薄層層析法進行檢測，收集每種流動相下相同比移值的洗脫液；

濃縮至原體積的1/4～1/6；

所述透析為經(jīng)8000～14000Da透析膜透析。

作為本發(fā)明的利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法的進一步改進，步驟(1)的切片為：將果肉切片至厚度3～5mm，冷凍干燥為：于-50～-55℃的溫度、50～100Pa的真空度進行干燥至水分含量≤0.05％(干燥時間約為24h)。

本發(fā)明采用熱水(100℃)浸提植物中醇沉的多糖成分，得到多糖提取液和蛋白的混合液；經(jīng)脫蛋白、色素，凍干，獲得多糖粗品；再采用逆流色譜方法進行分離；以雙水相溶劑系統(tǒng)的下相作為固定相；以雙水相分離系統(tǒng)的上相作為流動相。

在本發(fā)明中，將得到的火龍果多糖用高效液相色譜進行檢測分析，色譜條件為ELSD 2000蒸發(fā)光檢測器，TSK-GEL3000PW_XL液相色譜柱，用H₂O為流動相，流速0.65mL/min。對所收集的樣品進行分析檢測，含量(純度)≥97％。

本發(fā)明具有如下技術優(yōu)勢：本發(fā)明與傳統(tǒng)的膜分離、凝膠柱分離、離子交換分離方法相比，具有分離速度快、成本低、進樣量大的特點，本發(fā)明建立了火龍果多糖分離的逆流色譜雙水相系統(tǒng)和pH梯度分離方法，使逆流色譜能應用于火龍果多糖的分離，擴大了逆流色譜分離多糖的應用范圍，本發(fā)明所得的火龍果多糖具有顯著的潤腸通便作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。

圖2為實施例1的HSCCC分離圖譜。

圖3為實施例1分離所得的火龍果多糖HPLC圖譜。

圖4為實施例2的HSCCC分離圖譜。

圖5為實施例3的HSCCC分離圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1、一種從火龍果中分離制備多糖的方法(利用逆流色譜從火龍果中快速分離多糖的方法)，依次進行以下步驟：

(1)將火龍果去皮取果肉，將果肉切片至厚度3～5mm，于-50～-55℃的溫度、50～100Pa的真空度下進行冷凍干燥，直至制成含水量≤0.05％的火龍果干片(干燥時間約為24h)。

將200g火龍果干片放入攪碎機中粉碎至過200～300目篩，得到火龍果干粉，加入至盛有8.0L蒸餾水的大燒杯內(nèi)，加熱至沸騰，保持100℃，蒸煮浸提3h；

以浸提后所得的殘渣替代火龍果干片重復上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷卻至室溫后過濾，濾液依次進行濃縮、脫色素、脫蛋白，并再次進行濃縮，得濃縮液；

具體如下：

將濾液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空度0.05Mpa，溫度32～35℃)至原體積的1/6，加入占濃縮液0.002重量倍的活性碳混合攪拌5min，靜置3h吸附色素，過濾，所得的濾液Ⅱ中加入占濾液Ⅱ0.01倍體積的三氯乙酸進行混合、震蕩5～10分鐘(目的是使蛋白變性析出脫除蛋白)，離心(3000～3500×g)，所得的上清液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度42℃，真空度100Pa，)至為原體積的1/3；得濃縮液。

(3)在濃縮液中加入3體積倍的無水乙醇震蕩3～5分鐘，然后于4±1℃醇析24h(使火龍果多糖充分析出)，2000～3000×g離心3～5分鐘，所得的沉淀物于-80℃，100Pa條件下冷凍干燥120min，獲得火龍果粗多糖4.51g。

(4)將PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O按照0.5:1.8:0.8:0.4:6.5(w/w)混合，作為雙水相溶劑系統(tǒng)。

雙水相溶劑系統(tǒng)自然分層，從而形成雙水相溶劑系統(tǒng)的上相、雙水相溶劑系統(tǒng)的下相。

取0.35g火龍果粗多糖溶于25ml雙水相溶劑系統(tǒng)的下相中，可采用超聲波儀中輔助溶解10min。啟動逆流色譜儀(HSCCC-1000型逆流色譜儀)，轉(zhuǎn)速800rpm，速度穩(wěn)定后用蠕動泵緩慢注入逆流色譜儀中進行分離。

(5)、每500mL的雙水相溶劑系統(tǒng)的上相中分別加入5.0mL 0.05M HCl溶液、5.0mL 0.15M HCl溶液、2.78mL 0.01M NaOH溶液，從而分別作為流動相Ⅰ(pH值為6.25)、流動相Ⅱ(pH值為4.70)、流動相Ⅲ(pH值為7.90)；

分別取300mL的流動相Ⅰ、流動相Ⅱ、流動相Ⅲ依次進行洗脫，流動相Ⅰ、流動相Ⅱ、流動相Ⅲ的流速均為3.0mL/min，每2min收集1管，共收集150管。

流出液用薄層層析法進行檢測，收集每種流動相下相同比移值的洗脫液，即，收集第24～45管(比移值為0.28)、收集58～77管(比移值為0.57)、收集119～138管(比移值為0.85)；

備注：每2min收集一管；

將收集的3類洗脫液分別濃縮至原體積的1/5，8000～14000Da透析膜透析12h，冷凍干燥(-80℃，100Pa條件下冷凍干燥120min)，分別對應得到3種火龍果均一多糖----0.1033g多糖Ⅰ、0.0847g多糖Ⅱ、0.0763g多糖Ⅲ，即收率分別為29.51％、24.20％、21.80％。收率根據(jù)苯酚-硫酸法進行檢測，其含量均能達到97％以上。

實施例2、一種從火龍果中分離制備多糖的方法，依次進行以下步驟：

(1)、火龍果干片的制備方法同實施例1。

將180g火龍果干片放入攪碎機中粉碎至過200～300目篩，得到火龍果干粉，加入至盛有7.0L蒸餾水的大燒杯內(nèi)，加熱至沸騰，保持100℃，蒸煮浸提2.5h；

以浸提后所得的殘渣替代火龍果干片重復上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷卻至室溫后過濾，濾液依次進行濃縮、脫色素、脫蛋白，并再次進行濃縮，得濃縮液；

具體如下：

將濾液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空度0.05Mpa，溫度32～35℃)至原體積的1/7，加入占濃縮液0.002重量倍的活性碳混合攪拌5min，靜置3h吸附色素，過濾，所得的濾液Ⅱ中加入占濾液Ⅱ0.01倍體積的三氯乙酸進行混合、震蕩5～10分鐘(目的是使蛋白變性析出脫除蛋白)，離心(3000～3500×g)，所得的上清液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度42℃，真空度100Pa)至為原體積的1/3；得濃縮液。

(3)在濃縮液中加入3體積倍的無水乙醇震蕩3～5分鐘，然后于4±1℃醇析24h(使火龍果多糖充分析出)，2000～3000×g離心3～5分鐘，所得的沉淀物于-80℃，100Pa條件下冷凍干燥120min，獲得火龍果粗多糖3.97g。

(4)～(5)、

取0.25g火龍果粗多糖溶于30ml雙水相溶劑系統(tǒng)的下相中，流出液用薄層層析法進行檢測，收集相同比移值的第23～41、53～72、111～131管，其余等同于實施例1的步驟(4)～(5)；

得到3種火龍果均一多糖----多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ，分別為0.0743g、0.0607g、0.0550g(即收率分別為29.72％、24.28％、22.00％)，含量均達到97％以上。

實施例3、一種從火龍果中分離制備多糖的方法，依次進行以下步驟：

(1)、火龍果干片的制備方法同實施例1。

將180g火龍果干片放入攪碎機中粉碎至過200～300目篩，得到火龍果干粉，加入至盛有8.0L蒸餾水的大燒杯內(nèi)，加熱至沸騰，保持100℃，蒸煮浸提3h；

以浸提后所得的殘渣替代火龍果干片重復上述沸水浸提2次，合并所有的浸提液。

(2)合并后的浸提液冷卻至室溫后過濾，濾液依次進行濃縮、脫色素、脫蛋白，并再次進行濃縮，得濃縮液；

具體如下：

將濾液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空度0.05Mpa，溫度32～35℃)至原體積的1/8，加入占濃縮液0.002重量倍的活性碳混合攪拌5min，靜置3h吸附色素，過濾，所得的濾液Ⅱ中加入占濾液Ⅱ0.01倍體積的三氯乙酸進行混合、震蕩5～10分鐘(目的是使蛋白變性析出脫除蛋白)，離心(3000～3500×g)，所得的上清液濃縮(用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度42℃，真空度50Pa，)至為原體積的1/5。

(3)在濃縮液中加入5體積倍的無水乙醇震蕩3～5分鐘，然后于4±1℃醇析24h(使火龍果多糖充分析出)，2000～3000×g離心3～5分鐘，所得的沉淀物于-80℃，100Pa條件下冷凍干燥120min，獲得火龍果粗多糖4.09g。

(4)～(5)、

取0.30g火龍果粗多糖溶于25mL雙水相溶劑系統(tǒng)的下相中，將流出液用薄層層析法進行檢測，收集相同比移值的第23～44、57～75、116～137管，其余等同于實施例1的步驟(4)～(5)；

得到3種火龍果均一多糖----多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ，分別為0.0886g、0.0730g、0.0647g(即，收率分別為29.53％、24.33％、21.57％)，含量均達到98％以上。

性能實驗：

為了檢驗火龍果多糖的通便作用，設計了3種火龍果多糖(多糖Ⅰ、多糖Ⅱ、多糖Ⅲ)分別為對便秘模型小鼠通便作用的實驗。將雄性昆明小鼠隨機分為空白組、陽性對照組和3個火龍果多糖給藥組、黑木耳多糖給藥組，每組12只。給藥組經(jīng)口分別給予0.50g/kg bw的火龍果多糖I、II、III、黑木耳多糖；空白組和模型組給予20mL/kg bw的蒸餾水；陽性對照組給予0.50g/kg bw的麻仁丸。連續(xù)灌胃8d后，觀察各組小鼠的首次排黑便時間、5h內(nèi)排便粒數(shù)和測定糞便含水量。所得結(jié)果具體如下：

3種火龍果多糖對小鼠排便指標的影響

結(jié)果表明火龍果多糖能顯著縮短首次排黑便時間、增加5h內(nèi)排便粒數(shù)和提高糞便含水量，3種火龍果多糖具有顯著的潤腸通便作用，多糖II效果最佳。

對比例1-1、將實施例1中的雙水相溶劑系統(tǒng)改成PEG6000–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(2.3:0.8:0.4:6.5，w/w)；其余等同于實施例1，則所配溶劑由于不能形成上下兩相，不能作為逆流色譜的溶劑系統(tǒng)，所以不適用于分離火龍果多糖。

對比例1-2、將實施例1中的雙水相溶劑系統(tǒng)改成PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(0.8:1.5:0.8:0.4:6.5，w/w)；其余等同于實施例1，產(chǎn)生的流動相對火龍果多糖的溶解度不夠，不能有效分離火龍果多糖。

對比例1-3、將實施例1中的雙水相溶劑系統(tǒng)改成PEG6000–PVP–KH₂PO₄–K₂SO₄–H₂O(0.2:2.1:0.8:0.4:6.5，w/w)，其余等同于實施例1，則所配溶劑由于不能形成上下兩相，不能作為逆流色譜的溶劑系統(tǒng)，所以不適用于分離火龍果多糖。

對比例2-1、將實施例1作如下更改：

每500mL上相中分別加入2.5mL 0.05M HCl溶液、2.5mL 0.15M HCl溶液、1.39mL 0.01M NaOH溶液，從而分別作為流動相Ⅰ(pH值為6.55)、流動相Ⅱ(pH值為5.70)、流動相Ⅲ(pH值為7.30)；其余等同于實施例1。所得結(jié)果表明：此時流動相不能有效分離3種火龍果多糖，收集得到的3種多糖依然是混合物。

對比例2-2、將實施例1作如下更改：

每500mL上相中分別加入10mL 0.05M HCl溶液、10mL 0.15M HCl溶液、5.56mL 0.01M NaOH溶液，從而分別作為流動相Ⅰ(pH值為5.25)、流動相Ⅱ(pH值為3.60)、流動相Ⅲ(pH值為9.15)；其余等同于實施例1。

所得結(jié)果表明只有多糖I能夠少許分離，得率3.61％，其余2種多糖無法實現(xiàn)分離。

對比例3-1、將實施例1中的雙水相溶劑系統(tǒng)改成已有報道的PEG6000-(NH₄)₂SO₄-H₂O(2.0:0.8:7.2，w/w)，其余等同于實施例1，結(jié)果表明此雙水相系統(tǒng)不能使火龍果多糖實現(xiàn)分離。

對比例3-2、將實施例1中的雙水相溶劑系統(tǒng)改成已有報道的PEG1000–K₂HPO₄–KH₂PO₄–H₂O(0.5:1.25:1.25:7.0,w/w)，其余等同于實施例1，結(jié)果表明此雙水相系統(tǒng)不能使火龍果多糖實現(xiàn)分離。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。